Article de méthode

Un flux de travail pour l’évaluation quantitative des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes de l’écorce de Populus trichocarpa

DOI :

10.3791/66318

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27 juin 2025

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1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente un flux de travail fiable et efficace, de la collecte d’échantillons à l’analyse des données, pour le profilage des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes présents dans l’écorce de Populus trichocarpa.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les micro-organismes qui colonisent les surfaces et les tissus internes des plantes peuvent avoir des fonctions bénéfiques dans la promotion de la croissance et de la santé des plantes. Cependant, les informations sur le microbiome des tissus de l’écorce des plantes ligneuses restent limitées, notamment en ce qui concerne le microbiote bactérien endophyte et épiphyte de l’écorce de Populus. Pour pallier cette limitation, nous avons mis en place un flux de travail permettant de quantifier la composition et la diversité du microbiote bactérien endophyte et épiphyte colonisant l’écorce de Populus trichocarpa. Brièvement, l’épiderme de la tige de P. trichocarpa a été essuyé à plusieurs reprises avec une boule de coton trempée dans 0,1 % de Tween 20 pour obtenir des échantillons de bactéries épiphytes. L’épiderme dénudé a été stérilisé, puis congelé et broyé à plusieurs reprises à l’aide d’azote liquide et d’un batteur à billes, respectivement, pour prélever des échantillons de bactéries endophytes. L’ADN génomique a été extrait des communautés bactériennes épiphytes adhérées au coton et de l’écorce broyée de P. trichocarpa, et a subi une amplification par réaction en chaîne de la ploymérase (PCR) avec des amorces ciblant les régions hypervariables V5-V7 et V4 du gène de l’ARNr bactérien 16S. Trois répétitions des produits PCR obtenus de chaque échantillon endophytique ou épiphyte ont été mélangées à des concentrations égales pour constituer la bibliothèque d’amplicons, qui a ensuite été séquencée. Les séquences obtenues ont été analysées par épissage de séquence, filtrage de qualité, élimination de chimères et annotations taxonomiques. En résumé, nous avons établi un flux de travail fiable et efficace, de la collecte des échantillons à l’analyse des données, afin de déterminer les microbiomes bactériens endophytes et épiphytes de l’écorce de P. trichocarpa grâce au profilage génétique de l’ARNr 16S. Avec les méthodes d’exploration du microbiote colonisant les écorces établies dans l’étude précédente, notre méthodologie peut servir de modèle pour la conception de protocoles d’étude du microbiome de l’écorce d’autres espèces de plantes ligneuses, en particulier les arbres des forêts économiquement importants.

Introduction

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L’écorce est la couche la plus externe des tiges des plantes ligneuses, faisant référence à tous les tissus à l’extérieur du cambium vasculaire, y compris le phloème et le périderme 1,2. Des recherches approfondies ont démontré que l’écorce joue un rôle central dans la translocation de l’eau et des glucides, la protection des arbres contre les incendies et les dommages mécaniques3, et l’adaptation aux stress abiotiques4et biotiques5. Plus important encore, en tant qu’interface entre un arbre et l’air environnant, l’écorce sert également d’habitat unique aux micro-organismes6. Notamment, il a été confirmé que les microbes associés à l’écorce possèdent les fonctions de favoriser la croissance de l’hôte7, d’aider les arbres à acquérir des nutriments8, d’améliorer la synthèse des hormones végétales9 et de protéger les hôtes contre l’infection par phytopathogène5. Cependant, beaucoup moins d’attention a été accordée aux communautés microbiennes qui colonisent l’écorce par rapport au microbiote de la phyllosphère et des rhizopshere10,11. Il existe peu de connaissances sur les caractéristiques biologiques du microbiome de l’écorce des arbres. L’objectif du présent article méthodologique est de fournir aux chercheurs un ensemble de protocoles pour décrire la diversité et la composition du microbiome bactérien endophyte et épiphyte de l’écorce de plante ligneuse.

