Cet article présente une technique unique de placage fermé pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI) chez la souris. La méthode présentée permet aux souris de respirer spontanément tout en induisant à distance une ischémie myocardique. Cela permet d’accéder à l’animal pour étudier les processus dynamiques d’ischémie et de reperfusion in situ et en temps réel via l’imagerie non invasive.
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Article de méthode
Occlusion LAD déclenchée à distance à l’aide d’un cathéter à ballonnet chez des souris respirant spontanément
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une maladie cardiovasculaire répandue et à forte mortalité. Malgré les progrès réalisés dans les stratégies de revascularisation de l’IAM, celle-ci entraîne fréquemment des lésions d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI), amplifiant les lésions cardiaques. Les modèles murins sont des outils essentiels pour étudier à la fois les lésions aiguës et le remodelage myocardique chronique in vivo. Cette étude présente une technique unique de thorax fermé pour induire à distance l’IRI myocardique chez la souris, permettant d’étudier la phase très précoce de l’occlusion et de la reperfusion à l’aide de l’imagerie in vivo telle que l’IRM ou la TEP. Le protocole utilise une méthode d’occlusion à distance, permettant un contrôle précis de l’initiation de l’ischémie après la fermeture de la poitrine. Il réduit les traumatismes chirurgicaux, permet la respiration spontanée et améliore la cohérence expérimentale. Ce qui distingue cette technique, c’est son potentiel pour l’imagerie non invasive simultanée, y compris l’échographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), pendant les événements d’occlusion et de reperfusion. Il offre une occasion unique d’analyser les réponses tissulaires en temps quasi réel, fournissant des informations essentielles sur les processus pendant l’ischémie et la reperfusion. Des tests systématiques approfondis de cette approche innovante ont été menés, mesurant les marqueurs de nécrose cardiaque pour l’infarctus, évaluant la zone à risque à l’aide de l’IRM avec contraste et colorant les infarctus au stade de maturation de la cicatrice. Dans le cadre de ces recherches, l’accent a été mis sur la valeur de l’outil proposé pour faire progresser les approches de recherche sur les lésions d’ischémie-reperfusion myocardique et accélérer le développement d’interventions ciblées. Les résultats préliminaires démontrant la faisabilité de combiner le protocole expérimental innovant proposé avec des techniques d’imagerie non invasives sont présentés ici. Ces premiers résultats mettent en évidence l’avantage de l’utilisation du berceau spécialement conçu pour induire à distance une ischémie myocardique tout en effectuant simultanément des examens IRM.
Introduction
L’infarctus aigu du myocarde (IAM), une maladie cardiovasculaire répandue dans le monde, est associé à des taux de mortalité et de morbidité élevés1. Malgré les progrès technologiques qui ont permis des stratégies de revascularisation précoces et efficaces pour les patients atteints d’IAM, les patients présentent toujours des lésions d’ischémie-reperfusion myocardique (IRI) après ces interventions2. Par conséquent, il est crucial de comprendre les mécanismes fondamentaux et de formuler des approches pour atténuer l’IRI. L’IRI représente un état physiopathologique complexe impliquant une multitude de processus biologiques complexes. Ceux-ci englobent la mort cellulaire régulée, les réponses au stress oxydatif, l’inflammation, la cicatrisation des plaies, la fibrose et le remodelage ventriculaire. Les modèles animaux, tels que les souris, ont joué un rôle d’une grande importance dans la recherche IRI et sont largement utilisés en raison de leur rentabilité, de leur reproduction rapide et de la richesse des informations mécanistes provenant de modèles transgéniques3.
Ce protocole présente une technique innovante pour induire à distance l’IRI chez des souris à respiration spontanée avec une poitrine fermée, imitant plus étroitement la pathologie humaine. L’occlusion à distance a été réalisée à l’aide d’un cathéter à ballonnet positionné à une distance du myocarde pour obstruer l’artère descendante antérieure gauche (DAL). Cette approche offre un accès continu au cœur battant aux moments exacts de l’occlusion et de la reperfusion, facilitant ainsi les modalités d’imagerie simultanées, y compris l’échographie ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces méthodes non invasives pourraient fournir des informations cruciales sur les réponses tissulaires avant, pendant et après les événements d’occlusion et de reperfusion.
