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Article de méthode

Conditionnement de peur modifié pour induire des comportements de fuite chez la souris

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DOI :

10.3791/66266

⸱

15 décembre 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

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Résumé

Pour étudier les comportements de vol dans un contexte de peur, nous introduisons un protocole de conditionnement de peur modifié. Ce protocole garantit que les souris présentent systématiquement des comportements de vol lors de la présentation des signaux dans le conditionnement de la peur.

Résumé

La manifestation appropriée d’un comportement défensif dans une situation menaçante est essentielle à la survie. La théorie dominante suggère qu’un comportement défensif actif, tel que sauter ou s’élancer rapidement, s’exprime sous une menace élevée ou une menace réelle, tandis qu’un comportement défensif passif, tel que le gel, est exprimé lorsque la menace est prédite, mais que l’imminence de la menace est relativement faible. Dans le conditionnement classique de la peur, les sujets présentent généralement le gel comme une réponse défensive conditionnée, avec peu d’expression de comportement défensif actif dans la plupart des cas. Ici, nous introduisons une procédure modifiée de conditionnement de la peur pour que les souris observent la transition du gel au vol et vice versa, impliquant cinq appariements répétitifs de stimuli conditionnés (CS ; tonalité continue, 8 kHz, 95 dB SPL (niveaux de pression acoustique)) et de stimuli non conditionnés (US ; choc du pied, 0,9 mA, 1,0 s) sur deux jours. Cette procédure modifiée de conditionnement de la peur nécessite un nombre relativement important de séances de conditionnement et de jours de conditionnement, mais ne nécessite pas de choc du pied de haute intensité pour une expression modeste du comportement de vol. L’utilisation du même contexte pour le conditionnement et les présentations CS saillantes est essentielle pour susciter des comportements de vol. Cette procédure de conditionnement de la peur modifiée est une méthode fiable pour observer les comportements défensifs actifs chez la souris, offrant l’occasion d’élucider les mécanismes fins et les caractéristiques de ces comportements dans un contexte craintif.

Introduction

La sélection appropriée des comportements défensifs dans des circonstances menaçantes est cruciale pour la survie de tous les animaux. Les comportements défensifs passent progressivement de l’un à l’autre en fonction de la proximité de la menace, comme la transition entre les comportements de gel et de fuite 1,2,3. La dérégulation de ces comportements est souvent observée dans divers troubles mentaux4. Le trouble de stress post-traumatique (SSPT) est l’un de ces troubles caractérisés par des comportements défensifs exagérés, comme des réponses de panique à des stimuli non menaçants4.

Le conditionnement classique de la peur chez les rongeurs est couramment utilisé comme modèle pour le SSPT 5,6,7, mais les rongeurs n’expriment pas de comportements de fuite (de panique) dans ce modèle8. Par conséquent, le modèle classique de conditionnement de la peur, souvent appelé « modèle de SSPT chez les rongeurs », manque de validité apparente pour le SSPT chez l’homme, en particulier pour capturer les symptômes de fuite ou de panique, qui n’ont pas été bien étudiés.

Récemment, plusieurs protocoles modifiés de conditionnement de la peur ont démontré avec succès que les sujets rongeurs présentent un comportement de vol pendant ces procédures. Par exemple, les associations répétitives d’un stimulus conditionné (CS) et d’un stimulus inconditionné (US) sept fois par jour ont permis aux rats femelles de présenter des comportements de dardage similaires aux comportements de vol9. Dans des conditionnements de peur de deux jours utilisant des stimuli composés en série (SCS ; composé de tonalité suivie de bruit), les souris ont commencé à montrer des comportements de vol pendant la partie bruit des présentations SCS 10,11,12. La description détaillée de la méthode SCS est fournie dans un rapport de protocole13. Un conditionnement de peur de trois jours avec SCS a également fonctionné chez les rats pour induire des comportements de fuite14. Cependant, ces nouveaux protocoles ont certaines limites. Par exemple, l’utilisation de la présentation d’indices en série ne permet pas d’exclure l’influence de l’estimation de la proximité sur le comportement défensif. Dans le cas d’une association sept fois plus importante de CS-US chez le rat, la majorité des réponses de fuite ont été observées chez les femelles plutôt que chez les mâles.

À la lumière de ces considérations, nous introduisons un protocole modifié de conditionnement de la peur pour les souris afin d’étudier les comportements de vol dans un contexte de peur. Les souris mâles présentent systématiquement un comportement de vol pendant notre conditionnement de peur modifié. Dans ce protocole, le ton saillant est utilisé comme CS au lieu de SCS. De plus, un minimum de cinq paires de CS-US en une journée pendant au moins deux jours, ainsi qu’une potentialisation de la peur par le contexte conditionné, est nécessaire. Le protocole offre une autre option pour étudier les comportements de vol, en complément des protocoles précédents, en fonction de l’objectif de la recherche.

