Occlusion LAD déclenchée à distance à l’aide d’un cathéter à ballonnet chez des souris respirant spontanément

Résumé

Cet article présente une technique unique de placage fermé pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI) chez la souris. La méthode présentée permet aux souris de respirer spontanément tout en induisant à distance une ischémie myocardique. Cela permet d’accéder à l’animal pour étudier les processus dynamiques d’ischémie et de reperfusion in situ et en temps réel via l’imagerie non invasive.

Résumé

L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une maladie cardiovasculaire répandue et à forte mortalité. Malgré les progrès réalisés dans les stratégies de revascularisation de l’IAM, celle-ci entraîne fréquemment des lésions d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI), amplifiant les lésions cardiaques. Les modèles murins sont des outils essentiels pour étudier à la fois les lésions aiguës et le remodelage myocardique chronique in vivo. Cette étude présente une technique unique de thorax fermé pour induire à distance l’IRI myocardique chez la souris, permettant d’étudier la phase très précoce de l’occlusion et de la reperfusion à l’aide de l’imagerie in vivo telle que l’IRM ou la TEP. Le protocole utilise une méthode d’occlusion à distance, permettant un contrôle précis de l’initiation de l’ischémie après la fermeture de la poitrine. Il réduit les traumatismes chirurgicaux, permet la respiration spontanée et améliore la cohérence expérimentale. Ce qui distingue cette technique, c’est son potentiel pour l’imagerie non invasive simultanée, y compris l’échographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), pendant les événements d’occlusion et de reperfusion. Il offre une occasion unique d’analyser les réponses tissulaires en temps quasi réel, fournissant des informations essentielles sur les processus pendant l’ischémie et la reperfusion. Des tests systématiques approfondis de cette approche innovante ont été menés, mesurant les marqueurs de nécrose cardiaque pour l’infarctus, évaluant la zone à risque à l’aide de l’IRM avec contraste et colorant les infarctus au stade de maturation de la cicatrice. Dans le cadre de ces recherches, l’accent a été mis sur la valeur de l’outil proposé pour faire progresser les approches de recherche sur les lésions d’ischémie-reperfusion myocardique et accélérer le développement d’interventions ciblées. Les résultats préliminaires démontrant la faisabilité de combiner le protocole expérimental innovant proposé avec des techniques d’imagerie non invasives sont présentés ici. Ces premiers résultats mettent en évidence l’avantage de l’utilisation du berceau spécialement conçu pour induire à distance une ischémie myocardique tout en effectuant simultanément des examens IRM.

Introduction

L’infarctus aigu du myocarde (IAM), une maladie cardiovasculaire répandue dans le monde, est associé à des taux de mortalité et de morbidité élevés¹. Malgré les progrès technologiques qui ont permis des stratégies de revascularisation précoces et efficaces pour les patients atteints d’IAM, les patients présentent toujours des lésions d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI) après ces interventions². Par conséquent, il est crucial de comprendre les mécanismes fondamentaux et de formuler des approches pour atténuer l’IRI. L’IRI représente un état physiopathologique complexe impliquant une multitude de processus biologiques complexes. Ceux-ci englobent la mort cellulaire régulée, les réponses au stress oxydatif, l’inflammation, la cicatrisation des plaies, la fibrose et le remodelage ventriculaire. Les modèles animaux, tels que les souris, ont joué un rôle d’une grande importance dans la recherche IRI et sont largement utilisés en raison de leur rentabilité, de leur reproduction rapide et de la richesse des informations mécanistes provenant de modèles transgéniques³.

Ce protocole présente une technique innovante pour induire à distance l’IRI chez des souris à respiration spontanée avec une poitrine fermée, imitant plus étroitement la pathologie humaine. L’occlusion à distance a été réalisée à l’aide d’un cathéter à ballonnet positionné à une distance du myocarde pour obstruer l’artère descendante antérieure gauche (DAL). Cette approche offre un accès continu au cœur battant aux moments exacts de l’occlusion et de la reperfusion, facilitant ainsi les modalités d’imagerie simultanées, y compris l’échographie ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces méthodes non invasives pourraient fournir des informations cruciales sur les réponses tissulaires avant, pendant et après les événements d’occlusion et de reperfusion.

