Article de méthode

Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ

DOI :

10.3791/66451

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22 mars 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) est un nouveau biocapteur qui permet de mesurer en continu les niveaux d’AMPc dans les cellules vivantes. Le biocapteur est créé à partir d’une protéine fluorescente permutée circulairement liée à la région charnière d’Epac2. Cela crée un biocapteur fluorophore unique qui affiche une fluorescence accrue ou diminuée lors de la liaison de l’AMPc. Le biocapteur existe en versions rouges et vertes vers le haut, ainsi qu’en versions vertes vers le bas, et en plusieurs versions rouges et vertes ciblées sur des emplacements subcellulaires. Pour illustrer l’efficacité du biocapteur, la version verte vers le bas, dont la fluorescence diminue lors de la liaison à l’AMPc, a été utilisée. Deux protocoles utilisant ce capteur sont présentés : l’un utilisant un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits compatible avec le criblage à haut débit et l’autre utilisant l’imagerie unicellulaire sur un microscope fluorescent. Sur le lecteur de plaques, les cellules HEK-293 cultivées dans des plaques à 96 puits ont été stimulées avec de la forskoline 10 μM ou de l’isoprotérénol 10 nM, ce qui a induit des diminutions rapides et importantes de la fluorescence dans la version verte descendante. Le biocapteur a été utilisé pour mesurer les niveaux d’AMPc dans des cellules individuelles de muscle lisse des voies respiratoires humaines (HASM) surveillées au microscope fluorescent. Le biocapteur vert vers le bas a montré des réponses similaires à des populations de cellules lorsqu’il a été stimulé avec de la forskoline ou de l’isoprotérénol. Ce test unicellulaire permet de visualiser l’emplacement du biocapteur à des grossissements de 20x et 40x. Ainsi, ce biocapteur d’AMPc est sensible et flexible, permettant de mesurer en temps réel l’AMPc dans les cellules immortalisées et primaires, ainsi qu’avec des cellules uniques ou des populations de cellules. Ces attributs font de cADDest un outil précieux pour étudier la dynamique de signalisation de l’AMPc dans les cellules vivantes.

Introduction

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L’adénosine 3',5′-monophosphate cyclique, AMPc, joue un rôle central dans la communication cellulaire et la coordination de divers processus physiologiques. L’AMPc agit comme un second messager, relayant les signaux externes des hormones, des neurotransmetteurs ou d’autres molécules extracellulaires pour initier une cascade d’événements intracellulaires1. De plus, l’AMPc est intimement impliquée dans diverses voies de signalisation, y compris celles associées aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et aux adénylyl cyclases. La compréhension du rôle de l’AMPc dans la signalisation cellulaire est fondamentale pour démêler les mécanismes complexes qui sous-tendent les fonctions cellulaires normales et le développement de thérapies potentielles pour un large éventail de conditions médicales2.

Dans le passé, diverses méthodes ont été employées pour mesurer l’AMPc directement ou indirectement. Il s’agissait notamment du radiomarquage des pools d’ATP cellulaires suivi d’une purification en colonne, d’une HPLC, de tests radio-immunologiques et d’immunotests liés à des enzymes 1,2. Ces tests hérités sont limités par le fait qu’il s’agit de mesures finales, nécessitant un grand nombre d’échantillons pour construire des réponses dépendantes du temps. Plus récemment, des capteurs FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ont été développés pour créer des tests dans des cellules vivantes, produisant des données dynamiques en temps réel et permettant aux capteurs d’être ciblés dans différents emplacements subcellulaires3. FRET exploite deux fluorophores, un donneur fluorescent et un accepteur fluorescent qui, lorsqu’ils sont à proximité, le fluorophore accepteur sera excité par la sortie fluorescente du donneur. Les deux fluorophores les plus utilisés sont la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) car elles ont des propriétés d’excitation et d’émission compatibles. En plus de la CFP et de la YFP, l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) et de la protéine fluorescente rouge (RFP) est couramment utilisée pour les biocapteurs FRET. Les biocapteurs FRET cAMP fonctionnent en ayant un donneur et un accepteur aux extrémités opposées de la protéine de liaison Epac2 cAMP. La liaison de l’AMPc modifie la confirmation de l’Epac et augmente la distance entre les fluorophores donneurs et accepteurs 3,4. Ce changement conformationnel est détecté par une perte de FRET, c’est-à-dire l’excitation du fluorophore accepteur par l’énergie transférée des gouttes de fluorophore donneuses3. Bien qu’il s’agisse d’un processus apparemment simple, le biocapteur FRET pour la recherche sur l’AMPc5 présente une multitude de limites et de problèmes. L’une d’entre elles est la sélection de protéines fluorescentes, par exemple la GFP, qui peuvent se dimériser naturellement, réduisant ainsi la sensibilité6. Les biocapteurs d’AMPc basés sur FRET ont été ciblés sur des microdomaines spécifiques7, mais il peut y avoir des limites en raison de la grande taille d’une construction avec deux fluorophores6. Un autre problème important est le faible rapport signal/bruit des signaux FRET résultant du chevauchement entre l’excitation et l’émission du fluorophore, ce qui entraîne une fréquence d’échantillonnage élevée et complique l’analyse des résultats 4,5.