Diverses techniques chirurgicales existent pour induire l’IRI dans des modèles murins. Les traumatismes chirurgicaux résultant d’une thoracotomie dans des modèles de ligature coronarienne à poitrine ouverte déclenchent une réponse immunitaire ayant un impact sur divers mécanismes associés à l’ischémie et à la reperfusion. L’activation du système immunitaire inné a le potentiel d’influencer l’étendue de l’infarctus du myocarde4. La technique adaptée proposée fournit une approche potentielle pour explorer le pré- et post-conditionnement myocardique et éventuellement réduire l’impact de la réponse immunitaire innée aux traumatismes chirurgicaux dans les études IRI murines en minimisant le délai d’ouverture du thorax à un maximum de 5 min. De plus, la technique nouvellement développée pourrait également contribuer à réduire les séquelles pro-inflammatoires causées par les lésions pulmonaires induites par la ventilation5. Cependant, les effets combinés de cette nouvelle méthode de poitrine fermée nécessiteraient des recherches plus approfondies.
Une validation approfondie de la technique proposée a été effectuée en la comparant à la méthode traditionnelle, qui consiste à exposer le DAL par une dissection thoracique chirurgicale et une occlusion induite par la ligature pendant 30 min. Les résultats des deux techniques ont été comparés, notamment les mesures de troponine reflétant la taille de l’infarctus cardiaque, les évaluations de la zone à risque à l’aide de l’IRM avec amélioration du contraste au gadolinium, la coloration histologique au chlorure de triphényle tétrazolium (TTC) et la détermination de la taille finale des cicatrices par coloration Sirius Red (SR). Les résultats démontrent la robustesse et l’efficacité de l’approche proposée pour l’étude des lésions d’ischémie-reperfusion dans des modèles murins.
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Protocole
Ce protocole sur les animaux a été approuvé et est conforme aux directives et règlements établis par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale (ECD) de l’Université catholique de Louvain. Toutes les politiques élaborées par l’ECD local suivent les réglementations de l’Union européenne concernant le bien-être des animaux de laboratoire, telles que déclarées dans la directive 2010/63/UE. Tous les tests décrits ci-dessous ont été réalisés sur des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 12 semaines (poids corporel = 20-23 g). Les expériences aiguës représentent des animaux qui ont été immédiatement sacrifiés après l’opération. Les expériences de survie représentaient un suivi de quatre semaines, comprenant la mesure de la troponine, l’IRM et la coloration SR.
1. Anesthésie et intubation endotrachéale
- Administrer un médicament pré-anesthésique à l’aide d’un mélange de kétamine (7,5 mg/kg ; Nimatek 100 mg/mL), xylazine (1 mg/kg ; Rompun, 20 mg/mL) et l’acépromazine (0,1 mg/kg ; Placivet, 10 mg/mL) (KXA) (voir tableau des matières) avec 0,9 % de diluant salin par voie intrapéritonéale. Cela permet une intubation plus douce et moins invasive.
- Placez la souris dans une chambre d’induction (voir tableau des matériaux) et invoquez l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 2,5 % dans de l’oxygène pur avec un débit de 1 L/min jusqu’à la perte du redressement et le réflexe de pincement des orteils.
- Transférez l’animal dans un coussin chauffant (±38 °C) et positionnez-le en décubitus dorsal, la tête vers le chirurgien. Fixez la queue et les pattes avant avec du ruban adhésif sur le coussin. Assurez-vous que les membres avant ne sont pas trop étirés, car cela peut compromettre la respiration.
- Placez une suture en soie 2-0 (voir Tableau des matériaux) autour des incisives supérieures et collez la suture sur le bord du coussinet pour tendre la souris. Si nécessaire, fixez un porte-aiguille pour maintenir la tension sur la suture. Maintenir l’animal anesthésié à l’aide d’isoflurane à 2 % dans 100 % d’oxygène avec un débit de 1 L/min à l’aide d’un cône nasal.
- Placez une source de lumière juste à la rostrale du sternum, retirez le cône nasal et placez l’alimentation en isoflurane sur le ventilateur. Intubez la souris à l’aide d’une pince en soulevant la langue vers le haut et en tenant un laryngoscope fait maison pour soulever davantage la partie basale de la langue et visualiser les cordes vocales.
- Placez un tube trachéal fabriqué par vous-même à l’aide d’un cathéter de 18 G sur une aiguille émoussée entre les cordes vocales. Remontez le cathéter, extrayez l’aiguille émoussée et connectez le tube au ventilateur de souris (voir le tableau des matériaux).