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Protocole

Ce protocole a été mené conformément aux principes directeurs de la Société de physiologie du Japon et a reçu l’approbation du Comité de protection des animaux de l’Université médicale de Kanazawa (2021-32). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives ARRIVE. Des souris C57BL/6J mâles adultes (âgées de 3 à 6 mois) ont été utilisées pour l’étude, et il a été précédemment confirmé que ces souris présentaient les comportements de vol décrits dans ce manuscrit15.

1. Préparation des animaux

  1. Souris domestiques de groupe (3-4 par cage ; maintenue à 23-27 °C ; sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures ; accès ad libitum à la nourriture et à l’eau) jusqu’au début des expériences.
  2. Hébergez individuellement chaque souris dans une cage en plexiglas (14 cm × 21 cm × 12 cm) pendant au moins 3 jours avant de subir ce conditionnement de peur modifié.

2. Mise en place des outils/équipements

  1. Boîte de conditionnement de la peur (Figure 1A)
    1. Utilisez une chambre de conditionnement de la peur (25 cm × 25 cm × 25 cm) enfermée dans une boîte insonorisée (67 cm × 53 cm × 55 cm) (voir la table des matières).
    2. Deux contextes (A et B) sont requis. Pour le contexte A, créez des bandes noires et blanches sur les murs en attachant du carton plastique blanc avec des rubans noirs (3 cm de largeur, 4 sur une planche). Utilisez un panneau en plastique lisse blanc pour le sol.
    3. Essuyez les murs et le sol avec de l’Heptanol (1%) avant chaque séance.
      REMARQUE : Aucun système de ventilation actif n’est utilisé. Le nettoyage à l’alcool à la fin de la séance diminue l’odeur d’heptanol.
    4. Pour le contexte B, rendez l’apparence des murs entièrement noire en enlevant la planche utilisée dans le contexte A. Le sol est un sol en grille.
      REMARQUE : Aucune odeur spécifique n’est présentée autre qu’une légère odeur d’alcool pour le nettoyage.
    5. Éclairer la boîte expérimentale à l’aide d’une diode électroluminescente blanche (DEL, 240 lux) (voir tableau des matériaux).
  2. Shocker
    1. Connectez un amortisseur de brouillage (voir Tableau des matériaux) à un plancher grillagé composé de tiges en acier inoxydable. Ceci est utilisé pour fournir des chocs au pied. L’intensité du choc du pied a été fixée à 0,9 mA en suivant les méthodes courantes de conditionnement de la peur 10,11,12,13.
  3. Générateur audio
    1. Placez un haut-parleur (voir Tableau des matériaux) au plafond. Tous les stimuli acoustiques sont amplifiés.
    2. Modifiez et calibrez numériquement les amplitudes globales de chaque stimulus pour obtenir des niveaux de pression acoustique (SPL, re : 20 μ Pa) à l’avant de 5 cm de l’enceinte avec un microphone de 1/4 de pouce. Présentez une tonalité continue éclater à travers ce haut-parleur.
      REMARQUE : Le calibrage du haut-parleur sonore est crucial pour examiner l’impact fin du stimulus sonore sur les comportements défensifs pendant ce conditionnement de peur modifié.
  4. Transducteur
    1. Placez le sol de la chambre d’essai sur un transducteur (voir Tableau des matériaux) pour la détection des vibrations. Le signal du transducteur est transmis à une carte son avec une fréquence d’échantillonnage de 8 kHz pour enregistrer les vibrations comportementales.
  5. Caméra vidéo
    1. Placez une caméra CMOS (voir Tableau des matériaux) au plafond pour suivre les mouvements du sujet et enregistrer le son dans la boîte de conditionnement.
  6. Système de déclenchement
    1. Utilisez un logiciel de sonorisation (voir Tableau des matériaux) pour déclencher des tonalités ou des chocs de pied à des moments programmés.
      REMARQUE : N’importe quel stimulateur disponible dans le commerce fonctionnera pour cela.

