Validation préliminaire des coordonnées d’injection stéréotaxique par cryosectionnement

Résumé

Le présent protocole décrit une stratégie pratique pour accélérer l’étape de vérification des coordonnées d’injection stéréotaxique avant d’effectuer le traçage viral à l’aide de colorants et de coupes congelées.

Résumé

L’injection stéréotaxique d’une région cérébrale spécifique constitue une technique expérimentale fondamentale en neurosciences fondamentales. Les chercheurs basent généralement leur choix de paramètres d’injection stéréotaxiques sur des atlas de cerveau de souris ou des documents publiés qui utilisaient différentes populations/âges de souris et différents équipements stéréotaxiques, ce qui nécessite une validation plus poussée des paramètres de coordonnées stéréotaxiques. L’efficacité de l’imagerie calcique, de la chimiogénétique et des manipulations optogénétiques repose sur l’expression précise des gènes rapporteurs dans la région d’intérêt, nécessitant souvent plusieurs semaines d’efforts. Ainsi, c’est une tâche qui prend du temps si les coordonnées de la région cérébrale cible ne sont pas vérifiées à l’avance. En utilisant un colorant approprié au lieu d’un virus et en mettant en œuvre la cryosection, les chercheurs peuvent observer le site d’injection immédiatement après l’administration du colorant. Cela facilite l’ajustement en temps opportun des paramètres de coordination dans les cas où il existe des écarts entre le site d’injection réel et la position théorique. De tels ajustements améliorent considérablement la précision de l’expression virale dans la région cible lors d’expériences ultérieures.

Introduction

Presque tous les outils modernes de neuromodulation, y compris l’enregistrement du calcium in vivo, les outils optogénétiques et chimiogénétiques, nécessitent l’utilisation de coordonnées stéréotaxiques pour cibler la zone cérébrale d’intérêt ^1,2,3, formant la base de la manipulation neuronale. Les coordonnées stéréotaxiques des régions cérébrales de la souris sont définies par rapport à bregma et lambda, les points de repère osseux sur le crâne, formant le système de coordonnées stéréotaxiques dérivé du crâne. Bregma ou lambda peut servir de point zéro des coordonnées tridimensionnelles. Les trois axes sont antéropostérieur (AP), médiolatéral (ML) et dorso-ventral (DV), représentant les axes y, x et z sur l’affichage numérique des instruments stéréotaxiques. Pour les régions cérébrales bien connues, les paramètres de coordonnées stéréotaxiques d’une zone spécifique peuvent être obtenus à partir des atlas du cerveau de souris⁴ (par exemple, Paxinos et le cerveau de souris de Franklin en coordonnées stéréotaxiques) et/ou de la littérature publiée ^5,6. Cependant, une validation supplémentaire est nécessaire en raison des variations dans l’équipement stéréotaxique et de l’âge/des populations de souris utilisées par différents chercheurs.

La structure est la base de la fonction. Les circuits neuronaux constituent la base de nombreuses fonctions cérébrales, telles que les activités cognitives, les émotions, la mémoire, les fonctions sensorielles et motrices¹. L’étiquetage de la structure et la manipulation de l’activité des circuits neuronaux sont essentiels pour comprendre la fonction d’un circuit neuronal spécifique. Au cours des dernières décennies, les traceurs neuronaux ont évolué à travers de nombreuses générations. les premières recherches ont adopté l’agglutinine de germe de blé (WGA) et l’agglutinine de Phaseolus vulgaris (PHA) comme traceurs antérogrades, et l’or fluoré (FG), la sous-unité B de la toxine du choléra (CTB), la carbocyanine comme traceurs rétrogrades. Cependant, contrairement aux traceurs viraux, ces traceurs neuronaux traditionnels ne peuvent pas intégrer de gènes exogènes dans l’hôte, ni n’ont de sélectivité de type cellulaire. De nos jours, la stratégie virale est devenue une proposition importante dans la recherche fondamentale en neurosciences. À différentes fins de recherche, divers outils viraux peuvent être sélectionnés ^7,8. Il existe des virus non transsynaptiques, des virus trans-multisynaptiques (rétrogrades et antérogrades) et des virus trans-monosynaptiques (rétrogrades et antérogrades). Chaque catégorie contient plusieurs types avec des caractéristiques respectives.

