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Article de méthode

Mesure de l’apprentissage associatif dans la chimiotaxie du nématode Caenorhabditis elegans

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DOI :

10.3791/66311

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17 juin 2025

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour tester l’apprentissage associatif en effectuant un conditionnement classique dans l’organisme modèle C. elegans. Le paradigme est basé sur l’appariement de la concentration de sel dans l’environnement avec la présence ou l’absence de nourriture, ce qui modifie leur chimiotaxie vers ou loin du sel.

Résumé

Pour adapter leur comportement, les animaux attribuent une valence aux informations sensorielles par le biais de l’apprentissage associatif, et mettent à jour cette association lorsque les conditions environnementales changent. Les réponses comportementales de Caenorhabditis elegans au chlorure de sodium offrent un paradigme bien défini pour étudier les mécanismes régissant l’apprentissage associatif. L’exposition des vers à des niveaux spécifiques de NaCl associée à la présence ou à l’absence d’aliments provoque une chimiotaxie vers ou loin de cette concentration de NaCl, respectivement. La mémoire associative se forme en quelques heures et peut être modifiée dans le même laps de temps lors de l’exposition des animaux à une concentration différente de NaCl.

Ici, nous décrivons comment tester la plasticité comportementale et l’apprentissage en se basant sur la chimiotaxie du sel de C. elegans . Les souches d’essai sont cultivées en cohortes synchronisées jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge adulte, puis sont conditionnées pendant plusieurs heures sur des plaques avec différentes concentrations de NaCl, en présence ou en absence de nourriture. Les animaux sont ensuite transférés dans des plaques d’essai contenant des régions de concentrations faibles, moyennes ou élevées de NaCl et on les laisse ramper pendant 30 minutes avant de compter le nombre de vers dans chaque région. Un indice de chimiotaxie est ensuite calculé à partir de la distribution des vers sur la plaque. Le test peut être utilisé pour tester l’effet d’une série de facteurs affectant l’apprentissage.

Introduction

Pour interagir de manière significative avec leur environnement et générer un comportement adaptatif, les animaux doivent interpréter les informations sensorielles qu’ils reçoivent : la question de savoir si un signal sensoriel donné est bénéfique ou préjudiciable à leur survie n’est presque toujours pas prédéterminée, mais dépend du contexte. Une tâche clé des systèmes sensoriels et nerveux est donc d’attribuer une valence aux informations environnementales par le biais de l’apprentissage associatif. Certains stimuli sont intrinsèquement appétitifs, comme la nourriture, et d’autres sont intrinsèquement aversifs, comme les signaux nociceptifs. De tels stimuli inconditionnels peuvent modifier les réponses à d’autres stimuli présentés avec eux ; en conséquence, les animaux peuvent développer une attirance ou une aversion pour l’autre, le stimulus conditionné (CS). Ceci est interprété de telle manière que CS signale ou prédit les États-Unis 1,2,3. L’étude de modèles d’apprentissage associatif est nécessaire pour élucider les mécanismes génétiques, cellulaires et physiologiques sous-jacents. Cependant, cela peut s’avérer difficile en raison de la nécessité d’utiliser des modèles in vivo, de la variabilité du comportement, de l’autorisation requise pour la manipulation des animaux ou des délais souvent longs de formation du chercheur et des animaux, ce qui empêche généralement les étudiants de premier cycle de la réaliser dans un cadre de recherche, et encore plus dans un cadre d’enseignement.

Par conséquent, les modèles d’invertébrés offrent la possibilité de mener des essais d’apprentissage associatif avec des étudiants de premier cycle ou de maîtrise. Les invertébrés n’ont pas besoin d’un permis d’utilisation d’un animal pour les manipuler et peuvent être rentables. Un paradigme fréquemment utilisé pour l’apprentissage associatif est l’apprentissage de la chimiotaxie salée chez C. elegans 4,5,6,7,8,9. C. elegans détecte la concentration de chlorure de sodium (NaCl) dans son environnement et apprend à associer un [NaCl] particulier à la présence ou à l’absence de nourriture, respectivement. En général, les animaux apprennent à migrer vers des concentrations de sel qui étaient auparavant présentées avec une nourriture bactérienne abondante et apprennent à s’éloigner de celles qui étaient présentées en l’absence de nourriture bactérienne. Le sel est donc le stimulus conditionné, et la nourriture ou la famine est le stimulus inconditionnel3. Cette association se forme en moins d’une heure et est un exemple de mémoire associative à court terme. L’apprentissage associatif de la chimiotaxie NaCl est modulé, entre autres, par la signalisation de la kinase dépendante du calcium/calmoduline (CaMK), la signalisation dopaminergique et la signalisation insuline/phosphatidylinositol (PI) 3-kinase 5,9,10, ce qui suggère qu’elle implique des systèmes motivationnels et une plasticité synaptique dépendante du CaMK et peut fonctionner de manière similaire aux voies de signalisation régissant l’apprentissage associatif chez les vertébrés.