Sur la base des méthodes publiées pour l’étude du microbiote de l’écorce12,13 dans ce travail, nous avons conçu et testé un flux de travail élaboré basé sur l’analyse du séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S pour explorer le microbiome bactérien qui s’installe dans les tissus internes ou les surfaces de l’écorce de la tige de Populus trichocarpa, un organisme modèle important utilisé en biologie des plantes ligneuses14. P. trichocarpa présente les caractéristiques d’une croissance rapide15, d’une relative facilité de manipulation expérimentale16 et d’une transformation génétique facile, et est également connu pour sa large application dans la production de bois17. Plus précisément, la méthode proposée dans ce travail commence par une description détaillée de l’échantillonnage du microbiote endophyte et épiphyte de l’écorce de la tige de P. trichocarpa. Avec l’inclusion d’une étape de stérilisation de surface de l’écorce avec de l’alcool et de l’hypochlorite de sodium après la récolte du microbiome colonisant la surface, cette étude a établi une procédure pour collecter simultanément et séparément les micro-organismes résidant dans la structure interne de l’écorce (endophytes) et ceux vivant sur la surface externe de l’écorce (épiphytes). À notre connaissance, parmi les études publiées sur le microbiome de l’écorce des plantes ligneuses, aucun dosage n’a été réalisé sur les communautés microbiennes endophytes et épiphytes prélevées sur le même échantillon d’écorce sur la base d’une distinction nette faite entre les niches intérieures et extérieures de l’écorce 18,19,20 . Ainsi, la méthode développée dans cette recherche permettra aux chercheurs d’examiner la diversité et la composition des communautés bactériennes habitant l’écorce de manière précise et exhaustive. De plus, cette étude fournit des descriptions détaillées des procédures d’extraction de l’ADN génomique, d’amplification de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la préparation de la bibliothèque de séquençage d’amplicon du gène 16S21 et de l’analyse des données de séquençage. En particulier, cette étude a utilisé une paire d’amorces ciblant les régions hypervariables V5-V7 du gène de l’ARNr bactérien 16S pour réduire l’amplification non spécifique des séquences mitochondriales et chloroplastes des plantes hôtes22, ce qui a produit des profils non biaisés du microbiome associé à l’écorce. Les α-diversités ont été évaluées à l’aide de l’indice de Shannon23, un indice de diversité populaire largement utilisé dans la recherche en écologie, et la composition taxonomique au niveau de l’embranchement a été calculée et visualisée dans le logiciel Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24et R25. Avec les méthodes d’exploration du microbiote colonisant les écorces établies dans l’étude précédente 1,6, notre méthodologie peut servir de modèle pour la conception de protocoles d’étude du microbiome de l’écorce d’autres espèces de plantes ligneuses, en particulier les arbres forestiers économiquement importants.

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Protocole

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1. Prélèvement d’échantillons

  1. Cultivez P, 3 mois.jeunes plants de trichocarpa dans une chambre de croissance (21–25 °C ; cycle de lumière de 16 h/cycle d’obscurité de 8 h avec une lumière supplémentaire d’environ 300 μEm−2 s−1 provenant d’une lampe fluorescente linéaire à trois bandes [T5 28 W 6400 K] et 60–80 % d’humidité)26.
  2. Coupez les segments de tige de 10 cm de long de P. trichocarpa de 2 à 12 cm au-dessus de la surface du sol stérilisé (figure 1A) à l’aide d’un sécateur stérilisé. Placez les segments de tige dans une boîte de Pétri carrée stérilisée (13 cm x 13 cm).
    REMARQUE : Six arbres de la même taille ont été sélectionnés pour cette étude, dont trois ont été utilisés pour l’amplification de la PCR avec chaque ensemble d’amorces.