Le processus d’administration et d’expression virale est très chronophage et gourmand en ressources, prenant souvent des semaines, voire plus. Parmi divers vecteurs viraux, le virus adéno-associé a été identifié comme un moyen prometteur pour l’administration de gènes, offrant une large fenêtre allant de 3 à 8 semaines après l’injection pour la procédure expérimentale ^7,8. Au fur et à mesure de l’évolution de l’AAV, l’analyse peut être effectuée 2 à 3 semaines après l’administration ^9,10. D’autres traceurs des circuits neuronaux, tels que le virus de la pseudorage (PRV) et le virus de la rage (VR), nécessitent également une période de traçage d’au moins 2 à 7 jours 11,12,13,14,15. Ainsi, une vérification préliminaire du site d’injection avant d’observer les signaux de fluorescence est à la fois rapide et rentable.

Pour faciliter une vérification simple et rapide des injections stéréotaxiques, dans cette étude, un colorant est administré avant les vecteurs viraux, et la cryosection permet aux chercheurs d’observer le site d’injection et de le suivre dans les 30 minutes suivant l’injection.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives ARRIVE (Animal Research Reporting In Vivo Experiences) et au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La présente étude a été approuvée par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’hôpital Renji de la faculté de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai. Des souris mâles C57BL/6J âgées de huit semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus dans le commerce (voir la table des matières) et logés dans des cages standard (22 °C ± 2 °C, cycle lumière/obscurité 12 h/12 h, nourriture et eau à volonté).

1. Sélection des régions cérébrales cibles

REMARQUE : Il s’agit d’une procédure stérile. Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés. Vaporisez les gants avec de l’alcool avant tout contact avec les instruments chirurgicaux. Évitez de toucher la pointe des instruments ou la zone chirurgicale avec des gants. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée avant de commencer l’intervention en vérifiant s’il n’y a pas de perte de réflexes de redressement et d’absence de réponse à la stimulation cutanée. Avant le forage et l’injection, surveillez de près la fréquence respiratoire (60 à 220 respirations par minute, moyenne de 100 à 150 respirations par minute) et l’amplitude respiratoire (qui doit être constante et ne doit pas être excessivement superficielle ou profonde). Tout changement significatif de la fréquence respiratoire ou de l’amplitude doit être noté.

1. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 1,25 % de tribromoéthanol (250 mg/kg) à l’aide d’une aiguille de 29 G. Rasez les poils du crâne une fois que le réflexe de redressement disparaît. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) en fixant les incisives supérieures avec une pince nasale et en stabilisant la tête à l’aide de deux barres d’oreille.
2. Appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse oculaire. Désinfectez le cuir chevelu en l’écouvillonnant trois fois avec de l’Anerdian (solution désinfectante ; voir tableau des matériaux). Injecter 0,2 mL de lidocaïne à 1 % par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille à insuline de 29 G pour fournir une analgésie locale.
3. Faites une incision de 0,5 cm à l’aide de ciseaux pour les yeux pour exposer le crâne. Utilisez un coton-tige trempé dans 3%_{H 2}O₂ pour frotter le crâne exposé afin d’enlever le périoste. Laissez sécher le crâne.
4. Fixez la perceuse à l’instrument stéréotaxique. Ajustez les boutons des bras stéréotaxiques pour positionner la pointe de forage avec précision sur le bregma à l’aide d’une loupe et enregistrez la valeur de l’axe z à l’aide de l’écran numérique LCD.
   1. Ajustez les boutons et positionnez la pointe de forage sur la lambda et enregistrez la valeur de l’axe z. Ajustez le pince-nez et les barres d’oreille pour rapprocher deux valeurs z, et répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que la différence entre les deux valeurs z soit inférieure à 0,1 mm.
      REMARQUE : les axes x, y et z sur l’écran numérique LCD correspondent respectivement à médiolatéral (ML), antéropostérieur (AP) et dorso-ventral (DV). Le bregma et le lambda peuvent être considérés comme étant sur le même plan horizontal une fois que la différence entre les deux valeurs z est inférieure à 0,1 mm.
5. Assurer la nivellement gauche-droite du cerveau. Ajustez les barres d’oreille fixées au cadre stéréotaxique avec la même échelle. Prenons l’exemple du noyau tegmental latéro-dorsal, partie ventrale (LDTgV) ; ses coordonnées stéréotaxiques sont -5,2 pour x, +0,8 pour y, -4,0 pour z, selon Paxinos et l’atlas du cerveau de souris de Franklin¹⁶.
   1. Ajustez la barre d’oreille pour effectuer la perceuse à (-5,2, +0,8) pour mesurer la valeur z dans la direction dorsale-ventrale et déplacez la perceuse à (-5,2, -0,8) pour mesurer la valeur z.
      REMARQUE : La gauche-droite est considérée comme étant au même niveau lorsque la différence entre les deux valeurs z est inférieure à 0,2 mm. Les barres auriculaires doivent être insérées au bon endroit car le méat auditif externe est symétrique. Si la différence entre les deux valeurs z est supérieure à 0,5 mm, la barre d’oreille peut être insérée au mauvais endroit.
6. Positionnez à nouveau la perceuse sur le bregma et réglez trois coordonnées sur l’écran numérique LCD sur zéro. Positionnez la perceuse au-dessus de la région d’intérêt à l’aide des coordonnées de référence. Démarrez l’exercice.
   1. Abaissez progressivement la perceuse à l’aide du bras vertical jusqu’à ce qu’elle pénètre dans le crâne. Enlevez les débris et le sang à l’aide de cotons-tiges.
      REMARQUE : Veillez à ne pas endommager les tissus cérébraux.