3. Expérience comportementale

  1. Prévoyez quatre jours de procédures de conditionnement de la peur : habituation (1 jour, 5 essais), conditionnement (2 jours, 5 essais chacun) et séances de test/extinction (1 jour, 5 ou 15 essais). Les intervalles entre les essais variaient entre 60 et 75 s (figure 1B).
    REMARQUE : De préférence, incluez dix sujets ou plus dans un groupe pour obtenir des tendances comportementales fiables. Deux ou trois groupes sont nécessaires selon l’objectif de l’étude.
    1. Pendant la séance de conditionnement, présentez le stimulus non conditionné (US) (1 s, 0,9 mA) immédiatement après la fin du stimulus conditionné (CS) (rafale de tonalité continue, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) comme indiqué à la figure 1B. Livrez cinq paires CS-US en une journée de conditionnement.
    2. Après la fin du 5ème choc au pied, laissez le sujet dans le contexte pendant 1 min avant de le remettre dans la cage d’origine. Essuyez la chambre avec de l’alcool à 70 % pour le nettoyer après chaque test comportemental.
      REMARQUE : L’intensité de la CS et de l’échographie peut être modifiée en fonction de l’objectif de l’étude. Des rapports antérieurs ont montré qu’une intensité plus forte de CS déclenche des comportements défensifs plus actifs que des comportements plus doux15. Les journées de conditionnement peuvent également être prolongées.
  2. Induire des comportements de vol lors des présentations CS en suivant le calendrier mentionné ci-dessous.
    NOTE : UN CS (95 dB SPL) et un US (0,9 mA) sont utilisés dans cette expérience.
    1. Le jour 1, exposer les sujets à 5 essais de CS seul dans le contexte A.
    2. Les jours 2 et 3, conditionner les sujets avec 5 essais d’association CS-US dans le contexte B.
    3. Le jour 4, exposer les sujets à 5 essais de CS seuls pour la séance de rappel dans le contexte B. En cas de test d’extinction de la mémoire, exposer les sujets à 15 essais de CS seuls.
      REMARQUE : Pour tester la stabilité de la mémoire, prolonger les sessions d’extinction de 2 à 3 jours sera utile. De plus, tester la mémoire une semaine plus tard au lieu du jour 4 peut fournir une confirmation supplémentaire de la stabilité de la mémoire.

4. Analyse des comportements défensifs

REMARQUE : Le mouvement, le pourcentage de gel et le nombre de sauts pendant les présentations CS sont analysés. Les détails sont décrits ci-dessous. Si possible, il serait préférable d’analyser en double aveugle.

  1. Synchronisez les timings des événements dans la vidéo et les timings des stimuli (CS et US) en utilisant le début du ton enregistré dans la vidéo.
  2. Utilisez un code personnalisé pour calculer les mouvements moyens et totaux des souris en fonction de la différence du centre de masse de la silhouette du sujet à travers les images.
    REMARQUE : Une unité arbitraire est utilisée pour cette mesure car la vitesse de mouvement dépend de la fréquence d’échantillonnage du film.
  3. Pour mesurer le pourcentage de gel, utilisez le signal du transducteur dans le temps.
    1. Prétraiter les signaux du transducteur à l’aide d’un filtre passe-bande 20-500 Hz.
    2. Calculez l’amplitude quadratique moyenne du signal de la sonde dans le temps pour chaque intervalle de 50 ms.
    3. Définissez un seuil pour l’amplitude du signal afin de détecter la période d’immobilité. La durée de l’immobilité est la période du signal inférieure au seuil pendant plus de 1 s.
    4. Mesurez manuellement la durée du gel en regardant la vidéo.
    5. Ajustez le seuil d’amplitude du signal pour le gel en comparant le pourcentage de gel mesuré manuellement et le pourcentage calculé à partir du signal du transducteur.
  4. Comptez manuellement le nombre de sauts à partir de fichiers vidéo.
    REMARQUE : Le comptage du nombre de fléchettes sera également utile pour évaluer la réponse en vol.

5. Analyse statistique

  1. Fixez la signification statistique à p < 0,05.
  2. Pour les comparaisons entre plusieurs groupes et plusieurs facteurs, effectuez une ANOVA multidirectionnelle suivie de tests post-hoc. Si un jour spécifique du programme de conditionnement est testé, effectuez plusieurs tests de comparaison ou tests de permutation.

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Résultats

Les résultats obtenus avec le conditionnement de peur modifié chez les souris mâles (C57BL/6J ; 3-6 mois) sont présentés, en suivant le calendrier indiqué à la figure 1C. L’expérience a été conçue pour étudier comment le contexte conditionné influence l’expression des comportements de vol. Deux groupes ont été affectés : le groupe 1 (n = 10) et le groupe 2 (n = 10). Un CS (95 dB SPL) et un US (0,9 mA) ont été utilisés dans cette expérience.

Le jour 1, toutes les s...

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Discussion

Le protocole modifié de conditionnement de la peur présenté dans cet article est une méthode stable pour étudier les comportements de vol dans un contexte de peur. En utilisant ce protocole, nous avons constaté que les comportements de vol des souris dans le contexte de la peur sont déclenchés par des stimuli saillants et dépendent du contexte. Les caractéristiques du comportement en vol n’ont pas été bien étudiées, car il n’y avait pas de protocole approprié pour observer les comportements en vol. Ce protocole sera l’un...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par les subventions KAKENHI JP22K15795 (à T.F.), JP22K09734 (à N.K.), JP21K07489 (à R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, à R.Y.) et The Naito Foundation (à T.F.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Haut-parleur audioFostexFT17H
AmplificateurSonyTA-F500
Caméra CMOSSanwa Supply Inc.CMS-V43BK
Chambre de conditionnement de la peurPanlab S.L.U.LE116
Granulés alimentairesNosanLabo MR standard
LEDYamazenLT-B05N
MicrophoneACOtype 4156N
Shocker ScramblePanlab S.L.U.LE 100-26
Carte sonBehringerUMC202
Logiciel sonSyntrillium SoftwareCool Edit 2000
SondePanlab S.L.U.LE 111

Références

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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

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