Méthode de fluorescence acellulaire quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer

Les changements phénotypiques des cellules qui sont liés au développement du cancer par le biais d’un ensemble commun de capacités biologiques modifiées sont maintenant communément appelés les caractéristiques du cancer. Parmi eux, on trouve des changements résultant de la reprogrammation du métabolisme énergétique, qui sont répandus en biologie des cellules cancéreuses¹. Une telle reprogrammation métabolique comprend un besoin accru de fer pour soutenir la prolifération rapide et la croissance tumorale². Cette soif de fer entraîne un dérèglement du métabolisme du fer, qui en soi est considéré comme une caractéristique du cancer ^3,4, avec une dérégulation survenant à tous les stades⁵. Les caractéristiques des métastases, plus récemment proposées par Welch et Hurst, incluent un rôle pour le fer⁶ puisque le fer peut induire un stress oxydatif, ce qui peut, à son tour, induire des modifications du génome, de l’épigénome et du protéome, augmentant ainsi la possibilité de métastases⁷. Des études épidémiologiques ont démontré un lien entre les niveaux de fer et l’augmentation de l’incidence du cancer⁸.

Étant donné que les cellules cancéreuses ont besoin de grandes quantités de fer, elles sont sensibles à la carence en fer et, par conséquent, à la chélation du fer. Nous avons récemment publié un article de synthèse soulignant le potentiel de la chélation du fer dans l’inversion de plusieurs caractéristiques du cancer par le biais de la perturbation des voies de signalisation oncogéniques^{NDRG1 9}. Cependant, l’utilisation de la chélation du fer comme traitement autonome du cancer n’a pas donné de résultats positifs dans les essais cliniques en raison de leur toxicité, de leur courte demi-vie, de leur métabolisme rapide et de leurs mécanismes de résistance émergents. Néanmoins, les chélateurs du fer se sont révélés prometteurs dans les études in vitro et in vivo , ce qui indique que des travaux supplémentaires sont nécessaires pour développer des chélateurs de fer efficaces pour le traitement du cancer. La chélation spécifique du fer est une stratégie validée dans la découverte de médicaments anticancéreux, mais seules quelques classes ont été rapportées à ce jour¹⁰.

L’identification et la caractérisation de nouveaux chélateurs du fer nécessitent la capacité de mesurer leur effet sur plusieurs paramètres. Bon nombre d’entre eux (tels que la prolifération, l’apoptose, la formation d’espèces réactives de l’oxygène) sont régulièrement mesurés et ont été décrits et examinés dans la littérature comme méthodes d’évaluation des caractéristiques du cancer¹¹. Lors de l’évaluation d’un nouveau chélateur du fer, de nombreux groupes examinent régulièrement l’effet sur les activités anti-prolifératives et redox ainsi que les effets sur l’afflux ou l’efflux de fer. Les techniques de prédiction in silico ¹² augmentent encore le nombre croissant de chélateurs du fer qui peuvent être dépistés.

Lacréation de chélateurs du fer nécessite la capacité de mesurer leur effet sur les niveaux de fer comme moyen de démontrer efficacement la preuve de principe. À l’heure actuelle, la méthode la plus courante pour ce faire est la cytométrie^{en flux 13} , qui est coûteuse, longue et peu quantifiable. Le choix du test est souvent basé sur la disponibilité de l’équipement expérimental, la vitesse et le coût d’un test. Par conséquent, la capacité de chélater le fer peut être une mesure finale négligée en raison des coûts élevés de l’équipement et de la difficulté de quantifier rapidement et de manière reproductible la force de la chélation. Ici, nous décrivons une méthode de fluorescence cellulaire sans cellule quantifiable et peu coûteuse pour confirmer la capacité de nouveaux composés à chélater le fer.