2. Traitement des échantillons

  1. Essuyez à plusieurs reprises l’épiderme de la tige sur la boîte de Pétri carrée stérilisée à l’aide d’un coton-tige stérile trempé dans 0,1 % de Tween 20 afin de recueillir plus efficacement les microorganismes qui colonisent la surface de l’écorce (figure 1B).
    REMARQUE : Des cotons stériles subhumides sont utilisés pour collecter les micro-organismes adhérant à la surface de la tige. N’utilisez pas de coton trop sec ou trop humide lorsque vous essuyez la surface de la tige. Tween 20 est un tensioactif capable de réduire la tension superficielle, une propriété bénéfique pour obtenir plus d’échantillons microbiens à partir des surfaces végétales27,28.
  2. Coupez l’embout de coton de l’écouvillon à l’aide d’une lame stérile et placez chaque embout de coton contenant des échantillons microbiens épiphytes dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml. Conservez les échantillons à −80 °C.
  3. Après avoir essuyé la surface de la tige, ouvrez l’écorce à partir de laquelle les micro-organismes épiphytes ont été prélevés à l’aide d’un scalpel stérile, décollez l’écorce et placez-la dans une boîte de Pétri carrée.
  4. Coupez l’écorce retirée de la tige à l’étape 2.3 en segments d’environ 1 cm (figure 1C) à l’aide d’un scalpel stérile.
  5. Stérilisez les segments en les trempant dans de l’alcool à 70 % (v/v) pendant 2 min. Ensuite, trempez les segments dans de l’hypochlorite de sodium (2,5 % de chlore efficace) complété par 0,1 % de Tween 80 pendant 5 min.
  6. Stériliser les segments obtenus à l’étape 2.5 pendant 30 s dans de l’alcool à 70 % (v/v)29. Ensuite, lavez tous les échantillons trois fois avec de l’eau distillée stérile et placez-les sur une paillasse propre pour les faire sécher à l’air.
    REMARQUE : Les échantillons d’écorce sont agités d’avant en arrière à l’aide d’une pince à épiler stérile pour assurer une stérilisation de surface suffisante.
  7. Conserver chaque segment d’écorce de tige stérilisé en surface (échantillons endophytes) dans un tube à centrifuger stérile de 2 mL à −80 °C.

3. Extraction de l’ADN génomique

  1. Effectuez les étapes suivantes pour prétraiter les échantillons pour l’extraction de l’ADN.
    1. Placez les segments d’écorce de tige stérilisés en surface obtenus à l’étape 2.7 dans des tubes durs stériles de 5 mL et ajoutez trois billes d’acier stérilisé (4 mm) dans chaque tube.
      REMARQUE : Effectuez cette étape sur un banc propre pour éviter la contamination microbienne. Les boules de coton préparées à l’étape 2.2 (échantillons épiphytes) n’ont pas besoin d’être prétraitées et sont directement utilisées pour l’extraction de l’ADN génomique.
    2. Congelez les tubes durs contenant les échantillons dans de l’azote liquide pendant 10 min.
    3. Écrasez les échantillons d’écorce pendant 5 min à l’aide d’un batteur à billes. Ensuite, congelez à nouveau le tube dur dans de l’azote liquide pendant 1 min et répétez l’étape de battage des billes pendant 5 min.
  2. Extraire l’ADN génomique.
    REMARQUE : Utilisez un kit d’extraction d’ADN commercial pour isoler l’ADN génomique des échantillons endophytes et épiphytes.
    1. Ajouter l’écorce de tige broyée de P. Trichocarpa et les communautés bactériennes épiphytes adhérant au coton (0,25 g chacune) à chacun des tubes de billes. Ajouter ensuite 60 μL de solution C1 fournie par un kit commercial et mélanger délicatement par inversion.
    2. Ensuite, homogénéisez les échantillons endophytes et épiphytes à l’aide d’un batteur de billes en quatre cycles de 1 minute. Après chaque passage, placez les échantillons sur de la glace pendant 30 s.
    3. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 1 min.
    4. Extraire les échantillons endophytes et épiphytes à l’aide d’un kit (voir Tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
    5. Ajouter 30 μL de solution C6 au centre de la membrane filtrante blanche et incuber à 25 °C pendant 5 min.
    6. Centrifugeuse à 10 000 x g à température ambiante pendant 1 min.