Diverses techniques chirurgicales existent pour induire l’IRI dans des modèles murins. Les traumatismes chirurgicaux résultant d’une thoracotomie dans des modèles de ligature coronarienne à poitrine ouverte déclenchent une réponse immunitaire ayant un impact sur divers mécanismes associés à l’ischémie et à la reperfusion. L’activation du système immunitaire inné a le potentiel d’influencer l’étendue de l’infarctus du myocarde⁴. La technique adaptée proposée fournit une approche potentielle pour explorer le pré- et post-conditionnement myocardique et éventuellement réduire l’impact de la réponse immunitaire innée aux traumatismes chirurgicaux dans les études IRI murines en minimisant le délai d’ouverture du thorax à un maximum de 5 min. De plus, la technique nouvellement développée pourrait également contribuer à réduire les séquelles pro-inflammatoires causées par les lésions pulmonaires induites par la ventilation⁵. Cependant, les effets combinés de cette nouvelle méthode de poitrine fermée nécessiteraient des recherches plus approfondies.

Une validation approfondie de la technique proposée a été effectuée en la comparant à la méthode traditionnelle, qui consiste à exposer le DAL par une dissection thoracique chirurgicale et une occlusion induite par la ligature pendant 30 min. Les résultats des deux techniques ont été comparés, notamment les mesures de troponine reflétant la taille de l’infarctus cardiaque, les évaluations de la zone à risque à l’aide de l’IRM avec amélioration du contraste au gadolinium, la coloration histologique au chlorure de triphényle tétrazolium (TTC) et la détermination de la taille finale des cicatrices par coloration Sirius Red (SR). Les résultats démontrent la robustesse et l’efficacité de l’approche proposée pour l’étude des lésions d’ischémie-reperfusion dans des modèles murins.

Protocole

Ce protocole sur les animaux a été approuvé et est conforme aux directives et règlements établis par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale (ECD) de l’Université catholique de Louvain. Toutes les politiques élaborées par l’ECD local suivent les réglementations de l’Union européenne concernant le bien-être des animaux de laboratoire, telles que déclarées dans la directive 2010/63/UE. Tous les tests décrits ci-dessous ont été réalisés sur des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 12 semaines (poids corporel = 20-23 g). Les expériences aiguës représentent des animaux qui ont été immédiatement sacrifiés après l’opération. Les expériences de survie représentaient un suivi de quatre semaines, comprenant la mesure de la troponine, l’IRM et la coloration SR.

1. Anesthésie et intubation endotrachéale

1. Administrer un médicament pré-anesthésique à l’aide d’un mélange de kétamine (7,5 mg/kg ; Nimatek 100 mg/mL), xylazine (1 mg/kg ; Rompun, 20 mg/mL) et l’acépromazine (0,1 mg/kg ; Placivet, 10 mg/mL) (KXA) (voir tableau des matières) avec 0,9 % de diluant salin par voie intrapéritonéale. Cela permet une intubation plus douce et moins invasive.
2. Placez la souris dans une chambre d’induction (voir tableau des matériaux) et invoquez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 2,5 % dans de l’oxygène pur avec un débit de 1 L/min jusqu’à la perte du redressement et le réflexe de pincement des orteils.
3. Transférez l’animal dans un coussin chauffant (±38 °C) et positionnez-le en décubitus dorsal, la tête vers le chirurgien. Fixez la queue et les pattes avant avec du ruban adhésif sur le coussin. Assurez-vous que les membres avant ne sont pas trop étirés, car cela peut compromettre la respiration.
4. Placez une suture en soie 2-0 (voir Tableau des matériaux) autour des incisives supérieures et collez la suture sur le bord du coussinet pour tendre la souris. Si nécessaire, fixez un porte-aiguille pour maintenir la tension sur la suture. Maintenir l’animal anesthésié à l’aide d’isoflurane à 2 % dans 100 % d’oxygène avec un débit de 1 L/min à l’aide d’un cône nasal.
5. Placez une source de lumière juste à la rostrale du sternum, retirez le cône nasal et placez l’alimentation en isoflurane sur le ventilateur. Intubez la souris à l’aide d’une pince en soulevant la langue vers le haut et en tenant un laryngoscope fait maison pour soulever davantage la partie basale de la langue et visualiser les cordes vocales.
6. Placez un tube trachéal fabriqué par vous-même à l’aide d’un cathéter de 18 G sur une aiguille émoussée entre les cordes vocales. Remontez le cathéter, extrayez l’aiguille émoussée et connectez le tube au ventilateur de souris (voir le tableau des matériaux).
7. Utilisez un connecteur en forme de Y modifié (voir le tableau des matériaux) pour connecter le tube d’intubation au ventilateur. Le positionnement correct de la sonde trachéale peut être confirmé en jugeant de l’expansion symétrique de la poitrine.
8. Réglez le volume courant (mL) au poids corporel (p.c.) (g) x 7 et le taux de ventilation à 53,5 x (p.c. (g)^-0,26) coups par minute, et ajustez-le au poids corporel d’une souris particulière si nécessaire⁶ (p. ex., pour une souris de 25 g, le volume courant est de 175 mL à 140 coups par minute).
9. Réduire l’isoflurane à 1% dans 100% d’oxygène, car l’animal restera anesthésié en raison de la prémédication. Cependant, évaluez régulièrement la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement des orteils. Adaptez la concentration d’isoflurane en fonction de la profondeur de l’anesthésie.
10. Appliquez une goutte de pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.

