Application de la recherche de l’onde de choc induite par laser pour l’étude des lésions cochléaires induites par le souffle

Résumé

Ici, nous décrivons des protocoles expérimentaux pour créer un modèle animal de lésion cochléaire induite par l’explosion à l’aide d’ondes de choc induites par laser (LISW). L’exposition de l’os temporal à la LISW permet la reproduction de la physiopathologie cochléaire induite par l’explosion. Ce modèle animal pourrait être une plate-forme pour élucider la pathologie cochléaire et explorer les traitements potentiels des blessures dues aux explosions.

Résumé

L’oreille est l’organe le plus sensible à la surpression d’explosion, et les lésions cochléaires surviennent fréquemment après une exposition à l’explosion. L’exposition aux explosions peut entraîner une perte auditive neurosensorielle (SNHL), qui est une perte auditive irréversible qui affecte négativement la qualité de vie. Des pathologies cochléaires détaillées induites par les blastes, telles que la perte de cellules ciliées, de neurones ganglionnaires spiralés, de synapses cochléaires et la perturbation des stéréocils, ont déjà été documentées. Cependant, il est difficile de déterminer la détérioration de la perception cochléaire après une blessure due à une explosion, car les animaux exposés à une surpression due à une explosion présentent généralement une perforation de la membrane tympanique (TMP), qui entraîne une perte auditive de transmission concomitante. Pour évaluer la dysfonction cochléaire neurosensorielle pure, nous avons développé un modèle animal expérimental de lésions cochléaires induites par l’explosion à l’aide d’une onde de choc induite par laser. Cette méthode permet d’éviter les lésions systémiques concomitantes et reproduit le déclin fonctionnel de la composante SNHL d’une manière dépendante de l’énergie après l’exposition à l’ILSW. Ce modèle animal pourrait être une plate-forme pour élucider les mécanismes pathologiques et explorer des traitements potentiels pour la dysfonction cochléaire induite par les explosions.

Introduction

La perte auditive et les acouphènes sont parmi les handicaps les plus répandus, signalés chez jusqu’à 62 % des anciens combattants¹. Plusieurs complications auditives induites par l’explosion, notamment la perte auditive neurosensorielle (SNHL) et la perforation de la membrane tympanique (TMP), ont été signalées chez des personnes exposées à une surpression explosive². De plus, des recherches sur des personnes exposées à des explosions suggèrent que l’exposition aux explosions entraîne fréquemment des défauts de la résolution auditive temporelle, même lorsque les seuils d’audition sont dans la plage normale, ce qui est connu sous le nom de « perte auditive cachée (HHL) »³. Il est bien établi qu’il y a une perte substantielle de synapses cochléaires entre les cellules ciliées internes (CCI) et les neurones auditifs (NA) dans la pathologie cochléaire liée aux blastes⁴. La dégénérescence synaptique entraîne une altération du traitement auditif et est un facteur majeur contribuant au développement de HHL⁵. Ainsi, les organes auditifs sont des composants fragiles contenant des structures complexes et très organisées. Cependant, le mécanisme précis par lequel les ondes de choc affectent l’oreille interne au niveau cellulaire reste incertain. Cela s’explique par les défis qu’il est difficile de reproduire les subtilités cliniques et mécaniques précises des lésions causées par les explosions en laboratoire et la complexité des pathologies cochléaires induites par les explosions.

L’onde de choc (SW), caractérisée par une augmentation rapide et élevée de la pression maximale⁶. La complexité des blessures causées par les explosions a fait l’objet de nombreuses études rétrospectives ^7,8,9. Il existe différents dispositifs de génération d’explosions, tels que le gaz comprimé¹⁰, les tubes de choc¹¹ et les explosifs de petite taille¹², à différents niveaux de pression. La forme d’onde de pression du SW générée par des dispositifs récemment mis au point ressemblait beaucoup à celle d’une explosion réelle. Un concept important dans l’établissement d’un modèle animal de perte auditive neurosensorielle induite par l’explosion est de minimiser les blessures concomitantes, autres que les dommages auditifs, afin de réduire la mort des animaux. Ainsi, des études sur les blessures dues aux explosions ont été développées, dans lesquelles les tubes de choc ont été miniaturisés et la sortie peut être contrôlée avec précision afin que les animaux exposés meurent rarement. Cependant, bien que ces modèles animaux développent généralement des complications, telles que la TMP, l’évaluation de la fonction cochléaire est difficile en raison de la perte auditive de transmission^{concomitante 2}. Nous avons précédemment effectué une étude sur des animaux protégés de l’oreille sur des blessures causées par une explosion à l’aide de bouchons d’oreille et n’avons trouvé aucune incidence de TMP¹³. Les bouchons d’oreille pourraient atténuer partiellement les lésions cochléaires graves, mais pas la neurodégénérescence auditive centrale ou le développement des acouphènes. Ainsi, les bouchons d’oreille protègent les cochlées ainsi que la membrane tympanique. Cependant, un modèle animal de lésions cochléaires pures induites par l’explosion sans TMP est nécessaire pour étudier la physiopathologie cochléaire causée par les lésions dues à l’explosion.