4. Amplification par PCR

  1. Normalisez la concentration d’ADN extraite.
    1. Mesurer les concentrations de l’ADN génomique extrait d’échantillons épiphytes et endophytes à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume.
    2. Diluer chaque échantillon d’ADN avec de la ddH2O stérile à 2 ng/μL pour obtenir la matrice d’ADN pour l’amplification par PCR.
  2. Amplifiez ces échantillons d’ADN.
    1. Amplifier la région V5-V7 du gène bactérien de l’ARNr 16S à l’aide de l’amorce directe 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') et de l’amorce inverse 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. Amplifier la région V4 du gène de l’ARNr bactérien 16S à l’aide de l’amorce directe 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') et de l’amorce inverse 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      REMARQUE : L’ADN génomique extrait de chaque échantillon est utilisé comme matrice pour chacune des réactions d’amplification de la PCR triplées, et une réaction supplémentaire ne contenant pas d’ADN est définie comme contrôle négatif. Pour chaque échantillon, le volume du mélange réactionnel PCR est de 25 μL. Pour la paire d’amorces 799F/1193R, chaque réaction contient 12 μL d’eau PCR, 1 μL de chacune des amorces F/R (10 μM), 1 μL de matrice d’ADN et 10 μL de solution mélangée. Pour la paire d’amorces 515F/806R, chaque réaction contient 12 μL d’eau PCR, 1 μL de chacune des amorces F/R (10 μM), 1 μL de matrice d’ADN et 10 μL de solution de mélange. Les réactions PCR avec la paire d’amorces 799F/1193R sont réalisées dans les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 98 °C pendant 5 min, 25 cycles de 98 °C pendant 30 s, 53 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 45 s, et une extension finale à 72 °C pendant 5 min. Les réactions PCR avec la paire d’amorces 515F/806R sont réalisées dans les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 94 °C pendant 3 min, 35 cycles à 94 °C pendant 45 s, 50 °C pendant 60 s et 72 °C pendant 90 s, et une extension finale pendant 10 min à 72 °C.
    2. Mélangez soigneusement chaque échantillon et centrifugez-le pour éliminer les bulles.
    3. Effectuez l’amplification de la région V5-V7 ou V4 des gènes bactériens de l’ARNr 16S sur un thermocycleur.
  3. Détecter les produits amplifiés.
    1. Chargez 5 μL de chaque amplicon sur un gel d’agarose à 1 % et effectuez une électrophorèse à 120 V pendant 30 min.
    2. Visualisez le gel sous la lumière UV pour valider l’amplification réussie de la PCR. Les tailles des produits PCR obtenus avec les paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R doivent être d’environ 430 pb et 400 pb, respectivement.