2. Installation de l’outil IRI

REMARQUE : Retirez tout le ruban adhésif et placez l’animal sur la plaque de base de l’outil IRI spécialement conçu. Des détails sur les propriétés de l’outil IRI sont mentionnés dans le fichier supplémentaire 1.

1. Fixez la plaque de base de l’outil IRI à distance spécialement conçu dans une position latérale devant le chirurgien. Fixez la queue et les pattes à l’aide de ruban adhésif. Fixez la tête à l’aide de la suture en soie 2-0 autour des incisives supérieures pour éviter tout mouvement accidentel (Figure 1).
2. Insérez la sonde thermique rectale (voir tableau des matériaux) pour surveiller la température corporelle et utilisez une lampe chauffante infrarouge au-dessus de l’animal pour maintenir la température autour de 37 °C. Faites attention à une distance suffisante entre l’animal et la lampe pour éviter la surchauffe.
3. Positionnez les électrodes de l’aiguille ECG dans les quatre pattes pour observer et enregistrer la fréquence cardiaque et la forme d’onde de l’ECG. Fixez la sonde rectale et les électrodes ECG à la plate-forme à l’aide de ruban adhésif.
4. Appliquez de la crème dépilatoire sur le côté gauche du thorax pour éliminer les poils et créer un champ opératoire clair.
   REMARQUE : Limitez le temps d’application et faites attention à l’élimination complète de la crème pour éviter les brûlures chimiques.

3. Thoracotomie

1. Effectuez une préparation aseptique de la peau à l’aide d’une solution de bétadine, puis placez un champ chirurgical sur le thorax gauche pour assurer un environnement stérile. Utilisez du matériel stérilisé pour effectuer la procédure. Faites une incision cutanée verticale au milieu de la partie du muscle pectoral d’environ 1 cm de long et à 2 mm du bord sternal gauche.
2. Crachez le muscle pectoral pour exposer les côtes en dessous. Évitez de blesser accidentellement le navire. En cas de saignement, utilisez des applicateurs en coton pour arrêter tout saignement.
3. Visualisez les côtes et identifiez les espaces intercostaux en observant le poumon qui se gonfle à travers la paroi thoracique mince et semi-transparente. Ouvrez la cavité thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux en faisant une incision de 6 à 8 mm dans le troisième espace intercostal. Assurez-vous que l’incision est à au moins 2 mm du bord sternal où se trouve l’artère thoracique interne.
4. Insérez un petit spéculum œil de rat (voir Tableau des matériaux) dans l’espace intercostal. Il fonctionnera comme un écarteur de côtes (Figure 1A).
5. Soulevez doucement le péricarde à l’aide d’une pince incurvée et séparez-le.
6. Placez un petit morceau de coton sur le dessus du poumon et poussez doucement vers le bas.

4. Préparation du DAL

1. Le DAL apparaît rouge vif et s’étend de l’aorte sous l’oreillette gauche vers l’apex. Le positionnement idéal de la ligature est d’environ 2 mm plus bas que l’extrémité de l’oreillette gauche. Utilisez le tronc pulmonaire comme marqueur pour aider à identifier le pavillon gauche et optimiser la visualisation du DAL à l’aide de l’afflux de lumière (Figure 2).
2. À l’aide d’une aiguille effilée, passez une suture en polypropylène 7-0 autour du DAL. Ne placez pas l’aiguille trop profondément, car elle peut pénétrer dans le ventricule gauche, ni trop peu profonde, car elle peut endommager le DAL.
3. Retirez le petit morceau de coton et vérifiez si le poumon gauche est toujours ventilé.
4. Retirez l’écarteur de nervures.
5. Assurez-vous que la suture est d’une longueur minimale de 15 cm aux deux extrémités. Coupez l’aiguille.
6. Placez un morceau de tube PE-50 de 1 mm sur un morceau de tube PE-10 de 15 mm (voir le tableau des matériaux). Guidez les deux extrémités de la suture à travers le tube PE-10 et déplacez le tube PE avec son extrémité plus épaisse contre le cœur.

