Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.
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Article de méthode
Injection intrafémorale de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéprimées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines tout au long de leur vie. Ceci est testé opérationnellement en transplantant des populations cellulaires contenant des CSH dans des souris syngéniques ou immunodéprimées. La taille et la composition multilignage du greffon sont ensuite mesurées au fil du temps, généralement par cytométrie en flux. Classiquement, une population contenant des CSH est injectée dans la circulation de l’animal, après quoi les CSH abritent la moelle osseuse, où elles se logent et commencent la production de sang. Alternativement, les CSH et/ou les cellules progénitrices (HSPC) peuvent être placées directement dans la cavité de la moelle osseuse.
Cet article décrit un protocole d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes. En bref, les souris préconditionnées sont anesthésiées et un petit trou est percé à travers le genou dans le fémur à l’aide d’une aiguille. À l’aide d’une aiguille à insuline plus petite, les cellules sont ensuite injectées directement dans le même conduit créé par la première aiguille. Cette méthode de transplantation peut être appliquée dans des conceptions expérimentales variées, en utilisant des cellules de souris ou humaines comme cellules donneuses. Il a été le plus largement utilisé pour la xénotransplantation, car dans ce contexte, on pense qu’il permet une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses, améliorant ainsi la puissance statistique et réduisant le nombre de souris à utiliser.
Introduction
Le sang a l’un des taux de régénération les plus élevés du corps humain, produisant 1 ×10 12 cellules par jour dans la moelle osseuse humaine adulte1. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) garantissent la production de sang tout au long de la vie par le processus d’hématopoïèse et sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines (multipotentialité) tout en se maintenant (auto-renouvellement). Historiquement, l’étalon-or pour tester la fonction d’une CSH a toujours reposé sur la transplantation, testant la capacité d’une population de donneurs à reconstituer toutes les lignées sanguines d’une souris à long terme (généralement définie comme un minimum de 20 semaines)2. Un vaste corpus de travaux fonctionnels s’étendant sur plusieurs décennies a démontré que le compartiment HSC est hétérogène à la fois dans la production de lignées et dans la reconstitution à long terme. La boîte à outils pour étudier l’hématopoïèse s’est considérablement élargie au fil des ans, avec de nombreuses nouvelles techniques, notamment des tests fonctionnels unicellulaires in vitro , des approches unicellulaires -omiques et le traçage de la lignée3. Ces derniers ont démontré de manière concluante que les contributions des CSH et des progéniteurs multipotents diffèrent largement dans l’hématopoïèse native et sous le stress imposé par la transplantation. Toutes ces techniques complètent les tests de transplantation, qui restent importants pour évaluer la capacité de repeuplement à long terme des CSH. Dans le contexte de l’étude de l’hématopoïèse humaine, la xénotransplantation constitue la seule méthode permettant d’évaluer expérimentalement l’auto-renouvellement dans un cadre d’organisme entier.
La xénotransplantation de CSH est couramment réalisée par injection intraveineuse de cellules chez des souris immunodéprimées. Cependant, les CSH sont rares4 et l’accès aux échantillons humains contenant des CSH est limité. En 2003, le groupe de John Dick a adapté un protocole de ponction de moelle osseuse et d’injection intraféorale de cellules de sang de cordon ombilical (CB) non obèses chez des souris non obèses atteintes de diabète de cordon ombilical (CB)5. À notre connaissance, il n’y a pas eu de comparaison formelle entre les injections intraveineuses et intrafémorales dans les résultats à long terme et en série des transplantations. Cependant, par rapport aux injections intraveineuses directes, les injections intrafémorales permettent d’obtenir des greffons de plus grande taille avec le même nombre de cellules transplantées6, du moins à court terme. De plus, la greffe peut être détectée avec beaucoup moins de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) transplantées. On pense que cela est dû au fait que l’administration intrafémorale contourne la nécessité pour les CSH de se loger dans la moelle osseuse, ce qui, dans le contexte de la xénogreffe, est limitatif en raison d’un manque de réactivité inter-espèces pour un certain nombre de récepteurs et de cytokines. Grâce à l’utilisation d’injections intrafémorales, Notta et ses collègues ont été les premiers à transplanter des CSH7 humaines uniques, bien que des considérations supplémentaires doivent être prises, comme décrit dans leurs méthodes. L’administration intrafémorale de HSPC présente également des limites. L’injection elle-même perturbe et détruit une partie de la moelle osseuse et n’est donc pas indiquée pour les études de diaphonie entre les CSH et leur microenvironnement de moelle osseuse. De plus, le nombre maximum de cellules est limité par le volume de cette cavité osseuse et cela peut être trop peu pour certaines applications. Comme pour toute technique, son application dans une expérience spécifique doit être évaluée en fonction des avantages/inconvénients et de la question posée. Dans le contexte de la xénotransplantation, si le but de l’expérience est de tester la greffe d’un petit nombre de HSPC humaines sans évaluation du microenvironnement, l’administration intrafémorale est généralement préférée à l’injection intraveineuse.