2. Préparation de la solution de colorant et micro-injection cérébrale

1. Prélever 25 μL de tampon de chargement SDS-PAGE contenant du bleu de bromophénol (voir le tableau des matériaux) dans un tube de microcentrifugation de 200 μL. Ajouter 50 μL de ddH₂O dans le tube pour préparer la solution de colorant.
2. Couvrez la fenêtre crânienne avec un coton imbibé d’une solution saline. Assurez-vous de la perméabilité de la microseringue en aspirant et en expulsant de la solution saline à plusieurs reprises. Chargez 0,3 μL de colorant dans la micro-seringue. Fixez la seringue et le micro-injecteur stéréotaxique motorisé au bras stéréotaxique.
3. Positionnez l’embout de la seringue sur le bregma et réglez les coordonnées à zéro sur l’affichage numérique LCD. Ajustez l’aiguille dans la région d’intérêt en fonction des coordonnées de référence. Réglez la vitesse d’injection à 0,1 μL/min et démarrez le micro-injecteur motorisé, délivrant 0,3 μL de colorant bleu dans la région cible. Laissez la seringue en position pendant au moins 10 minutes avant de retirer lentement l’injecteur.
   REMARQUE : Des colorants de couleur différente peuvent être utilisés chez les mêmes souris pour distinguer les régions proches. Testez d’autres colorants pour des concentrations appropriées en fonction de leurs propriétés physiques. Il est recommandé d’utiliser la formule au bleu de bromophénol et de rincer abondamment la seringue avant et après utilisation pour éviter les blocages. Ajustez les volumes d’injection en fonction de la diffusion du colorant.

3. Prélèvement de tissu cérébral et cryosectionnement

1. Relâchez la souris du cadre stéréotaxique. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 50 mg/kg de pentobarbital sodique à l’aide d’une aiguille de 29 G. Fixez la souris sur une planche de mousse avec du ruban adhésif.
2. Ouvrez les deux côtés du thorax pour provoquer une suffocation rapide. Faites une incision de 1 à 2 mm dans l’appendice auriculaire droit. Insérez une aiguille de perfusion dans le ventricule gauche. Infuser 20 mL de solution saline prérefroidie et 20 mL de solution glacée de paraformaldéhyde à 4 %.
3. Décapitez la souris avec des ciseaux de dissection de tissus (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). Retirez la peau en faisant une incision le long de la ligne médiane du cou au nez, puis exposez le crâne. Dégagez les muscles résiduels du crâne à l’aide d’une pince ou de ciseaux.
4. Placez la pointe d’une lame des ciseaux fins entre le foramen magnum et le cerveau, le bord tranchant face à l’os, à l’extrémité rostrale de la suture mi-sagittale. Procédez à la glissade et coupez le crâne le long de la suture mi-sagittale. Utilisez des pinces pour retirer le crâne, révélant ainsi le cerveau exposé.
   REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de causer des dommages au cerveau pendant l’opération. Avant de retirer les éclats d’os, retirez soigneusement toutes les méninges qui pourraient être attachées au crâne. Cette précaution est cruciale pour éviter de trancher par inadvertance le tissu cérébral pendant le processus.
5. Mettez le cryostat du microtome rotatif sous tension (voir tableau des matériaux) et réglez la température de la chambre à -20 °C. Versez un peu de composé OCT pour couvrir uniformément la surface du disque de l’échantillon. Placez-le dans la chambre cryogénique et laissez l’OCT se solidifier.
6. Fixez le disque à la tête de l’échantillon. Rapprochez la lame du bloc et coupez le bloc OCT pour former un plan plat parallèle au disque.
7. Coupez le cerveau dans une direction coronale à l’opposé du site d’injection dans un moule à tranches de cerveau à l’aide d’une lame de rasage. Placez le tissu cérébral contenant le site d’injection avec le côté coupé vers le bas sur le plan plat OCT.
   1. Versez l’OCT sur le cerveau et placez le disque dans la chambre cryogénique, ce qui permet au bloc d’échantillon de se solidifier. Versez l’OCT à plusieurs reprises sur le cerveau jusqu’à ce que le cerveau soit complètement intégré à l’OCT.
      REMARQUE : Ajoutez le composé OCT couche par couche. Une fois que la couche précédente d’OCT est congelée, versez la couche suivante de composé OCT sur le cerveau.
8. Coupez le bloc d’échantillon jusqu’à ce que la région cible s’approche. Faites plusieurs sections à partir du point d’injection. Collectez les tranches de cerveau coronal dans une plaque à 6 puits contenant du PBS à température ambiante à l’aide d’un petit pinceau d’écriture maintenu à -20 °C.
   REMARQUE : Réglez l’épaisseur de coupe sur une épaisseur plus grande pour couper le bloc, puis réglez l’épaisseur de coupe sur 40 μm lorsque la lame s’approche du site d’injection. Si des traceurs de circuits neuronaux sont utilisés, les souris ne sont pas sacrifiées immédiatement. Placez la souris dans une cage de récupération postopératoire stérile sur une couverture chauffante pour la récupération de l’anesthésie. Remettez les souris dans la cage d’origine ou dans une nouvelle cage une fois réveillées.