5. Fermeture de la poitrine et extubation

1. Appliquez un peu de gel d’acide fusidique sur l’espace intercostal ouvert et laissez doucement l’air intrathoracique restant s’échapper en obstruant brièvement l’écoulement du ventilateur. Du gel d’acide fusidique supplémentaire peut être ajouté à la partie externe du tube PE pour empêcher l’entrée d’air dans le thorax.
2. Fermez le muscle pectoral avec un point X en polypropylène 5-0 au-dessus et en dessous du niveau du tube PE, et assurez-vous que la partie épaissie du tube PE se trouve sous le niveau du muscle.
3. Fermez la peau à l’aide de deux points de suture 5-0 en polypropylène X au-dessus et deux en dessous du tube PE (Figure 1B et Figure 3).
4. Avec une poitrine fermée, l’animal peut à nouveau respirer spontanément. Sevrez l’animal du ventilateur en réduisant lentement le volume courant et la fréquence respiratoire. Lorsque l’animal commence à respirer, débranchez spontanément et soigneusement le tube du ventilateur, mais maintenez-le en place jusqu’à ce qu’un schéma respiratoire stable soit observé.
5. Connectez l’alimentation en isoflurane avec un cône de nez qui est placé sur le nez de l’animal et fixé sur la plaque de base.

6. Montage de l’outil IR à distance

1. Placez la partie latérale verticale dans la plaque de base en l’insérant dans les fentes.
2. À l’aide d’un crochet fin, récupérez les deux extrémités de la suture et tirez-les à travers le trou central dans la partie latérale derrière le ballon (voir le tableau des matériaux).
3. Guidez l’une des extrémités des sutures au-dessus et autour du ballonnet. Poursuivez avec l’autre extrémité de suture sous et autour du ballon. Appliquez du gel d’acide fusidique pour un guidage plus fluide de la suture.
4. Guidez les extrémités de la suture à travers les fentes sur le dessus de la partie latérale. Sur la partie distale de la suture, appliquez un poids de 2,1 g pour maintenir chaque extrémité de suture en place (Figure 1C et Figure 4).
   REMARQUE : La configuration des poids appropriés est sujette à changement et doit être testée au préalable. Voir la figure supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails. La conception de l’outil IRI à distance est fournie dans la figure supplémentaire 2.

7. Induction de l’ischémie et de la reperfusion

1. Induire une ischémie en gonflant rapidement le ballonnet à l’aide de la pompe à ballonnet vasculaire jusqu’à 2 bars. Verrouillez la pompe. Vérifiez visuellement si le ballon est gonflé et si les poids sont soulevés (Figure 4).
2. Confirmez l’ischémie en observant la modification du tracé ECG.
3. Laissez le ballon gonflé pendant le temps défini selon le protocole d’étude spécifique (30 min dans les expériences présentées).
4. Arrêtez l’occlusion en déverrouillant simplement la pompe. Dégonflez le ballon avec précaution. Vérifiez visuellement si le ballon est dégonflé et si les poids sont abaissés.

8. Démontage de l’outil IR à distance

1. Coupez la suture et le tube entre l’animal et la partie latérale et retirez soigneusement la partie latérale.
2. Appliquez du gel d’acide fusidique au site d’insertion de la tubulure dans le thorax. Utilisez une pince incurvée pour pousser doucement la peau contre le tube et utilisez une autre pince pour extraire le tube. Coupez toute suture restante près de la peau.
3. Placez une suture supplémentaire en polypropylène 5-0 pour fermer le site de sortie du tube et minimiser le risque d’entrée d’air dans le thorax.

9. Fin de la narcose et rétablissement

1. Arrêtez l’approvisionnement en isoflurane et laissez l’animal se réveiller dans un environnement silencieux, chaud et riche en oxygène.
2. Confirmez que la souris n’est pas en détresse respiratoire en l’observant jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Fournir 0,3 mL de solution saline stérile (à la température du corps) par injection intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation.
3. Pour l’analgésie postopératoire, administrer un analgésique opioïde (buprénorphine, 0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée avant que l’animal ne soit ambulatoire. Vérifiez les souris toutes les 4 à 6 heures pendant les 24 à 48 heures suivantes lorsque la buprénorphine est administrée pour vous assurer que les souris répondent aux analgésiques et pour déterminer si des analgésiques supplémentaires sont nécessaires. Un soutien supplémentaire doit inclure un régime de soins de soutien standard, un gel ou une purée placés sur le sol de la cage après l’opération.