Dans un protocole établi pour l’apprentissage de la chimiotaxie du sel, les animaux migrent dans un gradient spatial de sel sur une plaque de gélose créée en plaçant deux bouchons de gélose sans sel ou à haute teneur en sel, respectivement, sur la plaque7. Ces tests sont difficiles à réaliser de manière quantitative par les étudiants de premier cycle en raison du changement dynamique de la concentration de NaCl sur la plaque de dosage de chimiotaxie au fil du temps et de l’espace, car le NaCl des bouchons se diffuse continuellement dans la plaque de gélose. Un test plus facile à réaliser est l’utilisation de plaques de quadrant, où deux concentrations de sel différentes (par exemple, 25 mM de NaCl et 0 mM de NaCl) sont présentées et séparées par des barrières en plastique11. Cependant, en raison de la présentation de seulement deux concentrations différentes de NaCl, il ne peut pas être utilisé simultanément pour mesurer l’attraction et/ou l’évitement d’une baisse ou d’une augmentation du NaCl par rapport à la condition de référence. C. elegans est généralement cultivé sur des plaques NGM (Nematode Growth Media) en présence de 50 mM de NaCl et de la bactérie E. coli OP5012, et forme donc par défaut une association positive de cette concentration de NaCl avec les aliments.

Ici, nous présentons un protocole d’apprentissage adapté de la chimiotaxie du sel qui peut être effectué à la fois par les chercheurs et les étudiants de premier cycle. Les animaux sont d’abord conditionnés à différents environnements NaCl présentés en présence ou en absence de nourriture. Ils sont ensuite transférés sur des plaques de dosage avec un choix de concentrations de sel faibles, moyennes et élevées dans des plaques de gélose en Y. Leur apprentissage de la chimiotaxie dans ce contexte peut être utilisé pour étudier l’effet de divers facteurs qui le modulent, tels que le génotype, les contextes environnementaux ou l’âge des animaux.

Ce protocole est adapté à une classe de laboratoire pratique de premier cycle divisée en huit groupes d’étudiants, chaque groupe d’étudiants effectuant une série de six mesures à chaque point expérimental (une mesure par condition expérimentale). Cependant, le protocole peut être ajusté pour fonctionner pour un seul expérimentateur ou pour n’importe quel nombre de groupes/personnes, avec des modifications appropriées des quantités de réactifs.

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Protocole

1. Préparation des plaques de croissance (GP) pour synchroniser C. elegans avant le test d’apprentissage associatif, et préparation des plaques (CP) pour induire l’association [NaCl]-aliment le jour du test

REMARQUE : Les boîtes de Pétri pour la croissance et le conditionnement sont identiques aux plaques12 des milieux de croissance des nématodes (NGM) standard, sauf que la concentration de NaCl a varié dans les plaques de NaCl CP de 0 mM et de NaCl CP de 100 mM.