Nous avons précédemment développé un modèle topique de lésions de l’oreille interne chez des rats et des souris à l’aide d’une onde de choc induite par laser (LISW)^14,15. Cette méthode peut être mise en œuvre en toute sécurité et facilement à un niveau de laboratoire standard et a été utilisée pour générer des modèles de blessures aux poumons et à la tête par explosion de souffle^16,17. L’énergie du LISW peut être ajustée en changeant le type et la puissance du laser, ce qui permet de contrôler le degré de lésion cochléaire. Le modèle de lésion cochléaire induite par le LISW est précieux pour étudier les mécanismes de SNHL causés par les lésions dues aux explosions et pour étudier les traitements potentiels. Dans cette étude, nous décrivons des protocoles expérimentaux détaillés pour la création d’un modèle murin de lésions cochléaires induites par l’explosion à l’aide de LISW et démontrons la dégénérescence cochléaire, y compris la perte de cellules ciliées (HC), de synapses cochléaires et de neurones ganglionnaires spiralés (SGN), de manière dépendante de l’énergie chez les souris après une exposition à LISW.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Collège médical de la Défense nationale (approbation #18050) et effectuées conformément aux directives des Instituts nationaux de la santé et du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux et leur souffrance.

1. Animaux

1. Utilisez des souris mâles CBA/J de 8 semaines pour suivre ce protocole. Avant l’expérience, soumettez les souris à un test de la fonction auditive et à une observation endoscopique de la membrane tympanique pour s’assurer de la normalité.
2. Divisez 27 souris CBA/J en trois groupes : (1) groupe exposé de 2,0 J/cm² (n = 9 souris) ; (2) groupe exposé de 2,25 J/cm² (n = 9 souris) ; et (3) groupe exposé de 2,5 J/cm² (n = 9 souris). Retirez toutes les oreilles pour une évaluation 1 mois après l’exposition LISW.

2. Contextes expérimentaux de l’exposition à l’exposition à l’insu de la femme

1. La cible laser est un disque en caoutchouc naturel noir, de 10 mm de diamètre et de 0,5 mm d’épaisseur. Pour augmenter l’impulsion LISW, utilisez un adhésif de soudage à base de résine acrylique pour coller une feuille de polyéthylène téréphtalate (PET) transparente de 1,0 mm d’épaisseur au sommet de la zone cible. Irradiez un laser Nd : YAG Q-switched de 532 nm pour générer le LISW derrière la cible (Figure 1A).
2. Focalisez l’impulsion laser avec une lentille plan-convexe sur un point de 3,0 mm de diamètre sur la cible laser.
3. Utilisez l’irradiation LISW pour générer du plasma à la surface de liaison des deux matériaux et vaporiser le caoutchouc (ablation par plasma), laissant du caoutchouc vaporisé dans la cavité.
4. À l’aide d’un hydrophone, mesurez l’onde de pression de la LISW à 1,0 mm sous l’eau, et non dans les tissus vivants. Placez un hydrophone à fibre optique de 0,25 mm de diamètre sous le caoutchouc noir à 1,0 mm sous la surface de l’eau pour enregistrer les formes d’onde de pression LISW et les mesurer à l’aide d’un oscilloscope numérique.
   REMARQUE : Les formes d’onde de pression ont montré des caractéristiques stables avec une pression maximale et une impulsion similaires à celles de la figure 1B.
5. Effectuer toutes les interventions sur les animaux sous anesthésie générale à l’aide d’injections intrapéritonéales de 1 mg/kg de chlorhydrate de médétomidine et de 75 mg/kg de kétamine. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux de la souris pour éviter le dessèchement et fournir un soutien thermique.
6. Rasez soigneusement les régions postauriculaires pour éviter de retenir l’air emprisonné dans la fourrure. Fixez les souris sur une plaque et positionnez les régions postauriculaires dans la zone focale du LISW dans une direction verticale vers le haut.
7. Fixez une cible en caoutchouc noir par voie percutanée à la région postauriculaire de l’oreille de la souris. Pour assurer l’adaptation de l’impédance acoustique, utilisez un gel conducteur d’ultrasons entre la cible laser et la surface de la peau.
8. Appliquez une seule impulsion LISW sur la cochlée via l’os temporal. Réglez les sorties des impulsions laser sur trois densités d’énergie : 2,0 J/cm² , 2,25 J/cm² et 2,5 J/cm².