Résultats

La validation de la capacité à induire une ischémie a été réalisée par quatre tests : la coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC) et au rouge Sirius (SR), la mesure de la troponine cardiaque I et l’imagerie IRM d’amélioration tardive du gadolinium (LGE). La signification statistique a été évaluée à l’aide du test non paramétrique de Mann-Whitney, compte tenu de la taille limitée des échantillons. La signification statistique a été attribuée à p < 0,05.

Les expériences aiguës (coloration TTC, n = 15) n’ont pas connu de défaillance technique, et tous les animaux ont été inclus. Ces expériences aiguës comprenaient des expériences de suivi immédiat (troponine cardiaque I, IRM LGE, coloration rouge Sirius, n = 12) et ont eu un taux de survie de 85 % et 80 % pour les techniques d’occlusion à distance et standard, respectivement, pendant une période de 4 semaines.

Coloration au chlorure de triphényltétrazolium
La coloration TTC (chlorure de triphényltétrazolium) dans un modèle murin de lésion d’ischémie-reperfusion dans le cœur mesure macroscopiquement le phénomène de viabilité myocardique en montrant la perte de fonction de l’enzyme déshydrogénase. Cette méthode de coloration permet de distinguer les zones du cœur qui sont encore viables (vivantes) et celles qui sont devenues non viables en raison de l’ischémie. Le myocarde viable se colore en rouge avec le TTC, tandis que la zone ischémique reste pâle ou non colorée car l’enzyme déshydrogénase n’est plus fonctionnelle. Cela fournit des informations essentielles sur l’étendue des lésions tissulaires tôt après le début de l’ischémie. La coloration a été réalisée pour les groupes IRI standard (n = 7) et IRI à distance (n = 8) immédiatement après 30 min d’ischémie. La figure 5 montre des tranches colorées représentatives pour un animal, avec des tranches de tissu traversant de la base vers l’apex. Les résultats de coloration TTC sont présentés à la figure 6 et ne montrent aucune différence significative entre les deux techniques IRI. La coloration TTC a été réalisée comme décrit par Fishbein et ^al.7.

IRM tardive d’amélioration du gadolinium
Pour mesurer de manière non invasive l’étendue de l’aire ischémique, l’IRM LGE a été utilisée 24 heures après l’occlusion pour les groupes IRI standard (n = 5) et IRI à distance (n = 5). Les détails de l’acquisition sont fournis dans le dossier supplémentaire 1. La zone à risque est mesurée comme le % de tissu du ventricule gauche dans les trois tranches les plus apicales qui dépasse les critères de seuil détaillés dans le fichier supplémentaire 1. La représentation graphique de la figure 7 montre qu’aucune différence significative n’a été observée entre la nouvelle technique d’occlusion à distance proposée et la méthode conventionnelle de la « poitrine ouverte » lors de l’évaluation des mesures de la zone à risque.

Coloration rouge Sirius
L’infarctus du myocarde, conséquence de l’ischémie myocardique, pose un problème sérieux pour les personnes souffrant d’ischémie, car il entraîne une réduction de la masse contractile du cœur, ce qui nuit à sa capacité à pomper efficacement le sang. La figure 8 explique davantage les résultats en utilisant la coloration Sirius Red 4 semaines après l’occlusion pour confirmer l’emplacement de la formation de la cicatrice en fonction de la zone à risque décrite par l’IRM LGE et mesurer l’étendue du tissu cicatriciel. La coloration a été réalisée pour les groupes IRI standard (n = 5) et IRI à distance (n = 5). Des zones rouge vif marquent le noyau nécrotique de l’infarctus, tandis que les parties orange marquent le tissu viable. Enfin, la figure 9 présente les tailles finales des cicatrices mesurées à l’aide de la coloration Sirius Red sur les deux techniques. La taille de la cicatrice est calculée en divisant la surface de l’infarctus coloré par la surface totale de la paroi libre du ventricule gauche dans la plaque de coupe de tissu apical d’une épaisseur de 2,4 mm. La coloration Sirius Red a été réalisée selon Rittié⁸.

Troponine cardiaque I
En plus des techniques d’imagerie et de coloration, l’étude a également évalué les lésions cardiaques en utilisant la troponine cardiaque I comme marqueur. Des échantillons de sang ont été prélevés 24 h après l’intervention chirurgicale pour les groupes IRI standard (n = 8) et IRI à distance (n = 8). La figure 10 présente la valeur de la troponine cardiaque I, ne montrant aucune différence significative lorsque l’on compare la nouvelle technique d’occlusion à distance à la technique IRI standard.