  1. Préparez quatre bouteilles en verre propres de 500 ml et ajoutez ce qui suit :
    1. Ajouter 1,25 g de peptone, 8,5 g d’agar, 487,5 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans une bouteille (pour 0 mM de NaCl CP) ;
    2. Ajouter 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptone, 8,5 g d’agar, 487,5 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans chacune des deux bouteilles (pour 50 mM de NaCl CP et GP, respectivement) ;
    3. Ajouter 3 g de NaCl, 1,25 g de peptone, 8,5 g d’agar, 487,5 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans une bouteille (pour 100 mM de NaCl CP).
  2. Autoclavez les quatre bouteilles pendant 15 min à 121 °C, puis laissez refroidir les bouteilles pendant 30 min à 55 °C au bain-marie.
  3. Placez les bouteilles (une à la fois) sur un agitateur magnétique chauffé. Ajouter à chaque bouteille 12,5 mL de 1 M de KPO4 (pH = 6,0 à température ambiante [RT]). Bien mélanger pendant 2 min, puis ajouter 0,5 mL de 1 M de CaCl2, 0,5 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol et 0,5 mL de 1 M de MgSO4 (toutes les solutions doivent être stériles). Mélanger par agitation magnétique.
    REMARQUE : Un mélange complet après l’ajout de KPO4 empêche la précipitation du phosphate de calcium lors de l’ajout de CaCl2.
  4. Pour chaque type de plaque (0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP), aliquote 8 mL du milieu respectif dans chaque boîte de Pétri de 55 mm x 10 mm dans des conditions quasi stériles (dans une hotte à flux ou à côté du bec Bunsen).
    REMARQUE : Environ 62 plaques NGM de chaque type peuvent être fabriquées à partir de cette étape.
  5. Refroidissez les plaques en les laissant à RT pendant environ 3 h, puis conservez-les à 4 °C jusqu’à 2 semaines jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
  6. Ajouter 200 μL de suspension d’E. coli OP50 dans chaque NGM GP et laisser sécher toute la nuit à 20 °C dans un incubateur.
    REMARQUE : Les plaques peuvent être stockées chez RT jusqu’à 1 semaine avant d’être utilisées.

2. Entretien de C. elegans et préparation au test d’apprentissage associatif par ponte chronométrée 13 (3 jours avant le test)

REMARQUE : Une série de tests de chimiotaxie dans le format suggéré nécessite au moins 24 plaques pour la croissance (GP), 48 plaques pour le test (Assay Plates, AP) et 8 plaques par groupe de conditionnement (Conditioning Plates, CP). Pour une classe divisée en huit groupes d’étudiants, cela signifie que chaque groupe d’étudiants reçoit 3 GP, 6 CP et 6 AP - c’est-à-dire 1 CP et 1 PA pour chaque condition expérimentale.

  1. Maintenir C. elegans N2 (var. Bristol) sur des plaques de gélose NGM nourries avec des E. coli OP50 vivants à 20 °C. Rangez les plaques à l’envers tout au long de l’entretien pour minimiser la perte d’humidité des plaques.
  2. Transférer 30 jeunes adultes N2 (jour 2) dans chaque GP.
  3. Laissez les animaux pondre pendant environ 8 h à 20 °C.
  4. Retirer tous les adultes des assiettes et les faire cultiver à l’envers à 20 °C pendant 3 jours.