5. Préparation de la bibliothèque de séquençage d’amplicons

  1. Mélangez les produits amplifiés et déterminez leurs concentrations.
    1. Mélangez les produits générés à partir des trois répétitions de l’amplification PCR pour chaque échantillon dans un tube PCR.
    2. Ajouter 5 μL de produits PCR et 195 μL de solution de travail dans un puits d’une microplaque à 96 puits conformément aux instructions du fabricant pour le kit (voir le tableau des matériaux). Ensuite, ajoutez 10 μL de l’ADN standard (réactifs d’ADN avec des concentrations de 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 ng/μL du kit) et 190 μL de solution de travail dans un puits de la même microplaque. Suite à cette étape, déterminez l’intensité de fluorescence des produits de PCR et de l’ADN standard.
    3. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques.
      REMARQUE : L’excitation/émission des longueurs d’onde standard de fluorescéine est réglée à 480/530 nm pour mesurer la quantité d’ADN double brin dans chaque échantillon.
    4. Établir la courbe standard des concentrations d’ADN et des intensités de fluorescence à l’aide des concentrations d’ADN standard des solutions d’ADN standard (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 et 100 ng/μL) et de l’intensité de fluorescence de chacune des solutions d’ADN standard. Substituez la valeur de l’intensité de fluorescence de chacun des produits PCR dans la courbe standard pour calculer les concentrations d’ADN des produits PCR.
  2. Créez des bibliothèques de séquençage d’amplicons.
    1. Selon les concentrations détectées à l’étape 5.1.4, mélanger les produits de PCR restants amplifiés par la même paire d’amorces à des concentrations égales pour constituer la bibliothèque de séquençage d’amplicons.
      REMARQUE : La fraction des produits PCR de chaque échantillon utilisée pour quantifier la concentration de l’ADN double brin en mesurant l’intensité de la fluorescence n’est pas incluse dans la bibliothèque de séquençage d’amplicons, qui est construite à partir des produits PCR restants du même échantillon.
  3. Effectuez l’extraction du gel.
    1. Effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide d’un appareil d’électrophorèse. En bref, préparer un gel d’agarose à 1,3 % (c.-à-d. 1,3 g de poudre d’agarose dans 100 mL de 1 tampon TAE).
      REMARQUE : On veille à ce que la quantité de puits dans le gel soit suffisante pour contenir chaque produit de PCR et chaque échelle d’ADN. Dans cette étude, un gel d’agarose à 1,3 % est préparé en dissolvant 1,3 g de poudre d’agarose dans 100 mL de 1 tampon TAE.
    2. Retirez les rayons après la solidification du gel et placez le gel dans un réservoir d’électrophorèse avec 1 x tampon TAE. Ensuite, ajoutez 1 unité de volume de 6 tampons de chargement orange à 5 unités de volume de chaque produit PCR, avec 100 μL de ce dernier chargés dans chaque puits. Ajoutez 30 μL de l’échelle d’ADN dans un puits. Après avoir connecté les fils positif et négatif, effectuez une électrophorèse à 80 V pendant 50 min.
      REMARQUE : Dans cette étude, l’extraction sur gel est utilisée pour purifier la bibliothèque de séquençage d’amplicons représentée par la bande de 400 pb ou 430 pb amplifiée avec la paire d’amorces 515F/806R ou 799F/1193R, respectivement.
    3. Excisez des fragments d’ADN du gel d’agarose à l’aide d’un scalpel propre et tranchant.
    4. Pesez la tranche de gel et transférez-la dans un tube incolore. Ajoutez un tampon pour immerger la tranche de gel.
      REMARQUE : La quantité maximale de gel par colonne d’essorage est de 400 mg. Trois unités de volume de tampon sont ajoutées à une unité de volume d’une tranche de gel donnée.
    5. Effectuez l’extraction du gel à l’aide du kit d’extraction de gel (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE : La banque d’amplicons construite à partir des produits de la PCR ciblant le gène de l’ARNr bactérien 16S utilisé pour le séquençage des communautés bactériennes endophytes et épiphytes est obtenue par cette méthode.
  4. Confirmez la qualité de la bibliothèque de séquençage d’amplicon purifié.
    1. Déterminer la concentration d’ADN double brin dans la banque de séquençage d’amplicons purifiés obtenue à l’étape 5.3.5 par un fluorimètre à l’aide d’un kit commercial (voir le Tableau des matériaux) en suivant le protocole du fabricant (figure 2).
    2. Déterminer la taille du fragment d’ADN cible de la banque de séquençage d’amplicons obtenue à l’étape 5.3.5 à l’aide d’un système d’analyse de contrôle de la qualité des acides nucléiques avec des puces et des kits commerciaux (voir la Table des matériaux) en suivant le protocole du fabricant.
      REMARQUE : Assurez-vous que la taille du fragment se situe dans la plage attendue et qu’il n’y a pas de dimères d’amorce dans la bibliothèque de séquençage d’amplicons.
    3. Déterminer la concentration efficace de la banque de séquençage obtenue à l’étape 5.3.5 en utilisant la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) avec un kit commercial (voir le tableau des matériaux) en suivant le protocole du fabricant.
    4. Diluer la bibliothèque de séquençage d’amplicons pour atteindre la concentration de charge recommandée pour la plateforme de séquençage.

