Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

Daniel Call; Sabrina S. Pizarro; Erica Tovey; Emily Knight; Carrie Baumgardner; Kenneth A. Christensen; James C. Morris

doi:10.3791/66279

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Article de méthode

Mesure des changements dynamiques du pH glycosomal chez Trypanosoma brucei vivant

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DOI :

10.3791/66279

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19 janvier 2024

Daniel Call^*¹ , Sabrina S. Pizarro^*²^,³ , Erica Tovey¹ , Emily Knight²^,³ , Carrie Baumgardner²^,⁴ , Kenneth A. Christensen¹ , James C. Morris²

¹Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, ³Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Clemson University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode pour étudier comment le pH répond aux signaux environnementaux dans les glycosomes de la forme sanguine des trypanosomes africains. Cette approche implique une sonde de protéine héréditaire sensible au pH en combinaison avec la cytométrie en flux pour mesurer la dynamique du pH, à la fois en tant que test temporel et dans un format de criblage à haut débit.

Résumé

Le métabolisme du glucose est essentiel pour le trypanosome africain, Trypanosoma brucei, en tant que processus métabolique essentiel et régulateur du développement du parasite. On sait peu de choses sur les réponses cellulaires générées lorsque les niveaux de glucose environnementaux changent. Dans les parasites de la circulation sanguine et de la forme procyclique (stade d’insecte), les glycosomes abritent la majeure partie de la glycolyse. Ces organites sont rapidement acidifiés en réponse à la privation de glucose, ce qui entraîne probablement la régulation allostérique des enzymes glycolytiques telles que l’hexokinase. Dans les travaux précédents, la localisation de la sonde chimique utilisée pour effectuer les mesures de pH était difficile, ce qui limitait son utilité dans d’autres applications.

Cet article décrit le développement et l’utilisation de parasites qui expriment pHluorin2 localisée glycosomiquement, un biocapteur de pH protéique héréditaire. pHluorin2 est une variante ratiométrique de la pHluorin qui présente une diminution de l’excitation dépendante du pH (acide) à 395 nm tout en produisant simultanément une augmentation de l’excitation à 475 nm. Les parasites transgéniques ont été générés en clonant le cadre de lecture ouvert de pHluorin2 dans le vecteur d’expression du trypanosome pLEW100v5, permettant l’expression inductible de protéines à l’une ou l’autre étape du cycle de vie. L’immunofluorescence a été utilisée pour confirmer la localisation glycosomale du biocapteur pHluorin2, en comparant la localisation du biocapteur à la protéine résidente glycosomale aldolase. La réactivité de la sonde a été calibrée à différents niveaux de pH en incubant des cellules dans une série de tampons dont le pH variait de 4 à 8, une approche que nous avons déjà utilisée pour étalonner une sonde de pH à base de fluorescéine. Nous avons ensuite mesuré la fluorescence de pHluorin2 à 405 nm et 488 nm en utilisant la cytométrie en flux pour déterminer le pH glycosomal. Nous avons validé les performances des parasites transgéniques vivants exprimant pHluorin2, en surveillant le pH dans le temps en réponse à la privation de glucose, un déclencheur connu de l’acidification glycosomale chez les parasites PF. Cet outil a une gamme d’applications potentielles, y compris potentiellement utilisé dans le criblage de médicaments à haut débit. Au-delà du pH glycosomal, la sonde pourrait être adaptée à d’autres organites ou utilisée dans d’autres trypanosomatidés pour comprendre la dynamique du pH dans le cadre de cellules vivantes.

Introduction

Les kinétoplastides parasites, comme la plupart des organismes vivants, dépendent du glucose comme composant fondamental du métabolisme central du carbone. Ce groupe comprend des organismes médicalement importants, tels que le trypanosome africain, Trypanosoma brucei ; le trypanosome américain, T. cruzi ; et les parasites du genre Leishmania. Le métabolisme du glucose est essentiel à la croissance du parasite dans les stades du cycle de vie pathogène. Par exemple, lorsqu’il est privé de glucose, la forme sanguine (BSF) du trypanosome africain meurt rapidement. Notamment, la glycolyse est la seule source d’ATP à ce stade de l’infection