Pour démontrer la faisabilité du concept proposé, des résultats préliminaires de l’induction d’une ischémie à partir d’un emplacement éloigné avec une imagerie non invasive simultanée sont également fournis. Cela a été réalisé en utilisant l’outil d’occlusion à distance personnalisé, qui a été placé dans le berceau de l’animal IRM et positionné au centre de l’appareil d’IRM. Les résultats présentés à la figure 11 montrent des différences de contraste d’image (niveaux de luminosité) entre les régions infarctus et non infarctus. La figure 12B présente le tracé ECG montrant une élévation typique du segment ST comme marqueur confirmant la réussite de l’occlusion du DAL pendant que l’animal est positionné dans le scanner IRM, tandis que la figure 12A montre le tracé ECG avant l’occlusion.

Cette approche globale fournit une compréhension détaillée des effets de la nouvelle technique d’occlusion à distance proposée sur l’ischémie, la nécrose et les lésions cardiaques dans le modèle expérimental par rapport à la méthode conventionnelle de la « poitrine ouverte ».

Figure 1 : Images représentatives démontrant la préparation de l’animal telle que décrite dans le protocole. (A) Thoracotomie avec insertion d’un écarteur de côtes. (B) Fermeture du thorax à l’aide d’un tube PE-10 sortant du thorax et guidant la suture autour du DAL. (C) Positionnement de l’animal à l’intérieur de l’outil IRI à distance assemblé. Notez les deux poids de 2,1 g qui serrent chaque extrémité de la suture et reposent sur la partie latérale du berceau IRI à distance. La partie latérale est positionnée et maintenue en place par les découpes dans la plaque de base de l’outil. Le cathéter à ballonnet vasculaire est dégonflé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Visualisation ex vivo du DAL (flèche blanche) et du pavillon gauche (flèche noire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vue schématique de haut en bas du dispositif expérimental, illustrant la position de l’outil utilisé pour l’occlusion à distance. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Schéma illustrant l’utilisation de l’outil pour l’occlusion à distance depuis une vue latérale. (A) Dès le début de l’opération, l’animal est placé sur la partie inférieure. Après avoir fermé le coffre, la partie latérale est installée en place. À ce stade, le ballonnet est toujours dégonflé et les poids reposent sur la partie inférieure. (B) Le gonflage du cathéter à ballonnet soulèvera les poids (marqués de flèches) et provoquera l’occlusion du DAL avec ischémie ultérieure au myocarde. Une occlusion réussie est observée dans les modifications du tracé ECG. Le dégonflage du ballon rétablira le flux sanguin à travers le LAD. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images représentatives de tranches de cœur de souris colorées au chlorure de triphényltétrazolium (TTC). Les tranches se déplacent de la base au sommet de gauche à droite, en commençant par la rangée supérieure. (A) IRI standard. (B) IRI à distance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Résultats de la coloration TTC. Une coloration TTC a été réalisée 24 h après l’occlusion pour mesurer la taille de l’infarctus. Les points de données sont présentés sous forme de moyennes avec le MEB des groupes IRI standard (n = 7) et IRI à distance (n = 8). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : IRM tardive d’amélioration du gadolinium. Zone à risque 24 h après l’occlusion, telle que délimitée sur trois tranches les plus apicales (sans compter l’apex lui-même) obtenues par IRM LGE. Les points de données sont présentés sous forme de moyennes avec MEB des groupes IRI standard (n = 5) et IRI distant (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Validation du dispositif d’occlusion à distance par IRM après la procédure d’ischémie/reperfusion. Comparaison représentative entre la zone à risque telle que délimitée dans les images RM LGE à 1 jour après l’occlusion et le tissu cicatriciel définitif coloré au Sirius Red à 4 semaines après l’occlusion. (A-B) Tranches à axe court d’un animal avec occlusion à distance et sur banc, respectivement. La flèche indique la zone à risque délimitée. (C-D) Les coupes histologiques colorées au Sirius Red des mêmes animaux respectifs confirment que la formation finale de la cicatrice correspond à la délimitation de la zone à risque par IRM 24 h après l’occlusion. VG = ventricule gauche. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9 : Résultats de la coloration Sirius Red. La coloration Sirius Red a été réalisée 4 semaines après l’occlusion pour mesurer l’étendue de la formation de cicatrices. Les points de données sont présentés sous forme de moyennes avec MEB des groupes IRI standard (n = 5) et IRI distant (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Quantification de la concentration de troponine I cardiaque dans le sérum de souris obtenue 24 heures après l’occlusion. Les points de données de cTnI sont présentés sous forme de moyennes avec le MEB des groupes IRI standard (n = 8) et IRI distant (n = 8). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Les résultats préliminaires obtenus en utilisant l’outil d’occlusion à distance proposé en combinaison avec l’acquisition simultanée de l’IRM sont présentés. La même tranche médio-ventriculaire dans l’orientation de l’axe court d’un animal avant, au moment et peu de temps après la présentation de l’occlusion. À gauche, la tranche d’image représentative montre les bords du myocarde au début de l’expérience (avant de déclencher l’IRI). Au milieu, la même tranche sur un axe court est montrée après 30 min d’ischémie induite à distance. Le chlorure de manganèse (MnCl) a été utilisé comme agent de contraste pour mettre en évidence la région infarctus (marquée en jaune). La luminosité a été ajustée manuellement et saturée pour mettre en évidence les différentes régions tissulaires. Notez la différence de luminosité entre la cloison septale et la paroi libre latérale (marquée en jaune). Sur la droite, en utilisant les mêmes paramètres de luminosité que précédemment, la même tranche à axe court est affichée à 20 min après l’occlusion (étape de reperfusion). La flèche indique la région avec une luminosité accrue par rapport au moment de l’occlusion, stipulant l’absorption de l’agent de contraste au stade de la reperfusion et le rétrécissement de la région hypointense initiale telle que délimitée au moment de l’occlusion. VG = ventricule gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Trace ECG capturée à l’aide du système de surveillance IRM pour confirmer l’apparition de l’ischémie. (A) Trace ECG normale capturée avant l’occlusion à distance. (B) Trace ECG capturée juste après le gonflage du ballonnet chez le même animal. La flèche indique l’élévation du segment ST, généralement considérée comme un marqueur de l’apparition réussie de l’ischémie. Une augmentation des fréquences cardiaques et respiratoires, en plus d’une diminution de l’amplitude du signal, est également observée. L’animal est positionné au centre de l’IRM aux stades d’occlusion et de reperfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Configuration des poids. Tracé de tous les poids en fonction du déplacement du dynamomètre à l’aide du système de télécommande du ballon (bleu) vs. Le système de poulie original (orange). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Conception de l’outil IRI à distance. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1 : Détails sur les propriétés de l’outil IRI et les techniques d’acquisition et d’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La nouvelle technique d’occlusion à distance introduite dans cette étude offre une plate-forme unique pour faire progresser la recherche dans le domaine de la modélisation des lésions d’ischémie-reperfusion en évitant la nécessité d’une manipulation directe des vaisseaux lors de la chirurgie initiale et en permettant une imagerie multimodale simultanée du myocarde reperfusé précocement. Une caractérisation complète, y compris les mesures de troponine I, l’IRM de contraste LGE, la TTC et la coloration SR, montre que la technique proposée est équivalente à l’étalon-or actuel (c’est-à-dire la ligature DAL thoracique ouverte)⁹.