6. Traitement séquentiel et analyse statistique

  1. Après séquençage de la bibliothèque d’amplicons obtenue à l’étape 5.4.4 à l’aide d’une plate-forme de séquençage (voir la table des matériaux)31. Créez un dossier nommé emp-paired-end-sequences dans le répertoire de travail, puis enregistrez le fichier de séquençage compressé au format fastq dans ce dossier. Ouvrez ensuite Ubuntu et activez l’environnement conda et Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Écrivez un fichier de mappage et enregistrez-le en tant que fichier texte. Le contenu du fichier est indiqué dans le Tableau 2.
  3. Divisez les données de séquençage obtenues avec la bibliothèque de séquençage d’amplicons et supprimez les amorces des données de séquençage à l’aide du fichier de mappage.
    1. Utilisez la commande suivante pour diviser les données de séquençage : time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Utilisez la commande suivante pour enlever les amorces : time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F ou 515F --p-front-r 1193R ou 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Filtrez et supprimez toute chimère à l’aide du pipeline DADA233. Regroupez les séquences filtrées en variantes de séquences d’amplicons (ASV) avec une similarité de 99 %.
    1. Utilisez la commande suivante pour filtrer et supprimer les séquences de chimères et de clusters dans les ASV : time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Réaliser des annotations taxonomiques à l’aide de la base de données SILVA (v138) sur la base des séquences de référence34.
    1. Utilisez la commande suivante pour annoter les ASV obtenus à l’étape 6.4 : time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Créez une table ASV dans QIIME2 (v2021.2) à l’aide des commandes suivantes :
    outils qiime export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    outils qiime export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomie --sc-separated taxonomie
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomie
    REMARQUE : Ces commandes génèrent une table contenant le nombre de lectures de tous les ASV pour chaque échantillon.
  7. Calculez le nombre d’ASV et les lectures des communautés bactériennes endophytes et épiphytes générées avec les paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R, respectivement.
    1. Calculer le nombre total d’ASV ayant ≥ 1 lecture aux niveaux de l’embranchement, de la classe, de l’ordre, de la famille et du genre, respectivement, dans chaque échantillon du tableau des ASV obtenu à l’étape 6.6 en comptant.
    2. Calculez le nombre total de lectures dans chaque échantillon en fonction de la somme du nombre de lectures de tous les ASV de la table ASV obtenue à l’étape 6.6 en comptant.
    3. Calculer le nombre de lectures de plantes dans chaque échantillon en utilisant le nombre de lectures de VCA annotées comme chloroplastes ou mitochondries dans le tableau des VCA obtenu à l’étape 6.6 en comptant.
    4. Calculez le nombre de lectures bactériennes dans chaque échantillon à l’aide de la formule suivante :
      Nombre de lectures bactériennes = Nombre de lectures totales − Nombre de lectures de plantes.
    5. Calculez et visualisez le nombre moyen d’ASV (aux niveaux de l’embranchement, de la classe, de l’ordre, de la famille et du genre, respectivement) ou des lectures (au total ou de la plante et des bactéries, respectivement) des communautés bactériennes endophytes et épiphytes générées par les paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R à l’aide des logiciels Excel (2019) et Prism (v8.0).
    6. Évaluez la signification des différences entre les nombres d’ASV (aux niveaux de l’embranchement, de la classe, de l’ordre, de la famille et du genre, respectivement) ou des lectures (au total ou de la plante et des bactéries, respectivement) générées avec les paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R en utilisant le test t de Student dans le logiciel Prism (v8.0).
  8. Filtrez les lectures annotées comme chloroplastes et mitochondries à l’aide de la commande suivante : time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomie taxonomy.qza --p-exclude mitochondries, chloroplaste --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Créez un arbre phylogénétique à l’aide de la commande suivante : time qiime phylogénie align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Calculez et visualisez les diversités alpha représentées par l’indice de Shannon des communautés bactériennes endophytes et épiphytes à l’aide du QIIME2 (v2021.2) et du package 'ggplot2' dans R (v4.0.5)35.
    1. Utilisez la commande suivante pour calculer les diversités alpha : time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth la valeur de lecture la plus basse parmi tous les échantillons --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Calculer l’abondance relative des populations au niveau de l’embranchement des communautés bactériennes endophytes et épiphytes. Générez un fichier au format qzv nommé « taxa-bar-plots » en utilisant la commande suivante de QIIME2 (v2021.2) : time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Ouvrez le fichier taxa-bar-plots.qzv en ligne à l’adresse https://view.qiime2.org/. Téléchargez et enregistrez le fichier nouvellement généré à partir du niveau 2. Calculez l’abondance relative à l’aide de la formule suivante avec R (v4.0.5) :