3. Test de la fonction cochléaire

REMARQUE : Des tests de réponse auditive du tronc cérébral (ABR) ont été effectués comme indiqué précédemment^14,15.

1. Effectuez la mesure ABR 1 jour avant et 1 jour et 1 mois après l’exposition LISW.
2. L’ABR est un potentiel évoqué auditif en réponse à des stimuli auditifs et est couramment utilisé pour évaluer les seuils auditifs à quatre fréquences (12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz et 24,0 kHz).
3. Présentez le son de stimulation sur un petit écouteur et mesurez le niveau de pression acoustique près de la membrane tympanique de la souris à l’aide d’un petit microphone placé près de l’écouteur. Émettez des stimuli en rafale à partir d’un générateur de sons à 37 cycles/s et amplifiez la pression acoustique d’un niveau de pression acoustique (SPL) de 20 dB à 80 dB SPL par incréments de 5 dB SPL.
4. Insérez une électrode à aiguille en acier inoxydable pour l’enregistrement de l’électroencéphalogramme sous le conduit auditif et la région frontale de l’oreille et insérez une électrode de terre sous la région caudale de la queue.
5. Évaluez les fonctions cochléaires en mesurant l’amplitude du pic I (P1) de l’ABR. Analysez automatiquement les formes d’onde ABR en fonction des seuils d’audition et de l’amplitude ABR P1 à l’aide du logiciel d’analyse de crête ABR, comme indiqué précédemment¹⁸.
6. Calculez les décalages de seuil ABR en soustrayant les seuils obtenus avant l’exposition. Comparez les décalages du seuil ABR dans les trois groupes exposés à ceux des oreilles controlatérales non exposées (contrôle). Mesurez les amplitudes ABR à l’aide de la forme d’onde ABR pendant une stimulation SPL de 80 dB.

4. Évaluation histologique

REMARQUE : L’évaluation histologique a été effectuée comme décrit précédemment^14,15.

1. HC et synapse cochléaire
   1. Effectuer l’examen pathologique de la cochlée 1 mois après l’exposition au LISW.
   2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils avant la perfusion. Après une hémoperfusion avec une solution de Ringer lactée, effectuer une perfusion transcardiaque avec 1 mL/g de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Après la décapitation, retirer la cochlée et perfuser directement avec 4 % de PFA, puis fixation à 4 °C pendant la nuit.
   3. Après la fixation, détartrez la cochlée en l’agitant dans une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,5 mol/L pendant 2 jours.
   4. Divisez la cochlée déminéralisée en quatre morceaux. Après avoir congelé chaque morceau de cochlée sur de la glace sèche pendant 10 min, effectuez un blocage à température ambiante pendant 1 h dans du sérum de cheval normal à 5 % simplement conjugué à 0,3 % de Triton X pour la perméabilisation.
   5. Utilisez des anticorps anti-myosine 7a (Myo7A), anti-protéine de liaison C-terminale (CtBP2) et anti-neurofilaments (NF) comme anticorps primaires et incubés à 37 °C pendant la nuit. Utilisez les anticorps Myo7A, CtBP2 et NF pour évaluer les HC, les rubans présynaptiques et les fibres nerveuses cochléaires, respectivement.
   6. Lavez l’anticorps primaire non lié avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 x 3 min. Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires appropriés à 37 °C pendant 2 h. Après la coloration, laver les échantillons pendant 3 x 5 minutes avec du PBS et encapsuler les échantillons sur le verre de la lame avec un encapsulant soluble dans l’eau à l’aide d’un verre de couverture.
   7. À des fins d’évaluation, acquérez l’image complète de la cochlée (divisée en quatre morceaux) avec un grossissement de 10x, et calculez la carte de fréquence cochléaire à l’aide du plug-in logiciel ImageJ référencé pour localiser précisément les régions cochléaires spécifiques à 12,0 kHz, 16,0 kHz, 20,0 kHz et 24,0 kHz.
   8. Calculez les taux de survie aux HC et le nombre de synapses à chaque fréquence.
      1. Pour calculer les taux de survie des HC, il faut compter le nombre de HC survivants et manquants par longueur de 200 μm à chaque fréquence, et calculer le taux de survie des HC à l’aide de l’équation (1) ci-dessous :
         Taux de survie des HC (%) = (Nombre de HC survivants / Nombre de HC survivants et disparus) × 100 (1)
      2. Pour calculer le nombre de synapses, obtenez des images haute résolution de la pile z de la zone HC interne à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile (63×) avec un zoom numérique 3,1x et une taille de pas de 0,25 μm sous microscopie à fluorescence confocale. Importez les piles d’images dans ImageJ et comptez automatiquement les points CtBP2 par IHC dans une plage de 50 μm dans chaque pile d’images. Calculez le taux de survie des rubans synaptiques à l’aide de l’équation (2) :
         Taux de survie des rubans synaptiques (%) = (Nombre de rubans synaptiques dans les oreilles exposées LISW / Nombre de rubans synaptiques dans les oreilles témoins) × 100 (2)
   9. Pour la microscopie électronique à balayage (MEB), retirez la cochlée, comme décrit précédemment, puis fixez-la avec 2 % de PFA et 2,5 % de glutaraldéhyde ensemble à 4 °C pendant la nuit. Après décalcification de la cochlée en l’agitant dans une solution d’EDTA 0,5 mol/L à 4 °C pendant 7 jours, disséquez les cochlées en quatre morceaux pour une préparation entière.
   10. Fixer les tissus avec du tétroxyde d’osmium à 1 % à 4 °C pendant 30 min, déshydrater dans de l’éthanol à 50 % à température ambiante pendant 10 min, répéter avec de l’éthanol à 70 %, 80 %, 95 %, puis à 100 %, vaporiser un revêtement avec de l’osmium et examiner au microscope électronique à 5,0 kV, comme indiqué précédemment¹⁴.
   11. Effectuer une analyse quantitative de la perturbation des faisceaux stéréociliaires dans les cellules ciliées externes (CCE) en calculant le rapport des stéréocils perturbés (nombre de stéréocils perturbés par rapport au nombre total de stéréocils des COE) dans chaque groupe d’énergie à l’aide des images MEB¹⁴. Comptez le nombre de stéréocils par 100 μm au centre des régions 16,0 et 24,0 kHz. Désignez une ou plusieurs rangées de faisceaux OHC qui sont pliés vers le côté latéral, emmêlés ou dépourvus de base comme perturbés.
2. SGN
   1. Pour évaluer quantitativement le nombre de SGN 1 mois après l’exposition au LISW, effectuer une perfusion transcardiaque avec 4% de PBS, décapiter, retirer la cochlée et effectuer une fixation postérieure dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Détartrer la cochlée en 0,5 M EDTA pendant 1 semaine.
   2. Après la décalcification, immergez les cochlées dans du saccharose à 30 % pendant la nuit, intégrez-les dans le composé de cryosectionnement, congelez-les dans de l’azote liquide pour préparer des coupes près du canal de Rosenthal à une épaisseur de 15 μm, colorez-les à l’hématoxyline et à l’éosine et observez-les au microscope optique¹⁴.
   3. Pour la mesure de la densité SGN, comptez le nombre de SGN dans le tour médian du canal de Rosenthal et calculez la survie SGN par contrôle.

5. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide du logiciel de votre choix.
2. Analysez les différences statistiques dans le décalage de seuil ABR, HC, SGN et comptage synaptique à l’aide d’une analyse de variance à deux facteurs à mesures répétées [« fréquence ou parties cochléaires (apicale/moyenne/base) » × « groupes d’animaux »], d’une analyse de variance bidirectionnelle (ANOVA), suivie d’un test de comparaison multiple de Tukey post-hoc.
3. Présentez toutes les données sous forme de moyenne ±'erreur-type et fixez le niveau de signification statistique à p < 0,05.

Résultats

Forme d’onde LISW
La reproductibilité de la forme d’onde de pression LISW a été mesurée 5x à 2,0 J/cm² comme suit. Les formes d’onde étaient généralement similaires et stables et montraient une forte augmentation avec la largeur du temps, la pression de crête et l’impulsion de 0,43±0,4 μs, 92,1 ± 6,8 MPa et 14,1 ± 1,9 Pa∙s (médiane ± écart-type), ce qui correspond aux caractéristiques du SW (Figure 1B). Les LISW se caractérisent par un temps de montée rapide, une pression de pointe élevée, une courte durée et une dominance en pression positive. Lorsqu’elle est appliquée sur un tissu biologique, la cible est placée directement sur le tissu vivant à travers la gelée, et on peut considérer que le SW a presque les mêmes caractéristiques que le SW mesuré appliqué au tissu. Après l’exposition au LISW, la présence de TMP a été évaluée à l’aide d’un petit endoscope numérique. Aucune des souris du groupe d’énergie LISW n’a présenté de TMP après l’exposition (figure 1C).