1. Préparation de la solution mère

1. Lors de la préparation des solutions mères de Calcein, évitez la photodégradation en gardant les solutions dans l’obscurité. Préparez une solution de 1 mM de Calcein dans le PBS de Dulbecco, sans magnésium ni calcium¹⁴. Pour 5 ml de solution de 1 mM de Calcein, ajoutez 3,1 mg de Calcein (622,5 g/M) à 5 mL de PBS de Dulbecco. À l’aide de la chaussette de 1 mM de Calcein, préparer des aliquotes de 1 mL de solutions mères secondaires dans un tube de microfuge comme indiqué dans le tableau 1.
2. Préparez des stocks de sulfate d’ammonium ferrique hexahydraté en dissolvant 19 mg de FAS hexahydraté (392,1 g/m) dans 5 mL de PBS de Dulbecco pour obtenir une solution de 10 mM de sulfate d’ammonium ferrique (FAS). Préparer les stocks secondaires de SAF par dilution. Pour préparer une pâte de 2 mM de SAF (fA), diluer 200 μL de la pâte 10 mM de SAF avec du PBS avec 800 μL de PBS de Dulbecco. Pour préparer une pâte de 100 μM FAS (fB), diluez 50 μL de pâte fA avec 950 μL de PBS de Dulbecco.
3. Pour préparer 10 mM de bouillon de défériprone, dissoudre 2,8 mg (139,15 g/M) dans 2 mL de PBS de Dulbecco. Préparez des stocks secondaires de chélateur de fer de 2 mM en diluant 200 μL de la pâte de 10 mM avec 800 μL de PBS de Dulbecco.
   REMARQUE : Dans ce test, le chélateur de fer de choix doit être dissous dans le PBS de Dulbecco sans magnésium ni calcium. À titre d’exemple, nous avons utilisé le chélateur de fer Deferiprone.

2. Validation du dosage par détermination de la plage linéaire de fluorescence de la calcéine

1. Préparez une gamme de stocks de Calcein de 1 mM à 1 μM comme décrit dans le tableau des solutions mères (voir Tableau 1). Conservez les solutions mères à l’obscurité pour éviter la dégradation photochimique.
2. Pipette de 90 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) vers les puits A à H et 1 à 12 d’une plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette manuelle monocanal ou d’une pipette manuelle multicanaux.
3. Ajouter 10 μL de 1 mM de calcein dans la colonne 12, rangées A à H, de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette manuelle monocanal.
4. Ajouter 10 μL de la pâte Calcein de 800 μM pré-préparée (tableau 1) dans une plaque à 96 puits dans la colonne 11, rangées A à H, à l’aide d’une pipette manuelle monocanal.
5. Répétez la procédure d’addition avec les stocks du tableau 1 de sorte que la colonne 10 contienne 10 μL du stock de 400 μM et la colonne 9 contient 10 μL du stock de 200 μM, etc. Continuez cette procédure par étapes sur les colonnes jusqu’à ce que la colonne 2 contienne 10 μL de stock de 1 μM.
   REMARQUE : La concentration finale de calcéine dans chaque puits est 10 fois inférieure à celle des solutions mères en raison de la dilution de 1:10.
6. Ajouter 10 μL de PBS à la colonne 1, rangées A à E.
7. Incuber à température ambiante pendant 30 min et régler l’analyseur sur un lecteur de microplaques à une excitation de 490 nm et une détection de 530 nm (ou un ensemble de filtres approprié pour la fluorescence Calcien).