4. Imagerie

1. Lavez l’OCT avec du PBS à température ambiante. À l’aide d’un pinceau, prélevez des sections cérébrales et placez-les sur une diapositive. Laissez les sections sécher à l’air libre à température ambiante.
2. Observez visuellement la région injectée ou utilisez un microscope lorsque les noyaux cibles sont minuscules. Comparez l’emplacement du colorant injecté avec la région correspondante dans l’atlas cérébral.
   REMARQUE : Ajustez les valeurs des axes x, y et z en fonction de la direction et de la distance de l’écart du point d’injection. Il peut être nécessaire de répéter plusieurs fois toutes les étapes de ce protocole pour déterminer les coordonnées avec précision.

Résultats

Cette étude a permis d’identifier le site d’injection en 30 minutes en utilisant la méthode démontrée. Initialement, une solution de chargement d’échantillon SDS-PAGE contenant du bleu de bromophénol a été injectée dans le LDTgV chez les souris C57/BL. La figure 1A montre une représentation schématique de l’injection de la solution de colorant. La distribution du colorant bleu dans le LDTgV est illustrée à la figure 1B.

Le bleu de bromophénol a également été injecté dans le cortex prélimbique mPFC, le cortex infralimbique mPFC et l’amygdale basomédiale (BMA) pour évaluer l’universalité de ce protocole. Comme le montrent les figures 1C-E et 2A, le colorant bleu a été distribué dans le cortex prélimbique mPFC, le cortex infralimbique mPFC et le BMA.

De plus, un virus adéno-associé porteur d’une protéine mCherry fluorescente a été injecté dans le LDTgV (les coordonnées ont été vérifiées à l’aide de la solution de colorant). L’expression du virus a pris quatre semaines. La distribution des neurones mCherry+ dans le LDTgV est illustrée à la figure 2B.

Figure 1 : Injection d’une solution de colorant. (A) Schéma de l’injection de la solution de colorant. (B) Distribution du colorant bleu dans le LDTgV. (C) Distribution du colorant bleu dans le cortex prélimbique mPFC. (D) Distribution du colorant bleu dans le cortex infralimbique mPFC. (E) Distribution du colorant bleu dans la BMA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Distribution du colorant bleu et distribution du mCherry observées au microscope. (A) Distribution du colorant bleu dans le cortex prélimbique du mPFC (grossissement 10x, barre d’échelle = 500 μm). (B) Image représentative de la distribution de mCherry dans la région LDTgV acquise par microscopie fluorescente (grossissement 10x, barre d’échelle = 500 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cet article a décrit une stratégie stable pour vérifier la précision des injections cérébrales stéréotaxiques ^5,6 plus rapidement et simplement avant le traçage viral, mais l’aspect irremplaçable de l’expression du gène rapporteur dans la région du cerveau est crucial pour le marquage de la région du cerveau. Le colorant bleu que nous avons utilisé a permis de visualiser immédiatement le site d’injection.