Évaluation auditive
Un examen ABR a été effectué pour déterminer la fonction auditive. L’ABR est une mesure du potentiel évoqué par le son dans la voie auditive, et l’ABR P1 représente l’activité neuronale accumulée dans le nerf cochléaire. Un jour après l’exposition à la LISW, l’oreille exposée a montré une différence significative dans le décalage du seuil ABR entre les différents groupes de LISW (ANOVA à deux facteurs, p < 0,0001 ; Figure 2A). Cette augmentation du décalage du seuil ABR s’est maintenue jusqu’à 1 mois après l’exposition au LISW dans les groupes 2,25 et 2,5 J/cm² (ANOVA à deux facteurs, 2,25 J/cm², p < 0,0001 ; 2,5 J/cm², p < 0,0001). En particulier, la région à haute fréquence a montré une augmentation notable du décalage du seuil ABR. Cependant, les seuils ABR sont revenus à un niveau qui n’était pas significativement différent de celui de préirradiation dans le groupe 2,0 J (ANOVA à deux facteurs, 2,0 J/cm², p = 0,76), ce qui indique que l’élévation du seuil dépendait de l’énergie. En ce qui concerne les amplitudes ABR P1, tous les groupes irradiés par LISW ont montré une diminution significative des amplitudes ABR P1 à toutes les fréquences 1 jour et 1 mois après l’exposition LISW (ANOVA à deux facteurs, p < 0,0001 ; Figure 2B). L’oreille non exposée (témoin ; oreille gauche) n’a montré aucune altération notable du seuil auditif ABR après l’exposition au LISW (données non présentées).

Survie des HC et des SGN
L’observation microscopique des oreilles exposées au LISW n’a révélé aucun dommage mécanique aux cochlées, comme une fracture et une luxation des osselets, une rupture de la membrane de la fenêtre ronde ou une hémorragie intracochléaire, après une exposition au LISW (données non présentées), ce qui est cohérent avec les résultats précédents ^6,14.

L’immunocoloration fluorescente des HC avec Myo7A, des rubans synaptiques avec CtBP2 et du nerf cochléaire avec NF est illustrée à la figure 3A. Aucune lésion cochléaire grave, telle que la perte de HC ou de fibres nerveuses, n’a été observée dans aucun des groupes. Cependant, l’évaluation quantitative de la survie des CCH positifs pour Myo7A différait significativement entre les groupes (ANOVA à deux facteurs, p = 0,002 ; Figure 3B). Le groupe 2,5 J/cm² a montré des taux de survie significativement plus faibles que le groupe témoin, en particulier dans la région à haute fréquence (ANOVA à deux facteurs, 2,5 J/cm², p = 0,0002). Cependant, les taux de survie des CSI étaient comparables entre les groupes, ce qui indique que les CSE sont vulnérables aux CSA à haute énergie (ANOVA à deux facteurs, p = 0,76). Une évaluation quantitative de la survie du ruban synaptique est présentée à la figure 3C. Les rubans synaptiques étaient significativement réduits dans les groupes 2,25 et 2,5 J/cm² par rapport au groupe témoin (ANOVA à deux facteurs, 2,25 J/cm², p < 0,0001 ; 2,5 J/cm², p < 0,0001), et les fréquences plus élevées présentaient une tendance à diminuer plus forte, similaire à celle du décalage du seuil ABR et de la survie OHC.

Ensuite, la densité SGN a été évaluée, comme le montre la figure 3D. Il y avait une différence significative dans la densité de SGN entre les groupes (ANOVA à deux facteurs, p = 0,76), et le groupe à 2,5 J/cm² a montré des taux de survie significativement plus faibles à SGN par rapport aux groupes témoins (ANOVA à deux facteurs, 2,5 J/cm², p = 0,007). Cependant, les groupes de 2,0 et 2,25 J/^cm2 ont montré une survie SGN comparable à celle des témoins. Ce résultat indique que la gravité de la dégénérescence cochléaire et du dysfonctionnement auditif dépend de l’exposition à l’énergie LISW, ce qui est cohérent avec les résultats de survie ABR et HC.

Fibré stéréociliaire
Nous avons observé une augmentation notable du seuil ABR, environ 30 dB, dans les groupes 2,25 et 2,5 J/cm² à des fréquences supérieures à 20 kHz, qui a persisté jusqu’à 1 mois après l’exposition au LISW (comme le montre la figure 2A). Cependant, le décalage du seuil de 30 dB que nous avons observé ne peut pas être attribué uniquement à la perte de CCE, à la dégénérescence des synapses cochléaires ou à un nombre réduit de CGS (Figure 3). Une étude antérieure indiquait que les décalages du seuil ABR étaient minimes lorsque le nombre de rubans synaptiques diminuait de 50 %¹⁹. Par conséquent, nous avons effectué une MEB pour enquêter sur la cause de l’élévation du seuil ABR. Après une exposition à la LISW à une intensité de 2,5 J/cm², certains faisceaux stéréociliaires de CCE semblaient être perturbés, en particulier dans les régions à haute fréquence (figure 4A), ce qui pourrait être l’une des causes de l’augmentation du seuil ABR après une exposition à la LISW. L’évaluation quantitative de la perturbation stéréociliaire a révélé que le rapport de perturbation avait tendance à être plus élevé dans la région des fréquences plus élevées d’une manière dépendante de l’énergie (figure 4B).