Plus récemment, le nouveau biocapteur (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, a résolu ces limitations et d’autres lorsqu’il s’agit d’étudier la régulation de la signalisation de l’AMPc8. Une amélioration importante est la dépendance à l’égard d’un seul fluorophore. Cela permet d’obtenir un signal rapide et efficace avec une plage dynamique plus large et un rapport signal/bruit élevé. Par conséquent, il peut y avoir plus de précision car il y a une gamme moins large de longueurs d’onde pour passer au peigne fin8. Comme les sondes FRET, le biocapteur a été ciblé sur des emplacements subcellulaires, ce qui a permis la recherche sur la théorie de la compartimentation et l’exploration dans les radeaux lipidiques et les non-radeaux, ainsi que dans d’autres domaines subcellulaires9. Le plus important est peut-être l’adéquation d’un seul biocapteur fluorophore pour le criblage à haut débit, qui a amélioré la sensibilité et la reproductibilité par rapport aux biocapteurs basés sur FRET. Le biocapteur est encapsulé dans un vecteur BacMam pour faciliter la transduction d’un large éventail de types de cellules et un contrôle précis de l’expression des protéines.

Le contrôle de l’expression via le vecteur BacMam peut être particulièrement utile dans les tests utilisant des orthologues GPCR de différentes espèces pour faciliter l’interprétation des données issues d’études animales. De plus, le contrôle de l’expression des récepteurs est essentiel pour mesurer les différents degrés d’efficacité des médicaments (par exemple, les agonistes inverses et les agonistes partiels), et de faibles niveaux d’expression des récepteurs sont utiles pour imiter les faibles niveaux trouvés dans les tissus animaux. BacMam est un vecteur de baculovirus qui a été modifié pour transduire des cellules de mammifères telles que des cultures cellulaires primaires et les lignées10 de HEK-293. Les marqueurs dominants sélectionnables permettent à BacMam d’offrir une plus grande stabilité par rapport aux infections plasmidiques traditionnelles11. De tels promoteurs sélectifs permettent une livraison et une expression plus efficaces des gènes. De plus, l’ajout de trichostatine A (un inhibiteur de l’histone désacétylase) augmente les niveaux de protéine rapporteure11. Les niveaux d’expression peuvent être contrôlés via le titre du virus BacMam utilisé et doivent être optimisés pour chaque type de cellule. Dans le cas de ce biocapteur, une protéine fluorescente rouge ou verte est liée à l’Epac aux extrémités N et C. Lorsque l’AMPc se lie, un changement conformationnel dans le biocapteur déplace les acides aminés adjacents à la protéine fluorescente. Un tel décalage déplace l’absorbance de l’état anionique à l’état neutre à 400 nm, diminuant ainsi la fluorescence.

Il existe 90 à 120 RCPG exprimés dans une seule cellule qui répondent à une grande variété de signaux neurohumoraux12. Par conséquent, on peut supposer qu’au moins plusieurs dizaines de RCPG par cellule peuvent stimuler ou inhiber l’AMPc par le couplage Gs ou Gi, respectivement. Bien qu’il y ait eu des progrès dans la surveillance de ce deuxième messager en temps réel, comme le FRET, des méthodes plus efficaces sont nécessaires. La méthodologie de surveillance de la synthèse et de la dégradation des signaux d’AMPc à l’aide de cADDis en temps réel est présentée ici. Le changement de fluorescence peut être surveillé en temps réel à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence pour les tests à haut débit ou à l’aide d’un microscope fluorescent pour les tests unicellulaires. Ces méthodes sont utiles pour un large éventail de questions biologiques concernant la signalisation des RCPG via l’AMPc.

Protocole

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Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Spectrophotomètre à lecture de plaque à haut débit