La technique proposée présente de multiples avantages par rapport à l’approche traditionnelle de ligature LAD « ouverte ». Principalement, il réduit le temps d’ouverture d’une poitrine pendant l’opération à seulement 15 minutes, par opposition au temps d’occlusion (30-60 min) plus le temps chirurgical (15 min) requis dans l’approche traditionnelle. Cette chirurgie à cœur ouvert minimisée peut atténuer les dommages tissulaires et l’inflammation, mais nécessiterait une enquête plus approfondie. De plus, la fermeture précoce de la thoracotomie permet le sevrage du ventilateur, permettant ainsi une respiration spontanée sous isoflurane pendant les expériences d’ischémie-reperfusion. Cela a le potentiel de réduire les lésions pulmonaires induites par la ventilation et l’inflammation associée, tout en permettant une réponse plus précise sur le plan physiologique à l’ischémie myocardique et à la reperfusion¹⁰.

De plus, la technique d’occlusion à distance offre un meilleur contrôle sur le moment exact de l’induction de l’ischémie. En tant que preuve de concept, la faisabilité et les résultats préliminaires de l’induction et du contrôle à distance de l’ischémie myocardique ont été démontrés, alors que l’animal était positionné au centre du scanner IRM. La capacité d’initier avec précision une ischémie après la fermeture de la poitrine permet aux chercheurs de planifier des interventions thérapeutiques ou des investigations supplémentaires et de synchroniser l’agression ischémique entre les sujets expérimentaux. Ce contrôle accru peut conduire à une induction plus précise et plus cohérente de l’IRI, ce qui est essentiel pour les études mécanistes et thérapeutiques. Néanmoins, l’extension marginale de l’inhalation d’isoflurane pendant l’IRM cardiaque pourrait constituer une limite à cette étude. À savoir, une exposition prolongée à l’isoflurane pourrait avoir des effets cardioprotecteurs supplémentaires, comme l’ont démontré des études sur des murins, et nécessiterait des recherches plus approfondies pour le modèle proposé¹¹.