Figure 1 : Réglages expérimentaux et profil de pression du LISW. (A) Dispositif expérimental pour la génération du LISW chez les animaux. (B) Caractéristiques des formes d’onde de pression LISW fixées à 2,0 J/cm². (C) Images représentatives de la membrane tympanique. Les PTM n’ont été observées dans aucune des oreilles exposées au LISW. À titre de référence, le TMP représentatif induit par l’explosion (pointes de flèches jaunes) est représenté à l’aide d’un tube de soufflage. Abréviations : LISW = onde de choc induite par laser ; PET = polyéthylène téréphtalate ; TMP = perforation de la membrane tympanique ; YAG = grenat d’aluminium yttrium ; SHG = génération de secondes harmoniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats de l’ABR après l’exposition à la LISW. (A) Des changements significatifs du seuil de l’ABR ont été observés dans tous les groupes 1 jour après l’exposition à la LISW. Les variations du seuil ABR dans les groupes 2,25 et 2,5 J/cm² sont restées significativement élevées jusqu’à 1 mois après l’exposition au LISW. (B) L’amplitude de l’ABR P1 1 jour et 1 mois après l’exposition à la LISW a significativement diminué dans tous les groupes. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les groupes par rapport aux valeurs de préexposition (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. Abréviations : ABR = réponse auditive du tronc cérébral ; LISW = onde de choc induite par laser ; P1 = pic 1 ; SPL = niveau de pression acoustique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Pathologie cochléaire après exposition au LISW. (A) Images de fluorescence confocale de l’organe de Corti dans la région de 20 kHz coloré avec Myo7A (bleu), CtBP2 (rouge) et NF (vert) après exposition au LISW. (B) Les pourcentages moyens de HC survivants sont indiqués dans les cytocochléogrammes. L’évaluation quantitative a révélé une perte significative de CCE à 2,5 J/cm², bien qu’il n’y ait pas de différence significative dans la survie des CSI entre les groupes. (C) Le taux de survie des rubans présynaptiques par rapport aux valeurs pré-exposition a été significativement diminué dans les groupes 2,25 et 2,5 J/cm². (D) Photomicrographies représentatives des SGN dans tous les groupes 1 mois après l’exposition au LISW. Le taux de survie au SGN a diminué de manière significative à 2,5 J/cm². Les astérisques indiquent des différences significatives par rapport aux valeurs pré-exposition (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. Barres d’échelle = 5 μm (A), 100 μm (D). Abréviations : LISW = onde de choc induite par laser ; IHC = cellule ciliée interne ; NF = neurofilament ; OHC = cellule ciliée externe ; SGN = neurone ganglionnaire spiralé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Structures de surface des CCE. (A) Images représentatives de microscopie électronique à balayage des stéréocils des CCO dans les régions de 16 kHz et 24 kHz de l’organe de Corti un mois après l’exposition au LISW. La perturbation stéréociliaire est observée dans les images agrandies de la zone encadrée dans le groupe 2,5 J/cm² (zone de 24 kHz). Barre d’échelle -= 2 μm. (B) Le taux de perturbation stéréociliaire était plus élevé avec une augmentation de la surpression LISW. Abréviations : LISW = onde de choc induite par laser ; OHC = cellules ciliées externes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cette étude visait à valider un modèle murin de lésions cochléaires induites par l’explosion à l’aide de LISW. Nos résultats ont démontré qu’après l’application de LISW à travers l’os temporal, l’oreille de souris exposée présentait un déclin pathologique et physiologique constant de la cochlée, accompagné d’une augmentation de la surpression LISW. Ces résultats indiquent que ce modèle de souris est approprié pour reproduire diverses pathologies cochléaires en ajustant la sortie LISW. Plus précisément, ce modèle murin de dysfonctionnement cochléaire induit par LISW pourrait servir de bon modèle de lésion cochléaire en raison de sa nature contrôlée, reproductible et quantifiable, ainsi que de sa capacité à reproduire le déclin cochléaire physiopathologique dans des conditions contrôlées.

Notre étude précédente a utilisé un modèle de rat et a observé la dégénérescence cochléaire induite par LISW, y compris l’élévation des seuils auditifs, la perte de rubans synaptiques et la perturbation du faisceau stéréociliaire¹⁴. Une autre étude a examiné la dégénérescence cochléaire physiopathologique à la suite d’une lésion par explosion chez des souris en utilisant deux types de blastes ayant des caractéristiques différentes : la dominante basse fréquence à l’aide d’un tube de sablage et la dominante haute fréquence à l’aide de LISW¹⁵. Ils ont déterminé que la fréquence dominante du spectre de puissance de l’explosion était le principal facteur dans la détermination de la région des lésions cochléaires, comme indiqué précédemment¹⁵. À notre connaissance, il s’agit de la première étude à démontrer la méthodologie détaillée de l’exposition cochléaire LISW et de la dégénérescence cochléaire induite par LISW, dépendante de l’énergie et de la fréquence.

