Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Résumé

Ce protocole décrit un test basé sur BRET pour mesurer les interactions de la kinase CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Le protocole décrit les étapes de préparation des cellules, de lecture des émissions BRET et d’analyse des données. Un exemple de résultat avec l’identification des contrôles appropriés et le dépannage pour l’optimisation du test est également présenté.

Résumé

CRAF est un effecteur primaire des GTPases RAS et joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS. De plus, CRAF est un point chaud pour les mutations germinales, qui causent la RASopathie développementale, le syndrome de Noonan. Toutes les kinases RAF contiennent de multiples sites de liaison dépendants de la phosphorylation pour les protéines régulatrices 14-3-3. La liaison différentielle de 14-3-3 à ces sites joue un rôle essentiel dans la formation de dimères RAF actifs au niveau de la membrane plasmique dans des conditions de signalisation et dans le maintien de l’auto-inhibition de RAF dans des conditions de repos. Comprendre comment ces interactions sont régulées et comment elles peuvent être modulées est essentiel pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent la fonction RAF. Ici, je décris un test basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans des cellules vivantes. Plus précisément, ce test mesure les interactions de CRAF fusionné à un donneur de nano luciférase et de 14-3-3 fusionné à un accepteur de marqueurs Halo, où l’interaction de RAF et 14-3-3 entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur et la génération du signal BRET. Le protocole montre en outre que ce signal peut être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 à chacun de ses sites d’amarrage RAF de haute affinité. Ce protocole décrit les procédures d’ensemencement, de transfection et de replacage des cellules, ainsi que des instructions détaillées pour lire les émissions BRET, effectuer l’analyse des données et confirmer les niveaux d’expression des protéines. De plus, des exemples de résultats d’analyse, ainsi que des étapes d’optimisation et de dépannage, sont fournis.

Introduction

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RAS....

Protocole

REMARQUE : Ce test est effectué dans des cellules de 293FT. Une lignée épithéliale bien caractérisée et facilement transfectable dérivée de cellules rénales embryonnaires humaines. Une seule boîte de culture confluente de 10 cm de ces cellules fournit généralement suffisamment de cellules pour ensemencer 20 puits de plaques de culture tissulaire à 6 puits. Les étapes 1 à 3 doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Ensemencement cellulaire (jour 1)

REMARQUE : Dans cette étape, les cellules sont détachées de la ou des boîtes de culture tissu....

Résultats

Lorsqu’elle est effectuée comme décrit dans ce protocole (Figure 2), l’interaction de Nano-CRAF^WT et de 14-3-3ζ-Halo devrait produire des rapports BRET corrigés de 50-60 mBU (Figure 3A ; Tableau supplémentaire 1). CRAF contient deux sites d’amarrage 14-3-3 dépendants de la phosphorylation, le site N’et le site C'(Figure 1)⁸. Par conséquent, les contrôles appropriés pour réduire la .......

Discussion

Des études antérieures ont montré que les protéines 14-3-3 jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition des kinases RAF. Comprendre comment ces événements de liaison sont régulés et les effets de la modulation de ces interactions sur la signalisation RAF et l’oncogenèse induite par RAF pourrait révéler de nouvelles vulnérabilités thérapeutiques qui ciblent la fonction CRAF. Cependant, le cycle d’activation de Raf est soutenu par une pléthore de protéines associées, de modifications post-traductionnelles et .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
forts » nbsp ;
HaloTag® ; anticorps monoclonal de souris	Promega	G9211  ;	Anticorps pour la détection des protéines marquées HaloTag par immunoblot
NanoLuc® ; anticorps monoclonal de souris	R& D Systems	MAB10026	Anticorps pour la détection de protéines nano-marquées par immunoblot
d’anticorps monoclonal de souris CRAF (E10)  ;	Santa Crus Biotechnology	sc-7267	Anticorps détectant directement les protéines CRAF par immunoblot
ECL anti-souris HRP anticorps secondaire	Amersham	NA931-1ML  ;	Anticorps secondaire de souris conjugué HRP (provenant de moutons)
réactifs
X-tremeGENE&trade ; 9	Roche/Sigma	6365809001
NanoBRET&trade ; kit  ;	Promega	N1661° ;	Kit NanoBRET contenant le ligand Halo 618 et le substrat NanoGlo (nanoluciférase)
DPBS, sans Ca++ et Mg++  ;	Produits biologiques de qualité  ;	114-057-101
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Milieux
DMEM		11995073	Teneur élevée en glucose, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium sans HEPES, milieu de distribution avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine et 100U de pénicilline-streptomycine
L-glutamine (200 mM)  ;   ;	Life Technologies	25030164
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)  ;	Technologies de la vie  ;   ;
Opti-MEM&trade ; J’ai réduit le sérum médico-sérique  ;	Gibco	31985062	Pour la transfection cellulaire
Milieu sérique réduit Opti-MEM, sans rouge de phénol	Gibco	11058021	Pour le replacage des cellules au jour 3. Compléter avec 2 mM de L-glutamine et 100U de pénicilline-streptomycine, ainsi que 10 % de FBS (le cas échéant).  ;
Invitrogen Trypan Blue Stain  ;	Thermo Scientific  ;	T10282  ;
Tampon de lyse NP40  ;	N/A	N/A	20 mM Tris (pH 8,0), 137 mM NaCl, 10 % de glycérol,   ; Alternative NP40 (Milipore, Cat# 492016). Conserver à 4 degrés C. Ajouter la protéase et la phosphatase suivantes immédiatement avant l’utilisation : 20 & micro ; M léupeptine, 0,5 mM d’orthovanidate de sodium, 0,15 U/mL, 1 mM PMSF.
5x tampon d’échantillon de gel	N/A N	/A	240 mM Tris (pH 8,0), 9,5 % SDS, 30 % glycérol, 500mM DTT, 3mM bleu de bromophénol. Conserver à -20 degrés C.
fortes »
293FT cellules (humaines)	Thermo Scientific  ;	R70007  ;
ADNforts » nbsp ;
pCMV5-Nano-CRAF WT et mutant  ;	N/A	N/A
pCMV5-14-3-3&zeta ;-Halo  ;   ;	N/A	N/A
Equipment
EnVision 2104 Lecteur de plaques multimode	PerkinElmer 2104	2104-0010  ;	600LP NanoBRET et Filtres à émissions NanoBRET M460/50 nm,  ; Miroir à luminescence 404, hauteur de mesure de 6,5 mm et temps de mesure de 0,1 s
Invitrogen Countess&trade ; II Compteur automatisé de cellules  ;	Thermo Scientific	AMQAX1000
ThermoFisher E1-ClipTip&trade ;   ; Multicanal  ; Pipettor  ;	Thermo Scientific  ;   ;	4672070
Logiciel>
GraphPad Prism (version 10.0.3)  ;	Bloc-notes graphique  ;	www.graphpad.com
Autre  ;
Pointes de pipette multicanaux ThermoFisher ClipTip  ;	Thermo Scientific  ;
Réservoir de réactif, 25 mL divisé, stérile	Thomas Scientific	1228K16
Perkin Elmer 384 puits CulturPlate&trade ;	PerkinElmer	6007680	White, polystyrène, culture tissulaire traitée  ;
Lames de chambre de comptage de cellules Countess	Thermo Scientific  ;	Réf. C10228

de culture cellulaire Life Technologies 25300120 1514016394410153