- Utilisez un connecteur en forme de Y modifié (voir le tableau des matériaux) pour connecter le tube d’intubation au ventilateur. Le positionnement correct de la sonde trachéale peut être confirmé en jugeant de l’expansion symétrique de la poitrine.
- Réglez le volume courant (mL) au poids corporel (p.c.) (g) x 7 et le taux de ventilation à 53,5 x (p.c. (g)-0,26) coups par minute, et ajustez-le au poids corporel d’une souris particulière si nécessaire6 (p. ex., pour une souris de 25 g, le volume courant est de 175 mL à 140 coups par minute).
- Réduire l’isoflurane à 1% dans 100% d’oxygène, car l’animal restera anesthésié en raison de la prémédication. Cependant, évaluez régulièrement la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement des orteils. Adaptez la concentration d’isoflurane en fonction de la profondeur de l’anesthésie.
- Appliquez une goutte de pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Installation de l’outil IRI
REMARQUE : Retirez tout le ruban adhésif et placez l’animal sur la plaque de base de l’outil IRI spécialement conçu. Des détails sur les propriétés de l’outil IRI sont mentionnés dans le fichier supplémentaire 1.
- Fixez la plaque de base de l’outil IRI à distance spécialement conçu dans une position latérale devant le chirurgien. Fixez la queue et les pattes à l’aide de ruban adhésif. Fixez la tête à l’aide de la suture en soie 2-0 autour des incisives supérieures pour éviter tout mouvement accidentel (Figure 1).
- Insérez la sonde thermique rectale (voir tableau des matériaux) pour surveiller la température corporelle et utilisez une lampe chauffante infrarouge au-dessus de l’animal pour maintenir la température autour de 37 °C. Faites attention à une distance suffisante entre l’animal et la lampe pour éviter la surchauffe.
- Positionnez les électrodes de l’aiguille ECG dans les quatre pattes pour observer et enregistrer la fréquence cardiaque et la forme d’onde de l’ECG. Fixez la sonde rectale et les électrodes ECG à la plate-forme à l’aide de ruban adhésif.
- Appliquez de la crème dépilatoire sur le côté gauche du thorax pour éliminer les poils et créer un champ opératoire clair.
REMARQUE : Limitez le temps d’application et faites attention à l’élimination complète de la crème pour éviter les brûlures chimiques.
3. Thoracotomie
- Effectuez une préparation aseptique de la peau à l’aide d’une solution de bétadine, puis placez un champ chirurgical sur le thorax gauche pour assurer un environnement stérile. Utilisez du matériel stérilisé pour effectuer la procédure. Faites une incision cutanée verticale au milieu de la partie du muscle pectoral d’environ 1 cm de long et à 2 mm du bord sternal gauche.
- Crachez le muscle pectoral pour exposer les côtes en dessous. Évitez de blesser accidentellement le navire. En cas de saignement, utilisez des applicateurs en coton pour arrêter tout saignement.
- Visualisez les côtes et identifiez les espaces intercostaux en observant le poumon qui se gonfle à travers la paroi thoracique mince et semi-transparente. Ouvrez la cavité thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux en faisant une incision de 6 à 8 mm dans le troisième espace intercostal. Assurez-vous que l’incision est à au moins 2 mm du bord sternal où se trouve l’artère thoracique interne.
- Insérez un petit spéculum œil de rat (voir Tableau des matériaux) dans l’espace intercostal. Il fonctionnera comme un écarteur de côtes (Figure 1A).
- Soulevez doucement le péricarde à l’aide d’une pince incurvée et séparez-le.
- Placez un petit morceau de coton sur le dessus du poumon et poussez doucement vers le bas.
4. Préparation du DAL
- Le DAL apparaît rouge vif et s’étend de l’aorte sous l’oreillette gauche vers l’apex. Le positionnement idéal de la ligature est d’environ 2 mm plus bas que l’extrémité de l’oreillette gauche. Utilisez le tronc pulmonaire comme marqueur pour aider à identifier le pavillon gauche et optimiser la visualisation du DAL à l’aide de l’afflux de lumière (Figure 2).
- À l’aide d’une aiguille effilée, passez une suture en polypropylène 7-0 autour du DAL. Ne placez pas l’aiguille trop profondément, car elle peut pénétrer dans le ventricule gauche, ni trop peu profonde, car elle peut endommager le DAL.