3. Validation du dosage partrempe ionique Fe²⁺ pour réduire la fluorescence de la calcéine

1. Préparez un stock de calcéine (cB) de 10 μM et un stock de FAS (fA) de 2 mM (voir le tableau des matériaux). Gardez le stock Calcein dans l’obscurité pour éviter la photodégradation.
2. À l’aide d’une pipette manuelle monocanal ou d’une pipette manuelle multicanaux, ajoutez 50 μL de PBS dans les colonnes 2 à 10, rangées A à E. N’ajoutez pas PBS à la colonne 11.
3. Ajouter 100 μL d’une pâte FAS (fA) de 2 mM dans une plaque à 96 puits dans la colonne 11 (rangées A à E) à l’aide d’une pipette manuelle monocanal.
4. À l’aide d’une pipette manuelle multicanaux, prélever 50 μL de fA de la colonne 11 et le pipeter dans le PBS déjà présent dans la colonne 10, bien mélanger par pipetage.
5. Poursuivre cette procédure de double dilution par étapes sur les colonnes 9-2, rangées A à E de la plaque à 96 puits, et mélanger par pipetage.
6. Prélever 50 μL de solution par pipetage à partir de la colonne 2 et jeter la solution dans le gaspillage.
7. Ajouter 40 μL de PBS dans tous les puits contenant une solution, colonnes 2 à 12, rangées A à E.
8. Ajouter 90 μL de PBS dans les puits, colonne 1, rangées A-E. Ces puits agissent comme un contrôle positif de 1 μM de calcéine et de 0 μM de FAS.
9. Ajouter 10 μL de stock de calcéine (cB) de 10 μM dans chaque puits contenant une solution (colonnes 1 à 12, rangées A à E). Il en résulte une concentration maximale de 1000 μM de SAF dans la colonne 11, la concentration de SAF étant réduite de moitié pour les colonnes 10, 9 et 8 jusqu’à la colonne 2. Chacun des puits résultants des colonnes contient 1 μM de calcéine et une dilution de FAS.
10. Ajouter 100 μL de PBS à la rangée F des colonnes 1 à 5 pour le témoin PBS seul. Ajouter 100 μL de 2 mM de SAF à la rangée F des colonnes 6 à 10 pour le témoin SAF seul. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
11. Analyse sur un lecteur de microplaques réglé sur une excitation de 490 nm et une détection de 530 nm (ou un ensemble de filtres adapté à la fluorescence de la calcéine).

4. Dosage de la capacité des chélateurs de fer à surpasser le chélateur faible Calcein pour les ions Fe²⁺

1. Préparez un stock de calcéine (cB) de 10 μM, un stock de FAS (fB) de 100 μM et des stocks de chélateur de fer de 2 mM comme indiqué dans le tableau 1. Gardez le stock de Calcein à l’abri de la lumière pour éviter la photodégradation.
2. À l’aide d’une pipette manuelle monocanal ou d’une pipette manuelle multicanaux, ajoutez 50 μL de PBS dans les colonnes 2 à 10, rangées A à E, d’une plaque à 96 puits. N’ajoutez pas PBS à la colonne 11.
3. Ajouter 100 μL de la matrice de 2 mM (fA) des chélateurs de fer dans une plaque à 96 puits dans la colonne 11, rangées A à E, à l’aide d’une pipette manuelle monocanal.
4. À l’aide d’une pipette manuelle multicanaux, prélever 50 μL de fA de la colonne 11 et le pipeter dans le PBS de la colonne 10, rangées A à E, en mélangeant soigneusement par pipetage.
5. Continuez cette procédure de double dilution par étapes sur les colonnes 9-2 restantes, rangées A à E de la plaque, mélangez bien chaque par pipetage. Retirer 50 μL de la colonne 2 et jeter. Cela permet d’assurer une double dilution de 2 mM du chélateur de fer (Défériprone) à travers les colonnes de plaques à 96 puits 11 à 2, rangées A à E.
6. Pipeter 30 μL de PBS dans tous les puits contenant une solution (p. ex., colonnes 2 à 11, rangées A à E).
7. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 10 μL de 100 μM de FAS (fB) dans les colonnes 2 à 12, rangées A à E. Il en résulte une concentration de 1 μM de calcéine et de 10 μM de FAS dans chaque puits, et une double dilution des chélateurs, la concentration divisant de moitié chaque colonne à travers la plaque, les colonnes 11-2, avec la concentration la plus élevée de chélateur de fer à 1000 μM dans la colonne 11 puits A à E.
8. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 10 μL de stock de Calcein 10 μM (cB) dans les colonnes 2 à 12, rangées A à E.
9. Pipeter à l’aide d’une pipette 80 μL de PBS, 10 μL de stock de calcéine (cB) et 10 μL de stock de FAS (fB) jusqu’à la colonne 1, rangées A à E. Mélanger les échantillons par pipetage. Cela permet de contrôler 1 μM de calcéine avec 10 μM FAS et aucun chélateur.
10. Pipeter 100 μL de PBS dans les colonnes 1 à 5 de la rangée F. Cela fournit le contrôle négatif PBS.
11. Ajouter 100 μL de 2 mM de chélateur de fer (défériprone) à la rangée F, colonnes 6 à 10. Cela fournit au chélateur seul le contrôle.
12. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité. Analysez sur un lecteur de microplaques multimodal réglé sur l’excitation à 490 nm et la détection à 530 nm (ou un ensemble de filtres adapté à la fluorescence calcienne).