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Protocole
Toutes les recherches sur les animaux présentées ici sont conformes au règlement d’amendement de 2012 de la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et ont été effectuées après examen éthique et approbation par l’organisme d’examen et d’examen éthique des animaux de l’Université de Cambridge (AWERB). Hochement de tête féminin. Des souris Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), âgées de 12 à 16 semaines (~21-30 g), élevées en interne et maintenues dans une animalerie exempte d’agents pathogènes spécifiques, ont été utilisées pour des injections intrafémorales. Des échantillons de CB anonymisés ont été prélevés sur des donneurs sains après consentement éclairé de la Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB), conformément aux procédures réglementées approuvées par le Comité local d’éthique de la recherche du Cambridgeshire (18/EE/0199).
1. Préparation de la souris
- Avant l’irradiation, entaillez les oreilles des souris pour l’identification et pesez-les pour leur poids de base.
- Vingt-quatre heures avant la transplantation des cellules, irradiez les souris de manière sublétale avec un rayonnement de 2,4 Gy.
2. Préparation des cellules
REMARQUE : Pour ces injections, les cellules peuvent être utilisées à partir d’échantillons frais ou congelés. Des sous-populations spécifiques de cellules peuvent être triées par cytométrie en flux. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées dans les conditions souhaitées avant la transplantation. Pour les expériences présentées, nous utilisons des cellules CB CD34+ congelées.
- Décongelez les cellules dans un tube de 50 mL en ajoutant goutte à goutte 10 fois le volume de la cellule d’IMDM préchauffé + 50 % de sérum fœtal bovin (FBS) + 0,1 mg/mL de DNase tout en agitant le tube manuellement. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 5 min.
- Remettre les cellules en suspension dans 20 à 40 μL (idéalement 25 μL) de PBS + pénicilline-streptomycine (10 U/mL ou 0,1 %) par souris. Si possible, prévoyez des cellules supplémentaires pour un volume mort lors de l’incorporation des cellules dans la seringue pour les injections. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’aux injections. Le nombre maximum de cellules par injection est de 4 millions de cellules.
3. Préparation à l’injection intrafémorale dans l’animalerie
- Préparez les trois aiguilles suivantes requises pour cette procédure :
- Préparez une seringue de 3 ml avec une aiguille de 27 G 1/2 po.
- Préparez une seringue à insuline de 0,5 ml avec une aiguille de 29 g x 12,7 mm contenant la suspension cellulaire.
- Préparez une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 29 g x 0,5 po avec 0,1 mg/kg de buprénorphine (100 μL).
- Anesthésier les souris dans une boîte anesthésique (par l’inhalation d’isoflurane à 2 % (v/v) et d’oxygène à 2 L/min). Transférez la souris dans un cône nasal et confirmez qu’elle est prête pour la procédure en pinçant les orteils. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
REMARQUE : Cette procédure est effectuée dans une cagoule de biosécurité de niveau de confinement 2 et des conditions stériles sont utilisées.
4. Injection intrafémorale
- Posez la souris sur le dos et faites fléchir sa patte arrière. Fixez la patte arrière à l’aide de la main non dominante en plaçant le pouce sur le pied, le majeur sur la hanche et l’index à l’extérieur du fémur.