- Retirez le petit morceau de coton et vérifiez si le poumon gauche est toujours ventilé.
- Retirez l’écarteur de nervures.
- Assurez-vous que la suture est d’une longueur minimale de 15 cm aux deux extrémités. Coupez l’aiguille.
- Placez un morceau de tube PE-50 de 1 mm sur un morceau de tube PE-10 de 15 mm (voir le tableau des matériaux). Guidez les deux extrémités de la suture à travers le tube PE-10 et déplacez le tube PE avec son extrémité plus épaisse contre le cœur.
5. Fermeture de la poitrine et extubation
- Appliquez un peu de gel d’acide fusidique sur l’espace intercostal ouvert et laissez doucement l’air intrathoracique restant s’échapper en obstruant brièvement l’écoulement du ventilateur. Du gel d’acide fusidique supplémentaire peut être ajouté à la partie externe du tube PE pour empêcher l’entrée d’air dans le thorax.
- Fermez le muscle pectoral avec un point X en polypropylène 5-0 au-dessus et en dessous du niveau du tube PE, et assurez-vous que la partie épaissie du tube PE se trouve sous le niveau du muscle.
- Fermez la peau à l’aide de deux points de suture 5-0 en polypropylène X au-dessus et deux en dessous du tube PE (Figure 1B et Figure 3).
- Avec une poitrine fermée, l’animal peut à nouveau respirer spontanément. Sevrez l’animal du ventilateur en réduisant lentement le volume courant et la fréquence respiratoire. Lorsque l’animal commence à respirer, débranchez spontanément et soigneusement le tube du ventilateur, mais maintenez-le en place jusqu’à ce qu’un schéma respiratoire stable soit observé.
- Connectez l’alimentation en isoflurane avec un cône de nez qui est placé sur le nez de l’animal et fixé sur la plaque de base.
6. Montage de l’outil IR à distance
- Placez la partie latérale verticale dans la plaque de base en l’insérant dans les fentes.
- À l’aide d’un crochet fin, récupérez les deux extrémités de la suture et tirez-les à travers le trou central dans la partie latérale derrière le ballon (voir le tableau des matériaux).
- Guidez l’une des extrémités des sutures au-dessus et autour du ballonnet. Poursuivez avec l’autre extrémité de suture sous et autour du ballon. Appliquez du gel d’acide fusidique pour un guidage plus fluide de la suture.
- Guidez les extrémités de la suture à travers les fentes sur le dessus de la partie latérale. Sur la partie distale de la suture, appliquez un poids de 2,1 g pour maintenir chaque extrémité de suture en place (Figure 1C et Figure 4).
REMARQUE : La configuration des poids appropriés est sujette à changement et doit être testée au préalable. Voir la figure supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1 pour plus de détails. La conception de l’outil IRI à distance est fournie dans la figure supplémentaire 2.
7. Induction de l’ischémie et de la reperfusion
- Induire une ischémie en gonflant rapidement le ballonnet à l’aide de la pompe à ballonnet vasculaire jusqu’à 2 bars. Verrouillez la pompe. Vérifiez visuellement si le ballon est gonflé et si les poids sont soulevés (Figure 4).
- Confirmez l’ischémie en observant la modification du tracé ECG.
- Laissez le ballon gonflé pendant le temps défini selon le protocole d’étude spécifique (30 min dans les expériences présentées).
- Arrêtez l’occlusion en déverrouillant simplement la pompe. Dégonflez le ballon avec précaution. Vérifiez visuellement si le ballon est dégonflé et si les poids sont abaissés.
8. Démontage de l’outil IR à distance
- Coupez la suture et le tube entre l’animal et la partie latérale et retirez soigneusement la partie latérale.
- Appliquez du gel d’acide fusidique au site d’insertion de la tubulure dans le thorax. Utilisez une pince incurvée pour pousser doucement la peau contre le tube et utilisez une autre pince pour extraire le tube. Coupez toute suture restante près de la peau.
- Placez une suture supplémentaire en polypropylène 5-0 pour fermer le site de sortie du tube et minimiser le risque d’entrée d’air dans le thorax.
9. Fin de la narcose et rétablissement
- Arrêtez l’approvisionnement en isoflurane et laissez l’animal se réveiller dans un environnement silencieux, chaud et riche en oxygène.