Plusieurs étapes critiques de ce protocole contribuent à améliorer la précision du site d’injection. Tout d’abord, assurer la nivellement gauche-droite du cerveau dans l’instrument stéréotaxique à partir de l’étape 1.5 ; Cette étape nécessite que les opérateurs soient familiarisés avec l’anatomie du crâne, en s’assurant que les barres d’oreille sont placées dans la bonne position. Les échelles sur les barres d’oreille et le cadre stéréotaxique servent également de références. Deuxièmement, trouver le point zéro exact, le bregma, à l’étape 1.6 et à l’étape 2.3. Parfois, une divergence significative dans les coordonnées trouvées aux étapes 1.6 et 2.3 est due à une différence considérable dans le positionnement du point zéro. Cela peut empêcher l’aiguille du micro-injecteur de pénétrer dans la fenêtre crânienne. Dans ce cas, il est nécessaire de repositionner le point zéro et si nécessaire, de créer une nouvelle fenêtre crânienne. Malgré cela, il est toujours essentiel de rétablir le point zéro et de retrouver les coordonnées à l’étape 2.3 ; On ne peut pas insérer directement la micro-seringue à partir de la fenêtre crânienne précédemment fabriquée.

Par rapport à la découpe d’un cerveau non congelé dans un moule de tranche de cerveau de souris, cette stratégie fournit un résultat plus précis car le bloc d’échantillon solide empêche la lame de comprimer le cerveau et de provoquer le déplacement du colorant des points d’injection. De plus, les sections cérébrales coupées par un moule de tranche de cerveau sont relativement plus épaisses et ne permettent pas de localiser les petits noyaux cérébraux. Cependant, par rapport au processus standard de cryosection du tissu cérébral 11,12,13,14,15, nous avons raccourci la durée du traitement d’au moins 72 h en sautant les étapes de déshydratation, ce qui a rendu les sections cérébrales plus fragiles et plus difficiles à saisir sur une lame de verre, ce qui représente une faiblesse majeure de ce protocole.

Lors de la fabrication des fenêtres crâniennes pour l’injection de colorant, le fait de fixer fermement la perceuse dentaire au bras stéréotaxique, plutôt que de la tenir à la main, facilite le contrôle de la profondeur de forage à l’aide du bouton de réglage fin, réduisant ainsi la possibilité d’endommager le tissu cérébral.

En conclusion, cette étude a fourni une méthode prometteuse pour vérifier préliminairement les coordonnées stéréotaxiques exactes avant le traçage viral, ce qui rend le processus ultérieur de marquage et de traçage des neurones plus fiable.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,0 et micro ; L, seringue Neuros, modèle 7001 KH, 32 G, point Style 3	Hamilton	65458-01
200 &mu ; L pointes de pipette	biosharp	BS-200-T
Seringue de 20 mL	Groupe Kindly 3
%H2O2 solution	Lircon Company
Plaque à 6 puits	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Plaque anti-roulis	Leica	14047742497
BD insuline seringue	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend pince à dissection dentée	Jinzhong	JD1050
Logiciel de dimension	Cellsens Olympus
Coton-tige	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Foret	Longxiang
Pinceaux fins	HWAHONG
Ciseaux fins	Jinzhong	y00030
Microscopie à fluorescence	Olympus	BX63
microtome de congélation	Leica	CM1950
Pince hémostatique droite avec dent	Jinzhong	J31010
Aiguille à perfusion 0,7 mm
Injection de chlorhydrate de lidocaïne	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Loupe	M& G Chenguang Papeterie
Souris mâles C57/BL	L’Institut de recherche sur la planification familiale de Shanghai&ndash ; BK Laboratoire
Souris Moule de tranche de cerveau coronal	RWD Life Science	68713
Tube de microcentrifugation	biosharp	BS-02-P
Lames de microtome	Leica	819
Pommade ophtalmique	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldéhyde	Biosharp	BL539A
Pompes péristaltiques	Harvard Apparatus	70-4507
Saline tamponnée au phosphate	Servicebio	G4202
Piette 2-200 &mu ; L	thermofisher	4642080
Chargement d’échantillons SDS-PAGE contenant du bleu de bromophénol	Beyotime	P0015A
Lames de	rasage BFYING	91560618
Lames	Citotest Scientific	188105
Appareil stéréotaxique	RWD Life Science	68807
Pince à dissection à dents droites	Jinzhong	JD1060
Porte-seringue	RWD Life Science	68206
Ciseaux à tissus	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T composé	Sakura	4583
Tribromoéthanol	Aibei Biotechnology	M2910