5. Analyse des données

1. Analyse pour la validation du test par détermination de la plage linéaire de fluorescence de la calcéine.
   1. Calculez les unités de fluorescence relative (RFU) moyennes des rangées A-H pour chaque concentration de calcéine dans les colonnes de la plaque à 96 puits de l’étape 1 et tracez en fonction de la concentration. Tracez le graphique linéaire de la concentration de Calcein sur l’axe des x en fonction de la RFU moyenne sur l’axe des y et utilisez une régression linéaire pour obtenir la droite du meilleur ajustement.
   2. Quantifier la signification statistique en comparant les concentrations de calcéine dans chaque colonne (2-11) au contrôle du PBS dans les rangées A à E de la colonne 1. Effectuer une analyse de variance (ANOVA) et appliquer une analyse a posteriori à l’aide de la différence la moins significative (LSD) avec un seuil de p <0,001 pour déterminer la signification statistique, (indiquée par ** dans la figure 1).
2. Analyse pour la validation du dosage par trempe des ions Fe²⁺ pour réduire la fluorescence de la calcéine.
   1. Calculer les unités de fluorescence relative (UFR) moyennes des rangées A à E pour chaque concentration de SAF dans les colonnes 2 à 11. Tracez l’UFR moyenne pour chaque concentration de SAF sur l’axe des y. Sur l’axe des x, tracer les concentrations de SAF à l’aide d’une échelle Log2 car elle permet de mieux répartir les données. Tracez une droite de meilleur ajustement à l’aide d’une régression linéaire.
   2. Quantifiez la signification statistique en comparant la moyenne de chaque colonne à l’UFR moyenne du témoin du PBS, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (colonne 1 lignes A à E). Effectuer une analyse ANOVA avec une analyse post hoc LSD avec un seuil de p <0,001 pour déterminer la signification statistique.
3. Analyse pour le dosage : Quantification de la capacité des chélateurs de fer à surpasser le chélateur faible Calcein pour les ions Fe²⁺ .
   1. Calculez les unités de fluorescence relative (RFU) moyennes des rangées A à E pour chaque concentration de chélateur dans les colonnes 2 à 11. Tracez l’UFR moyenne pour chaque concentration de chélateur sur l’axe des y. Sur l’axe des x, tracez les concentrations de chélateur à l’aide d’une échelle Log2 car elle distribue mieux les données.
   2. Quantifiez la signification statistique en comparant la moyenne de chaque colonne à l’UFR moyenne du témoin de PBS 1 μM Calcein et 10 μM FAS (colonne 1, lignes A à E). Effectuer une analyse ANOVA avec une analyse post hoc LSD avec un seuil de p <0,001 pour déterminer la signification statistique.

Pour la méthode présentée à l’étape 2, cette première expérience (Figure 1) a permis d’établir la gamme linéaire du lecteur de plaque de fluorescence de microtitration lors de la détection des émissions fluorescentes de Calcein. Nos résultats représentatifs montrent une large gamme linéaire de fluorescence de Calcein de 0 à 100 μM. L’ANOVA avec l’analyse post-hoc LSD démontre qu’il existe des différences statistiquement significatives dans la RFU moyenne pour toutes les concentrations de Calcein par rapport à un contrôle de 0 μM de Calcein. Dans d’autres expériences, la calcéine 1 μM a été utilisée (étapes 3 et 4) car elle produit des différences statistiquement significatives par rapport au contrôle 0 μM et se situe dans la plage qui est couramment appliquée aux cellules sous forme de calcéine AM en cytométrie en flux13.