- Rasez doucement ou épilez les poils autour de la rotule et utilisez un tampon imbibé d’alcool pour essuyer la zone.
- Utilisez la seringue de 3 ml avec une aiguille de 27 G 1/2" et visez le coin supérieur interne de la rotule pour percer doucement un trou à travers la peau vers le fémur. Bien que l’aiguille puisse être tournée d’avant en arrière au début, n’utilisez qu’un mouvement dans le sens des aiguilles d’une montre une fois dans l’os, jusqu’à ce que toute l’aiguille soit dans l’os.
REMARQUE : L’objectif de cette étape est de générer un conduit pour la livraison des cellules. (Facultatif) Pour vérifier si l’aiguille est correctement dans l’os, relâchez la jambe et tournez la seringue d’un côté à l’autre ; S’il est correctement dans l’os, toute la jambe doit bouger avec la rotation. Fixez à nouveau la jambe à l’aide de la main non dominante en plaçant le pouce sur le pied, le majeur sur la hanche et l’index à l’extérieur du fémur, avant de continuer. Si elle n’est pas insérée correctement, l’aiguille sera probablement dans le muscle ou le tendon, la jambe ne tournera pas avec la seringue et vous sentirez peut-être l’aiguille sous la peau. - Retirez l’aiguille en effectuant une rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’elle soit à mi-chemin. À ce stade, utilisez un tampon imbibé d’alcool pour essuyer autour de l’aiguille (il peut y avoir une petite goutte de sang), puis continuez à tourner l’aiguille dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et retirez l’aiguille.
- Insérez la seringue à insuline de 0,5 mL contenant les cellules dans la diaphyse fémorale par le même conduit. Une fois l’aiguille insérée, notez qu’une égratignure indique l’emplacement correct. À ce stade, relâchez la prise sur la jambe, mais veillez à ne pas retirer l’aiguille de la jambe. Ensuite, injectez doucement les 25 μL de suspension cellulaire dans le fémur et retirez l’aiguille.
REMARQUE : La « rayure » décrite est comme frapper une surface rugueuse et si l’aiguille a l’impression d’être entrée en douceur sans sensation de rugosité, elle n’est pas au bon endroit. La plupart des utilisateurs le comprennent clairement une fois qu’ils réussissent dans leur pratique.
5. Soins post-injection
- Injectez de la buprénorphine (0,1 mg/kg, 100 μL) par voie sous-cutanée à la souris avant de la remettre dans sa cage et de surveiller la récupération de l’anesthésique.
REMARQUE : La souris ne doit pas être laissée sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir la déposition sternale et n’est pas renvoyée en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétablie. Il est peu probable que les souris présentent des effets indésirables à l’injection intrafémorale ; Cependant, l’injection intrafémorale peut entraîner une réduction de l’activité et de la douleur dans la zone opérée. - Évaluez l’enflure du jarret, la douleur et la mobilité après la procédure.
REMARQUE : Les souris devraient retrouver une mobilité normale des membres dans les 24 heures suivant l’injection.
6. Analyse des données
- Euthanasier les souris par luxation cervicale ou toute méthode approuvée après l’injection à tout moment, par exemple 24 à 48 semaines pour les expériences de retour à l’asile, 4 à 12 semaines pour l’activité à court terme des CSH >18 semaines pour la greffe à long terme. Si une analyse du sang périphérique (PB) est prévue, saignez les souris avant le sacrifice par toute méthode autorisée, produisant idéalement 50 à 100 μL de sang (pas plus de 10 % du volume total). Enlever les os de la patte arrière et la rate selon les protocoles de dissection standard.
- Pour la moelle osseuse :
- Gardez le fémur injecté (FI) et les os non injectés (tibias de la patte arrière et fémurs non injectés, appelés BM) séparés. Rincer les os à l’aide de 1 mL d’IMDM + 5 % FBS et d’une aiguille de 36 g x 3/4 po et centrifuger pendant 5 min à 500 × g.
- Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de PBS + 3% FBS, puis transférez 50 μL dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 pour la coloration.
- Congelez toute moelle osseuse restante et stockez-la dans de l’azote liquide pour d’autres expériences ex vivo ou secondaires in vivo .
- Pour le PB :
- Lavez le tube de prélèvement avec 100 μL de PBS + 3% FBS, transférez le sang dans un tube FACS de 5 ml et augmentez le volume à 2,5 ml avec PBS + 3% FBS.
- Pipeter soigneusement 1 ml de Pancoll dans le fond des tubes FACS et centrifuger pendant 25 minutes à 500 × g avec le frein desserré.
- Récupérez la couche de couche leucocytaire, transférez-la dans des tubes de 1,5 ml et complétez à 1,5 ml avec PBS + 3 % FBS. Centrifuger pendant 5 min à 500 × g.
- Remettre la pastille en suspension dans 50 μL de PBS + 3% FBS et transférer dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 pour la coloration.
- Pour la rate :
- Placez la rate dans une passoire cellulaire placée sur un tube de 50 mL et écrasez-la avec le piston d’une seringue de 3 mL.
- Un millilitre à la fois, ajoutez 5 ml d’IMDM + 5 % de FBS pour laver les cellules. Prenez 50 μL dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 pour la coloration.
- Préparez un mastermix d’anticorps ; Voici un exemple pour 10 échantillons :
- Aliquote 550 μL de PBS + 3 % FBS (50 μL/échantillon + 10 % supplémentaire) dans un tube de 1,5 ou 2 mL.
- Ajouter les anticorps individuels de manière à ce que leur concentration finale soit de 2x en fonction de leur titrage (p. ex., pour un anticorps titré 1:100, ajouter 11 μL).
REMARQUE : Choisissez un panel d’anticorps qui évalue la différenciation potentielle dans toutes les lignées sanguines d’intérêt, par exemple, CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 et CD3/APCCy7.
- Coloration : ajouter 50 μL de mastermix d’anticorps dans chacun des puits de la plaque à fond rond 96 contenant les échantillons à colorer. Colorer pendant 20 min à température ambiante, ajouter 100 μL de PBS + 3% FBS pour laver les cellules, et centrifuger pendant 5 min à 500 × g. Retirez le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de PBS + 3 % FBS et faire passer chaque échantillon dans un tube FACS muni d’un capuchon de crépine à cellules. Aux échantillons de moelle osseuse et de rate, ajoutez 200 μL supplémentaires de PBS + 3 % FBS.
- Contrôles par cytométrie en flux : Effectuez des contrôles monocolores à l’aide de billes de compensation en ajoutant 100 μL de PBS, 1 goutte de billes positives, 1 goutte de billes négatives et 1 μL d’anticorps dans un tube FACS. Laisser poser 5 min à température ambiante puis ajouter 300 μL de PBS. Prenez 50 μL de cellules de moelle osseuse non colorées composées jusqu’à 400 μL avec PBS + 3 % FBS comme témoin non coloré.
- Analysez les échantillons par cytométrie en flux.
- Exécutez des contrôles monocolores et non colorés pour compenser comme conseillé pour le cytomètre utilisé. Configurez le gate comme sur la figure 3A.
- Pour la PB, analysez toutes les cellules et pour la moelle osseuse et la rate, exécutez un minimum de 50 000 événements par échantillon en fonction des niveaux de greffe humaine.
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Résultats
La greffe des cellules injectées par voie intrafémorale peut être évaluée à tout moment à partir de 24 heures en fonction de la conception de l’expérience. Au point temporel final, IF, BM, PB et la rate peuvent être collectés. Ceux-ci peuvent être traités et le niveau de greffe évalué par cytométrie en flux. Pour appeler de manière robuste l’incorporation humaine, même à de faibles niveaux, nous avons coloré avec deux anticorps distincts contre le CD45 humain (clone HI30 et clone 2D1). Seules les cellules positives pour ...