      Abondance relative de chaque embranchement bactérien ( %) = (nombre de lectures de chaque embranchement bactérien dans chaque échantillon / nombre total de lectures de chaque échantillon) x 100 %.
      Visualisez les données à l’aide des packages ggplot2, RColorBrewer, reshape et ggalluvial dans R (v4.0.5).
  12. Analysez la signification de la différence entre l’abondance relative de chacun des embranchements dominants (définis comme un embranchement possédant une abondance relative de > 0,5 %) dans les communautés bactériennes endophytes et épiphytes séquencées avec la paire d’amorces 799F/1193R en utilisant l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec le test post-hoc de Tukey à un niveau de signification de 0,05 dans le logiciel STAMP36.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADN génomique de haute qualité des microbiomes bactériens endophytes et épiphytes de l’écorce de P. trichocarpa a été obtenu à l’aide du protocole optimisé (Tableau 1). L’amplification par PCR des 12 échantillons a permis d’obtenir des bandes fortes uniques de la bonne taille (figure 3). Les deux paires d’amorces 799F/1193R et 515F/806R ont amplifié avec succès les produits cibles à partir d’échantillons de tissus d’écorce endophy...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Développé à partir de la méthodologie publiée pour l’examen du microbiote de l’écorce 7,18, le flux de travail que nous proposons fournit des orientations générales pour identifier et caractériser les microbiomes endophytes et épiphytes de l’écorce des plantes ligneuses. Cette méthode comprend des protocoles pour la collecte et le traitement d’échantillons, l’extraction d’ADN génomique, l’amplification par PCR, la préparation de ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions M. David Anthony Atherton pour avoir fourni la narration vidéo et les membres du laboratoire B.N. pour leurs précieux conseils. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de Chine (numéro de subvention 32071741 [à BN]), les projets clés du plan de R&D dans la région autonome ouïgoure du Xinjiang (numéro de subvention 2022B02014), le plan d’introduction « Tianchi Talents » (à BN), le programme national de R&D clé de Chine (numéro de subvention 2021YFD2200203 [à GQ]), et le projet d’innovation du Laboratoire clé d’État de génétique et de sélection des arbres (Université forestière du Nord-Est) (numéro de subvention 2019A01 [à BN]).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement :
Batteurde billes DHS Life Science401265
Centrifugeuse pour tubes de 1,5 mLThermo Scientific75002440
Centrifugeuse pour tubes
Lecteur de microplaquesBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Technology Co., Ltd.2010/2020  ;spectrophotomètre à microvolume
Fluorimètre Qubit 3.0  ;fluorimètre invitrogenQ33216  ;
Réfrigérateur(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 ThermocycleurBio-Rad1861096Thermocycleur
Tanon EPS-600  ;TanonA-179047-2313Pour l’électrophorèse
LabChip GX Touch HTPerkinBibliothèque CLS138625 ElmerDétection de la distribution des fragments d’ADN, analyse du contrôle de la qualité des acides nucléiques
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694Bibliothèque de quantification
Illumina Novaseq6000Illumina  ;Séquençage de la bibliothèque
Matériaux :
GantsN’importe quel
10 &mu ; LAxygenTF-300-R-S
embout barrière aérosol 20&mu ; LAxygenTF-20-R-S
embout barrière anti-aérosol 200&mu ; LAxygenTF-200-R-S
bombe anti-aérosol tipr 1000&mu ; LAxygenTF-1000-R-S
tube à centrifuger 1,5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96 puits Noir/Transparent Microplaque à fond platCorning3631
bâton de cotonZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN  ;12888-100Pour l’extraction de l’ADN
tube à centrifuger sans enzyme 1,5 mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
éthanolTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
tubes durs(5 ml)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix  ;Quanta Bio2200400
microcentrifugeuse tube 2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR EauQIAGEN  ;17000-10
QIAquick Kit d’extraction de gel  ;QIAGEN28704Pour l’extraction de gel
Quant-iT dsDNA Kits de dosage, Large gammeInvitrogenQ33130Pour la détermination de la concentration des produits amplifiés et des bibliothèques d’amplicons purifiés
Boîte de Pétri carréeChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
billes d’acierShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
YXB36985 solution d’hypochlorite de sodiumTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd  ;7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Kit de réactifs d’ADN haute sensibilité à double protocolePerkinElmerCLS760672Détection de la bibliothèque d’ADN
VAHTS Kit de quantification pour IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104Bibliothèque de quantification
PCR embout de barrière anti-aérosol NA

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Microbiome de l corcebact ries endophytesbact ries piphytess quen age de l ARNr 16Sextraction d ADNamplification par PCRbiblioth que d ampliconslectrophor se sur gel d agarosediversit microbienne

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