3. Préparation du test (1 jour avant le test)

  1. Préparez les PC ensemencés (+) et non épépinés (-).
    1. Semez la moitié du lot de 0 mM de NaCl CP, 50 mM de NaCl CP et 100 mM de NaCl CP avec 200 μL d’OP50 par plaque (CP0+, CP50+ et CP100+, respectivement).
      REMARQUE : L’ajout de la suspension OP50 à CP0+ peut entraîner le transport d’une petite quantité de NaCl (<2 mM de NaCl), ce qui est peu susceptible d’affecter considérablement le comportement de chimiotaxie. Dans les situations où de petites concentrations de NaCl sont pertinentes, cela pourrait être pris en compte en ajoutant 2 mM de NaCl aux plaques CP0- et le secteur « sans sel » sur les plaques de dosage.
    2. Laisser sécher les plaques pendant la nuit à 20 °C dans un incubateur à côté de la moitié non ensemencée de la PC (CP0-, CP50- et CP100-, respectivement)
  2. Préparer les plaques d’essai (AP).
    1. Préparez trois bouteilles en verre propres de 1 L et ajoutez ce qui suit :
      1. Ajouter 2,5 g de peptone, 17 g d’agar, 975 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans une bouteille (pour 0 mM de NaCl)
      2. Ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 17 g d’agar, 975 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans une bouteille (pour 50 mM de NaCl)
      3. Ajouter 6 g de NaCl, 2,5 g de peptone, 17 g d’agar, 975 ml d’eau distillée et un agitateur magnétique dans une bouteille (pour 100 mM de NaCl)
    2. Autoclavez les trois bouteilles pendant 15 min à 121 °C, puis laissez refroidir les bouteilles pendant 30 min à 55 °C au bain-marie.
    3. Pendant ce temps, étiquetez le fond de chaque section de la boîte de Pétri en Y (une boîte de Pétri de 90 mm x 10 mm divisée en trois compartiments par une paroi interne) avec la concentration en NaCl correspondante du milieu à y verser. Tracez un cercle d’un rayon de 5 mm autour du centre de la plaque, à l’endroit où les trois parois se rencontrent (Figure 1).
      REMARQUE : La zone à l’intérieur du cercle, ainsi que les murs eux-mêmes, représenteront la zone d’exclusion à des fins de comptage : les vers trouvés dans ces zones pendant le comptage ne seront pas pris en compte dans le total d’un secteur.
    4. Placez les bouteilles (une à la fois) sur un agitateur magnétique chauffé. Ajouter à chaque bouteille 25 mL de 1 M de KPO4 (pH = 6,0 à RT). Bien mélanger pendant 2 min, puis ajouter 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol et 1 mL de 1 M de MgSO4 (toutes les solutions doivent être stériles). Mélanger par agitation magnétique.
    5. Placez le milieu 0 mM dans un compartiment d’une boîte de Pétri en Y de 90 mm x 10 mm jusqu’à ce que le milieu atteigne le haut de la paroi interne, puis laissez environ 5 min se solidifier.
    6. Aliquote le milieu de 100 mM dans le deuxième compartiment de la boîte de Pétri Y jusqu’à ce que le milieu touche la section de NaCl solidifiée de 0 mM adjacente. Pour éviter tout débordement dans la section vide adjacente, remplissez la section de 100 mM jusqu’au bord de la paroi interne en Y, puis utilisez une pointe de pipette stérile de 10 μL pour briser la tension superficielle du fluide le long de la paroi en Y et connectez-la à la section NaCl de 0 mM. Ensuite, laissez environ 5 min se solidifier.
    7. Aliquote le milieu de 50 mM dans le compartiment vide restant de la boîte de Pétri en Y jusqu’à ce que le milieu touche les sections adjacentes solidifiées de 0 mM de NaCl et de 100 mM de NaCl. Veillez à ce que le fluide ne déborde pas dans les sections adjacentes. Ensuite, laissez environ 5 min se solidifier.
    8. Conservez les plaques pendant la nuit à 20 °C dans un incubateur.
      REMARQUE : Environ 50 PA peuvent être fabriqués à partir de cette méthode.
  3. Préparez 1 L de tampon M9 stérile14.