Nous avons utilisé l’exposition LISW pour endommager la cochlée à travers l’os temporal postauriculaire plutôt que par le conduit auditif externe pour créer un modèle qui impliquait uniquement des lésions cochléaires sans aucune TMP ou interruption de la chaîne ossiculaire. Nos résultats impliquent que la déficience auditive démontrée dans cette étude était due à la détérioration des composantes neurosensorielles dans la voie auditive. Des études récentes ont indiqué que le TMP peut servir de tampon contre les dommages à la cochlée en absorbant l’énergie SW ^2,20,21. Ce modèle LISW n’a pas été en mesure d’induire une TMP, même avec un LISW de haute intensité, car le SW était directement irradié dans l’oreille interne et non à travers la membrane tympanique. Par conséquent, pour analyser une perte auditive mixte avec TMP et SNHL, une explosion de haute intensité générée à l’aide d’une explosion réelle ou d’un tube de choc est idéale. Le choix du type de sablage dépend de l’utilisation ou de l’objectif spécifique de l’étude. Par conséquent, ce modèle de blessure animale basé sur LISW est utile pour élucider la physiopathologie cochléaire pure induite par le souffle sans TMP, entraînant une perte auditive de transmission. D’un autre point de vue, l’irradiation LISW a nécessité 1 h/animal, y compris la mise en place de l’équipement et la vérification de la membrane tympanique après l’irradiation. Par conséquent, si plusieurs animaux ont été exposés à la LISW d’affilée au cours d’une journée, il est difficile de mesurer l’irradiation de la LISW et l’ABR le même jour avec une seule dose d’anesthésique. En raison du risque de mort animale lors de l’augmentation de la dose d’anesthésique, dans cette étude, nous avons décidé d’effectuer des mesures ABR le lendemain, et non immédiatement après l’irradiation le même jour.

Dans le cas d’une blessure due à l’explosion, la phase primaire est causée par les forces physiques de l’explosion et la transmission rapide du SW avec des changements significatifs dans la densité tissulaire, tels que les jonctions tissu-air^22. Par conséquent, la plupart des lésions cochléaires induites par les explosions sont considérées comme provenant du SW au cours de la phase⁶ primaire, ce qui suggère que les études sur les lésions cochléaires exposées aux SW sont cruciales pour comprendre les mécanismes de la dysfonction cochléaire induite par les blastes. La création d’un SW à l’aide d’une impulsion laser de haute énergie sur un matériau solide est connue sous le nom de LISW. Des études antérieures ont utilisé LISW pour développer des modèles animaux de lésions cérébrales et pulmonaires traumatiques induites par une explosion^16,17. Les avantages de l’utilisation de LISW pour les études liées aux explosions comprennent son modèle de dommages reproductibles dépendant de l’intensité laser et le ciblage spécifique de l’organe blessé, car LISW n’affecte pas les zones en dehors de la zone ciblée.

Dans cette étude, nous avons découvert que le LISW provoque des changements pathologiques dans les HC cochléaires, les SGN, leurs synapses et le faisceau stéréociliaire, similaires aux dommages causés par les lésions réelles causées par l’explosion¹². Les dommages infligés par diverses formes d’atteintes cochléaires, telles que la perte auditive induite par le bruit, peuvent être attribués à deux facteurs fondamentaux : le stress mécanique direct et la perturbation métabolique secondaire. Nous proposons que la perturbation du fibré stéréociliaire soit la pathologie primaire résultant d’un stress mécanique direct du LISW. Les troubles stéréociliaires sont des pathologies courantes associées à un dysfonctionnement auditif lié à l’âge et induit par le bruit^23,24. Le mécanisme exact sous-jacent à cette perturbation stéréociliaire n’a pas encore été élucidé. Une étude antérieure a révélé qu’une perturbation stéréociliaire avait été observée 1 semaine après l’exposition à l’explosion¹². Une raison possible de ce changement morphologique unique peut être la déconnexion des liens d’extrémité et des liens latéraux entre les stéréocils de la rangée la plus externe perturbés et les stéréocils de la rangée du milieu¹⁴. De plus, les radicelles de la rangée la plus externe de stéréocils, qui sont constituées d’actine et de protéines groupées, telles que TRIOBP, sont également endommagées mécaniquement¹⁵.