La variation de l’étendue des lésions induites est un défi courant dans les modèles IRI, résultant souvent de différences dans l’exécution chirurgicale ou d’anatomie variable¹². Il est important de noter qu’une formation adéquate du chirurgien aura un impact sur les taux de mortalité dans ce modèle au-delà d’autres variables reconnues telles que le placement du DAL, la durée de l’expérience, les souches de souris et les antécédents génétiques¹³. Le choix des agents anesthésiques et analgésiques peut également influencer les résultats. Par expérience, ce modèle présente un taux de mortalité global proche de 15%. La mise en œuvre d’une gestion rigoureuse de la douleur et d’une surveillance vigilante des animaux peut réduire encore plus la mortalité.

L’une des orientations convaincantes indiquées par ce travail est l’application potentielle de la technique d’occlusion à distance dans l’évaluation des interventions thérapeutiques dans les premières phases de l’occlusion ou de la reperfusion.

En conclusion, la technique d’occlusion à distance représente une avancée prometteuse dans la modélisation de l’IRI, affinant potentiellement les études mécanistes et accélérant les thérapies ciblées. Sa capacité à réduire les traumatismes chirurgicaux, à améliorer le contrôle du moment de l’ischémie et à améliorer la cohérence expérimentale souligne son importance. En explorant davantage l’adaptabilité de la technique, les chercheurs peuvent libérer tout son potentiel et contribuer à une compréhension plus précise des phases précoces de l’induction de l’ischémie, de la reperfusion et des lésions d’ischémie-reperfusion qui l’accompagnent. De plus, l’effet de différentes stratégies de traitement peut maintenant être observé au cours de ces étapes initiales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-0 suture en soie	Sharpoint Products	DC-2515N
5-0 suture en polypropylène	Ethicon	8710H
7-0 suture en polypropylène	Ethicon	8206H
ACCLARENT Balloon Gonfle	Device Johnson& Johnson MedTech	BID30
Acépromazine	Kela
BD Vialon 18 G	BD	381347
BD Vialon 20 G	BD	381334
Bétadine Solution	Purdue Pharma	25655-41-8
Buprénorphine (Buprenex injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (plomb de pêche)	Visdeal.nl
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Ciseaux fins	Fine Science Tools	14040-10
Fucidine gel	Leo Pharma
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
KD Spéculum Oeil de Souris/Rat World	Precision Instruments	501897
Spéculum Oeil de Rat KD	World Precision Instruments	501897
Ketamine	Dechra
Source lumineuse	Zeiss	KL 1500
;	Bruker BioSpin, Ettlingen, Allemagne	BioSpec 70/30
NatriumChloride 0,9 %	nocturne Baxter
	Zoo Med Laboratories, Inc.	Logiciel RS-75
ParaVision  ;	Bruker BioSpin	version 6.0.1  ;
Tube en polyéthylène PE-10	SAI Technologies d’infusion	PE-10
Tube en polyéthylène PE-50	SAI Technologies d’infusion	PE-50
outil IRI à distance (PMMA)
	Indus instruments
Segment v4.0	Medviso, segment.heiberg.se	R12067
Séquence d’écho de gradient auto-déclenchée  ;	Bruker BioSpin, Ettlingen, Allemagne	IntraGate, ParaVision 6.0.1
Porte-aiguille allongé mince	Outils de science fine	12005-15
Sure-Seal Mouse/Rat Chambre	d’induction World Precision Instruments	EZ-178
Connecteurs de tubes, poly, forme en Y	Westlab	072025-0001
Cathéter de dilatation Ultraverse 035 PTA : 5 mm x 40 mm, ballonnet RBP 17 ATM sur cathéter de 130 cm de long	Bard Peripheral Vascular, Inc.
Veet (crème dépilatoire)	Reckitt Benkiser Healthcare
Ventilator, MiniVent Modèle 845	Hugo Sachs	73-0043
Vidisic	BAUSCH & LOMB PHARMA	685313
Xylazine	Bayer

Système IRM LCD Lampe chauffante infrarouge moniteur chirurgical pour rongeurs fait maison 00801741092671