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Discussion
Les injections intrafémorales sont un outil utile dans la xénotransplantation lorsque seul un petit nombre de HSPC sont disponibles, offrant une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses. Cependant, la technique demande de la dextérité et de l’entraînement. Lors de la pratique, nous recommandons d’utiliser des cadavres frais de la bonne gamme de poids (voir ci-dessous) et d’injecter un colorant coloré (comme le bleu trypan) afin qu’après la dissection, il soit c...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs remercient le groupe du Dr John Dick pour ses travaux antérieurs sur cette méthode, et Monica Doedens pour sa formation. Nous sommes reconnaissants envers la Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB), en particulier la Dre Joanna Baxter et l’équipe d’infirmières de la CBSB qui ont consenti et prélevé des échantillons de sang de cordon ; nos donateurs échantillons ; le service biomédical de l’université, en particulier Nicolas Lumley et le personnel de l’édifice Anne McLaren pour l’entretien de nos souches de souris et le soutien de nos expériences in vivo ; Shaaezmeen Basheer pour l’édition du manuscrit.
E.L. est financé par une bourse Sir Henry Dale financée conjointement par le Wellcome Trust et la Royal Society (107630/Z/15/A). L.M. est soutenu par Sofinter - Programme de bien-être des ressources humaines. Cette recherche a été financée en tout ou en partie par le Wellcome Trust (203151/Z/16/Z, 203151/A/16/Z, 215116/Z/18/Z) et le Conseil de la recherche médicale de l’UKRI (MC_PC_17230). Dans le but du libre accès, l’auteur a appliqué une licence de droit d’auteur publique CC BY à toute version du manuscrit acceptée par l’auteur découlant de cette soumission.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringue à insuline de 0,5 mL avec aiguille | BD | 324892 | |
| mm Seringue à insuline avec aiguille de 29 g x 0,5 po | 324827 | ||
| tube de 1,5 mL | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
| Seringue de 3 mL. | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond avec capuchon de crépine de cellule 12 x 75 mm | Tube | Falcon 352235 | FACS |
| 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond avec capuchon à pression 12 x 75 mm | Falcon | 352058 | tube FACS |
| 27 G 1/2" aiguille ; | BD ; | ||
| 40 & micro ; Crépine à cellules m pour tube de 50 mL | Greiner Bio-one | 542040 | |
| Tube de 50 mL | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| Plaque à fond rond à 96 puits ; | Falcon | 351177 | |
| Tampon imbibé d’alcool | VITREX MEDICAL A/S | ||
| BD LSR Fortessa X-20 Analyseur de cellules ; | Cytomètre en | flux | |
| Buphrenorphine | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7 (clone M5E2) | biolegend | 301814 | Utilisé à 1 sur 1000 |
| CD19/Alexa 700 (clone HIB19) | biolegend | 302226 | Utilisé à 1 sur 300 |
| CD19/FITC (clone HIB19) | biolegend | 302206 | Utilisé à 1 sur 200 |
| CD3/APCCy7 ;( Clone HIT3a) | biolegend | 300318 | Utilisé à 1 sur 100 |
| CD33/APC (clone P67.6) | BD | 345800 | Utilisé à 1 sur 200 |
| CD45/BV510 (clone HI30) | biolegend | 304036 | Utilisé à 1 sur 500 |
| CD45/PECy5 (clone 2D1) | biolegend | 368526 | utilisé à 1 sur 300 |
| CompBeads Anti-souris Ig, &kappa ;/Negative Control Compensation Particles Set | BD | ||
| Dnase 1 | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| Glycophorine A (GlyA)/PE (Clone GA-R2) | BD | 340947 Utilisé à 1 sur 1000 | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| Isoflurane (IsoFlo 100 % p/p Inhalation Vapor, liquide) | Zoetis | 115095 | |
| Microvette 300 Héparine de lithium LH, 300 & micro ; L | Sarstedt Ltd | 20.1309 | Tube de prélèvement de sang de souris |
| NOD. souris Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris ; | Rivière Charles ; | ||
| Pancoll humain, Densité : 1,077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| Pénicilline-Streptomycine ; | Gibco | 15140122 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Gibco | 14190169 |
Références
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Réimpressions et autorisations