Pour la méthode présentée à l’étape 3, nous démontrons que lorsque du fer sous forme de Fe2+ est ajouté dans une plage de 0-1000 μM (sous forme de FAS) à 1 μM de calcéine, les ions Fe2+ entraînent une diminution linéaire de la fluorescence de la calcéine (RFU). Cela permet d’observer l’extinction de la fluorescence de la calcéine basée sur Fe2+ . La calcéine, en tant que chélateur de fer faible, lie le fer, ce qui réduit la sortie fluorescente. Dans la figure 2, les concentrations de 8,9 μM FAS et plus ont montré une diminution significative, p<0,001, de la fluorescence de la calcéine par rapport à 1 μM de calcéine seule. L’utilisation de 8,9 μM de FAS correspondait à une réduction de 33 % de la fluorescence de la calcéine (RFU moyenne). Pour une expérience plus poussée (étape 4), on a utilisé du FAS de 10 μM car il se situait dans la plage d’extinction par fluorescence de Calcein.

Pour la méthode présentée à l’étape 4, la connexité de la calcéine pour les ions Fe2+ par un chélateur de fer peut être observée sur la figure 3. Le fer sous forme de Fe2+ diminue la fluorescence de la calcéine à partir du contrôle 1 μM et le chélateur du fer défériprone augmente cette fluorescence jusqu’à un pic, libérant l’extinction du fer de la calcéine et augmentant la fluorescence (RFU moyenne). La défériprone (utilisée à titre d’exemple) à des concentrations allant de 0,97 à 512 μM a entraîné des augmentations statistiquement significatives de la fluorescence, comme observé avec l’analyse post-hoc de l’ANOVA et de la LSD (p<0,001). Le changement de pli le plus important a été un changement de 3 fois de la RFU moyenne à 62,5 μM de chélateur par rapport au contrôle de 1 μM de calcéine AM et de 10 μM FAS. Au-dessus de 512 μM de défériprone, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre le chélateur et le témoin de 1 μM de Calcein et 10 μM de FAS.

Figure 1 : Concentrations de calcéine et fluorescence (RFU) déterminées à l’aide d’un lecteur de plaque de microtitration fluorescente. Les concentrations de calcéine de 0 à 100 μM incubées pendant 30 min et déterminées en fluorescence (RFU) sont indiquées ici. Les données montrent la moyenne de 8 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est notée par ** où p<0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). L’UFR moyenne de calcein de chaque concentration est comparée au contrôle du PBS et du calcéine 0 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’augmentation de la concentration de SAF entraîne une diminution linéaire de la fluorescence de la calcéine. La concentration de FAS a été augmentée de 0 à 1000 μM, ce qui a entraîné une diminution linéaire de la fluorescence de 1 μM de calcéine après 30 minutes d’incubation dans le PBS Les données présentées sont la moyenne de 5 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est notée par ** où p<0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). L’UFR moyenne de Calcein de chaque concentration de SAF et de 1 μM de Calcein est comparée au témoin de 1 μM de Calcein 0 μM de SAF dans le PBS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Augmentation des concentrations de défériprone. La concentration de défériprone a été augmentée de 0 à 1000 μM avec l’incubation de 1 μM de calcéine, 10 μM de FAS dans le PBS. La fluorescence a été mesurée sur un lecteur de microplaques multimodal. Les données présentées sont la moyenne de 5 répétitions par expérience et trois expériences indépendantes, les barres d’erreur montrent un intervalle de confiance de 95% dans la moyenne. La signification statistique est indiquée par ** où p<0,001 déterminée à l’aide de l’ANOVA et de l’analyse post-hoc LSD (calculée à l’aide du prisme du pavé graphique). La RFU moyenne est comparée à 1 μM de calcéine dans le PBS avec 10 μM de FAS et 0 μM de défériprone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation du stock secondaire de Calcein.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.