- Confirmez que la souris n’est pas en détresse respiratoire en l’observant jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Fournir 0,3 mL de solution saline stérile (à la température du corps) par injection intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation.
- Pour l’analgésie postopératoire, administrer un analgésique opioïde (buprénorphine, 0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée avant que l’animal ne soit ambulatoire. Vérifiez les souris toutes les 4 à 6 heures pendant les 24 à 48 heures suivantes lorsque la buprénorphine est administrée pour vous assurer que les souris répondent aux analgésiques et pour déterminer si des analgésiques supplémentaires sont nécessaires. Un soutien supplémentaire doit inclure un régime de soins de soutien standard, un gel ou une purée placés sur le sol de la cage après l’opération.
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Résultats
La validation de la capacité à induire une ischémie a été réalisée par quatre tests : la coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC) et au rouge Sirius (SR), la mesure de la troponine cardiaque I et l’imagerie IRM d’amélioration tardive du gadolinium (LGE). La signification statistique a été évaluée à l’aide du test non paramétrique de Mann-Whitney, compte tenu de la taille limitée des échantillons. La signification statistique a été attribuée à p < 0,05.
Les expériences a...
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Discussion
La nouvelle technique d’occlusion à distance introduite dans cette étude offre une plate-forme unique pour faire progresser la recherche dans le domaine de la modélisation des lésions d’ischémie-reperfusion en évitant la nécessité d’une manipulation directe des vaisseaux lors de la chirurgie initiale et en permettant une imagerie multimodale simultanée du myocarde reperfusé précocement. Une caractérisation complète, y compris les mesures de troponine I, l’IRM de contraste LGE, la TTC et ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les expériences ont été réalisées à la plateforme de la KU Leuven « Molecular Small Animal Imaging Center » (MoSAIC). Les auteurs tiennent à exprimer leurs remerciements à Katarzyna Błażejczyk pour son assistance technique. La recherche a été soutenue par des subventions de recherche de la KU Leuven (C14/20/095) et de la Fondation pour la recherche - Flandre (FWO G0A7722N). M. Algoet est soutenu par la Fondation pour la Recherche - Flanders Fellowship Grant (FWO 11A2423N).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-0 suture en soie | Sharpoint Products | DC-2515N | |
| 5-0 suture en polypropylène | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 suture en polypropylène | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT Balloon Gonfle | Device Johnson& Johnson MedTech | BID30 | |
| Acépromazine | Kela | ||
| BD Vialon 18 G | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 G | BD | 381334 | |
| Bétadine Solution | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Buprénorphine (Buprenex injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g (plomb de pêche) | Visdeal.nl | ||
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Ciseaux fins | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Fucidine gel | Leo Pharma | ||
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD Spéculum Oeil de Souris/Rat World | Precision Instruments | 501897 | |
| Spéculum Oeil de Rat KD | World Precision Instruments | 501897 | |
| Ketamine | Dechra | ||
| Source lumineuse | Zeiss | KL 1500 | |
| ; | Bruker BioSpin, Ettlingen, Allemagne | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride 0,9 % | nocturne Baxter | ||
| Zoo Med Laboratories, Inc. | Logiciel RS-75 | ||
| ParaVision ; | Bruker BioSpin | version 6.0.1 ; | |
| Tube en polyéthylène PE-10 | SAI Technologies d’infusion | PE-10 | |
| Tube en polyéthylène PE-50 | SAI Technologies d’infusion | PE-50 | |
| outil IRI à distance (PMMA) | |||
| Indus instruments | |||
| Segment v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| Séquence d’écho de gradient auto-déclenchée ; | Bruker BioSpin, Ettlingen, Allemagne | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| Porte-aiguille allongé mince | Outils de science fine | 12005-15 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat Chambre | d’induction World Precision Instruments | EZ-178 | |
| Connecteurs de tubes, poly, forme en Y | Westlab | 072025-0001 | |
| Cathéter de dilatation Ultraverse 035 PTA : 5 mm x 40 mm, ballonnet RBP 17 ATM sur cathéter de 130 cm de long | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet (crème dépilatoire) | Reckitt Benkiser Healthcare | ||
| Ventilator, MiniVent Modèle 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & LOMB PHARMA | 685313 | |
| Xylazine | Bayer |
Références
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Réimpressions et autorisations