4. Essai d’apprentissage associatif de C. elegans (ici réalisé par 8 groupes en parallèle)

  1. Pipetez 1 mL de tampon M9 stérile sur un GP et faites tourner doucement la plaque pour déloger les vers (principalement des adultes d’un jour) de l’OP50 et de la gélose, formant une suspension.
  2. Inclinez la plaque, récupérez la suspension de vis sans fin dans le tampon M9 à l’aide d’une pointe de pipette en plastique de 1 ml et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
    REMARQUE : La partie supérieure de la pointe de la pipette peut être coupée à l’aide d’une paire de ciseaux pour augmenter le diamètre de l’ouverture ; cela réduit les contraintes de cisaillement et les dommages physiques lorsque les vers passent à travers la pointe et peut être particulièrement utile lorsque vous travaillez avec des pointes de pipette de 200 μL. Avant de commencer les expériences, il est important de s’assurer que les vers ne collent pas au type de tube utilisé ; Cela peut être fait en observant le tube sous un microscope de dissection après avoir retiré la suspension de ver.
  3. Répétez le processus pour tous les GP, puis laissez les vers se déposer au fond des tubes de la microcentrifugeuse pendant environ 60 s, formant une pastille.
  4. Retirez le surnageant/l’excès de tampon M9 à l’aide d’une pipette de 1 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
  5. Lavez la pastille avec 1 ml de tampon M9 stérile deux fois de plus pour éliminer tout résidu d’OP50. Laissez la pastille se déposer pendant environ 60 secondes entre les lavages. Remettez le granulé en suspension après l’avoir lavé à 300 μL avec le tampon M9.
  6. Transférez lentement 50 μL de suspension de vers (environ 200 à 300 animaux) sur chaque plaque de conditionnement (CP0-, CP0+, CP50-, CP50+, CP100- et CP100+). Faites tourner la suspension à chaque fois avant d’aliquote pour maintenir les vers uniformément en suspension. Pour les assiettes ensemencées avec OP50, placez la gouttelette de ver loin de la pelouse alimentaire bactérienne. Laissez la suspension absorber dans la gélose.
  7. Conservez les plaques à l’envers à 20 °C dans un incubateur pendant environ 4 h, en laissant les vers se promener.
    REMARQUE : L’étape de conditionnement peut être raccourcie à 2 h pour s’adapter aux horaires de cours de premier cycle.
  8. Pipetez 1 mL de tampon M9 stérile sur un CP et faites tourner doucement la plaque pour déloger les vers et former une suspension.
  9. Inclinez la plaque, récupérez la suspension de la vis M9 à l’aide d’une pointe de pipette en plastique de 1 ml et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  10. Laissez les vers se déposer au fond du tube de la microcentrifugeuse pendant environ 60 s.
  11. Retirer le surnageant/tampon M9 en excès à l’aide d’une pipette de 1 mL sans déranger la pastille de ver.
  12. Lavez les vers deux fois de plus avec 1 ml de tampon M9 stérile. Laissez la pastille se déposer pendant environ 60 secondes entre les lavages.
  13. Remplissez le tube de microcentrifugation avec le tampon M9 jusqu’à ce qu’il soit de 1 ml et laissez la pastille de ver reposer pendant environ 60 s.
  14. Prélever 960 μL de surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
  15. Faites tourner ou secouez doucement le tube de la microcentrifugeuse pour remettre les vers en suspension, puis utilisez une pipette de 20 μL pour transférer 20 μL de la pastille de ver (contenant environ 100 à 150 animaux) au centre d’un AP, où tous les segments de la paroi en Y se rencontrent. Répétez cette étape pour les autres points d’accès.
  16. Laissez les vers se déplacer pendant 30 minutes à 20 °C, puis comptez le nombre de vers présents dans chacune des sections du PA (0 mM NaCl, 50 mM NaCl et 100 mM NaCl, respectivement) au microscope stéréoscopique. Excluez les vers présents à moins de 5 mm du centre de la plaque dans toute section ou sur la bordure entre les sections (Figure 1).
  17. Laissez les vers errer pendant encore 30 minutes à 20 °C, puis comptez à nouveau le nombre de vers dans chaque section du PA. Excluez toute vis présente à moins de 5 mm du centre de la plaque dans n’importe quelle section.
  18. Calculer l’indice de chimiotaxie (IC) par plaque et par point temporel à l’aide de la formule15,16 :
    figure-protocol-1

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Résultats

Le conditionnement pendant 4 h sur des plaques avec différentes quantités de NaCl (0 mM, 50 mM, 100 mM), avec ou sans nourriture, a significativement affecté le comportement de C. elegans de type sauvage (N2). Après 30 minutes sur la plaque d’essai, les vers conditionnés sur des plaques avec des concentrations élevées de NaCl et des aliments (CP100+) et des vers conditionnés sur des plaques sans NaCl et sans aliment (CP0-) avaient un IC positif, indiquant une préférence pour des...

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Discussion

Dans cet article, nous décrivons l’évaluation de l’apprentissage associatif chez le nématode C. elegans en utilisant la chimiotaxie comme paradigme expérimental. Dans notre exemple, nous avons utilisé six conditions expérimentales. Plus précisément, des C. elegans de type sauvage N2 ont été conditionnés sur des plaques avec des concentrations de NaCl faibles (0 mM), moyennes (50 mM) ou élevées (100 mM) qui ont été ensemencées avec la nourriture standard pour nématodes (...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous dédions cet article à la mémoire de Johannes Berthold. Certaines souches ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), qui est financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). E.I.B. remercie chaleureusement la Studienstiftung des deutschen Volkes pour son soutien financier.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgarChemsolute9972-2KG
Bacto-peptoneGibco211677
CaCl2 solution 1MMerck2389
Caenorhabditis elegans souchesCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
CholesterolRoth8866.1
E. coli OP50 culture liquideN/AN/A
EthanolChemsolute22731000
KH2PO4RothP018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) solution 1 MChemsolute16341000
MgSO4 solution 1 MRothT888.2
Tubes de microcentrifugation 1,5 mLEppendorfN/A
Na2HPO4RothT877.1
NaClChemsolute13671000
Y-Petri platines 90 x 10 mmMoonlab4-0033

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Essai de chimiotaxieplasticit comportementaleconditionnement au chlorure de sodiumplasticit neuraled clin cognitif li l geindice de chimiotaxieimagerie microfluidiquesynchronisation des vers
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