Les agressions cochléaires entraînent généralement une perturbation supplémentaire des processus métaboliques qui peut persister pendant des jours, voire des mois^. En particulier, les synapses de la cochlée, qui sont responsables du traitement du son auditif, sont très vulnérables à l’exposition à l’explosion²⁵. Nos modèles animaux ont montré que la dégénérescence de la fonction des AN, comme le démontre la baisse des amplitudes ABR P1, était causée par des lésions cochléaires induites par LISW. Un mécanisme possible de la synaptopathie cochléaire induite par la SILS est la libération excessive de glutamate par les IHC, comme l’ototoxicité du glutamate²⁶. L’exposition à LISW fait vibrer violemment la membrane basilaire, provoquant une libération excessive de glutamate de l’IHC, ce qui entraîne une dégénérescence de l’AN. Le LISW peut reproduire le type de toxicité du glutamate qui affecte la cochlée, entraînant une synaptopathie cochléaire et une diminution du nombre de synapses sans endommager les HC. Un autre mécanisme possible est que l’exposition au LISW peut endommager les cellules de soutien cochléaire, ce qui contribue à la survie des ANF en fonction de la libération de neurotrophines²⁷. De plus, le LISW peut être transmis directement aux ANF et provoquer des lésions neuronales. Par conséquent, nos modèles de lésions cochléaires induites par LISW pourraient être précieux à la fois pour la recherche sur les blastes et l’examen de diverses formes de dégénérescence cochléaire impliquant une synaptopathie cochléaire.

Il existe un besoin urgent d’interventions thérapeutiques pour traiter la perte auditive induite par les explosions, ce qui souligne l’importance des stratégies de traitement axées sur la synaptopathie cochléaire ou la perturbation du faisceau stéréociliaire dans les OHC. Ces approches peuvent également être appliquées à d’autres types de troubles auditifs avec des mécanismes pathologiques similaires. Une synaptopathie cochléaire a été observée dans notre modèle de dysfonctionnement cochléaire induit par l’explosion, suggérant qu’il pourrait s’agir d’une cible thérapeutique prometteuse. LISW peut être utilisé pour créer des modèles murins qui reproduisent avec précision la physiopathologie cochléaire causée par les blastes, et ces modèles peuvent être utilisés pour étudier divers types de dysfonctionnements cochléaires.

Notre étude présente plusieurs limites. Tout d’abord, nous avons mesuré les seuils ABR à 12-24 kHz. Selon une étude antérieure, les lésions cochléaires induites par le LISW entraînent une perte auditive à haute fréquence chez les animaux en raison des caractéristiques du SW et de la vulnérabilité de la base cochléaire. D’autres études ABR sont nécessaires dans des régions de fréquences plus larges (>24 kHz). Deuxièmement, dans cette étude, nous n’avons effectué qu’une évaluation histologique de la cochlée et n’avons pas évalué la voie auditive centrale. La déficience auditive dans les lésions dues à l’explosion ne se limite pas à la cochlée, mais est une déficience compliquée du tronc cérébral et du système auditif central. À l’avenir, il serait souhaitable d’évaluer le centre auditif dans des modèles animaux exposés à LISW.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Laser Nd :YAG 532 nm Q-switché  ;	Quantel	Brilliant b
Logiciel d’analyse de pic ABR	Masse Œil et Oreille	N/A	EPL Suite de test de la fonction Cochléaire
Adhésif de soudage à la résine acrylique  ;	Acrysunday Co., Ltd	N/A
Microscopie confocale à fluorescence	Leica	TCS SP8
Composé de cryosectionnement	Sakura	Tissue-Tek O.C.T
CtBP2 anticorps	BD Transduction	#612044
Miroirs multicouches diélectriques	SIGMAKOKI CO.,LTD	TFMHP-50C08-532	M1-M3
Oscilloscope	numériqueTektronix	DPO4104B
Écouteur	CUI	CDMG15008-03A
Hydrophone	RP acoustics e.K.
Image J logiciel plug-in	NIH	ligne de mesure	https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Microscope optique	Keyence Corporation	BZ-X700
Myosine 7A anticorps	Proteus Biosciences	#25&ndash ; 6790  ;
Anticorps neurofilamentaire	Sigma	#AB5539
Lentille plano-convexe	SIGMAKOKI CO.,LTD	SLSQ-30-200PM
Logiciel de prisme	GraphPad	N/A	ver.8.2.1
Microscope électronique à balayage	JEOL Ltd	JSM-6340F
Petit endoscope numérique	AVS Co. Ltd	AE-C1
Gelée à ultrasons	Hitachi Aloka Medical	N/A
Atténuateur variable	Showa Optronics Co.	N/A	Successeur actuellement disponible : KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Encapsulant soluble dans l’eau  ;	Dako	#S1964