  1. Ensemencement de cellules HEK-293 avec le vecteur BacMam cADDis dans une plaque de 96 puits (Jour 1)
    1. Divisez et infectez les cellules dans un capuchon viral.
      1. Milieu HEK chaud (tableau 1) et 0,25 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Désinfectez la cagoule et les matériaux en les essuyant avec des mouchoirs imbibés d’EtOH.
      3. Retirer et jeter le milieu HEK de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique.
      4. Ajouter 5 mL de DPBS libres de Mg2+ et de Ca2+ (37 °C) à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon d’avant en arrière pour laver le fond avec DPBS. Retirer et jeter le DPBS à l’aide d’une pipette sérologique.
      5. Trypsinisez les cellules en ajoutant 3 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % réchauffé à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon pour vous assurer que le réactif recouvre entièrement le fond du ballon. Mettez le couvercle sur le ballon et laissez reposer le réactif pendant 3 à 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher du ballon.
        REMARQUE : Cette expérience est optimisée pour une fiole de75 cm 2 ; Il peut être nécessaire d’ajuster le volume des réactifs si un appareil de culture de taille différente est utilisé.
      6. Prélever 5 mL de milieu frais contenant des antibiotiques. Expulsez et tirez le volume du ballon pour laver les parois du ballon et détacher physiquement les cellules.
      7. Prélever le volume total de la fiole (8 mL) et centrifuger (25 °C) dans un tube de 15 mL à 200 x g pendant 5 min.
      8. Après la centrifugation, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
      9. Pour laver les cellules sans déranger la pastille, ajoutez 500 μL de DPBS sans Mg2+ et Ca2+ DPBS sur le côté du tube de 15 mL. Après avoir délicatement ajouté le DPBS, retirez et jetez autant de tampon que possible sans déranger le granulé. Répétez l’opération une fois de plus.
      10. Comptez les cellules et ajustez-les à une densité cellulaire de 250 000 cellules/mL de cellules.
      11. Préparez un mélange maître en fonction des volumes de réactifs nécessaires par puits d’une plaque noire à fond transparent à 96 puits. C’est ce qu’on appelle la « plaque tissulaire ». Voir les volumes ci-dessous :
        REMARQUE : Exemple de 1 puits (volume total 200 μL) : 40 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 2 μL de trichostatine A (stock de 100 μM ; concentration finale 1 μM), 158 μL de 250 000 cellules/mL de densité cellulaire. Exemple de 10 puits (volume total 2 mL) : 400 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 20 μL de trichostatine A (stock de 100 μM), 1 580 μL de milieu avec une densité cellulaire de 250 000 cellules/mL.
      12. Ajouter 200 μL de mélange maître par puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur pendant 24 h avant de les faire fonctionner sur le spectrophotomètre à lecture de plaques.
  2. Fonctionnement sur un lecteur de plaques
    1. Sur une paillasse, retirez soigneusement tous les milieux de chaque puits et remplacez-les par 180 μL de DPBS avec du Mg2+ et du Ca2+ à 37 °C.
    2. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur santé.
    3. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez à 37 °C pendant 30 min-1 h.
    4. Pendant l’incubation, préparez les médicaments pour la lecture à une dilution de 1:10 (également appelée 10-up) pour la dose finale souhaitée. Préparez ainsi 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
    5. Ajouter 60 μL de chaque médicament en colonne dans une plaque transparente à 96 puits (appelée « plaque de médicament »).
      REMARQUE : Avec la dilution appropriée du médicament et pour optimiser la lecture, les médicaments sont ajoutés à une plaque transparente à 96 puits, appelée « plaque de médicament », pour être transférés au moment de la lecture sur la « plaque tissulaire » à l’aide d’un multi-pipeteur de 96, ce qui permet d’ajouter le médicament à tous les puits simultanément et d’être lu rapidement par le spectrophotomètre fluorescent.
  3. Configuration du lecteur de plaques de fluorescence
    1. Ajustez les paramètres du lecteur de plaques de fluorescence.
      1. Mode de lecture : fluorescence. Type de lecture : cinétique. Longueurs d’onde relevées : 494 nm et 522 nm.
      2. Temps de lecture : Entrez 3 min pour la lecture fluorescente de base et 7 min pour l’ajout post-médicament. Intervalle" est entré sous la forme 00:00:30 pendant 30 s entre chaque lecture.
        REMARQUE : Le temps de lecture peut être optimisé et augmenté en fonction du temps requis.
  4. Acquisition de données
    1. Retirez la plaque de tissu de l’incubateur, retirez la feuille d’aluminium et le couvercle de la plaque, puis placez la plaque de tissu dans le lecteur de plaques. Fermez le tiroir du lecteur pour permettre à la plaque de tissu de reposer et de s’équilibrer à la température du lecteur (37 °C).
    2. Placez la plaque transparente à 96 puits (plaque médicamenteuse) avec les dilutions du médicament sous la pipette multi-96 et entraînez-vous à prélever 20 μL dans les puits. Assurez-vous qu’il y a un volume uniforme de médicament tiré dans les pointes de la pipette.
    3. Lancez une mesure de « référence ».
      REMARQUE : 40 RFU ou plus sont considérés comme des données viables. Si les données sont inférieures à cette valeur, l’expérience doit être arrêtée et supprimée.
    4. La plaque de tissu s’éjectera du lecteur à la fin de la course de base. Ajoutez rapidement et soigneusement 20 μL de la plaque de médicament transparente à la plaque de tissu noir. Ensuite, commencez rapidement la course de « traitement ». La plaque de tissu ne doit pas être hors du lecteur pendant plus de 30 secondes après l’ajout des médicaments.
      REMARQUE : Si le médicament est ajouté trop rapidement, les cellules se détachent de la plaque tissulaire, créant une expérience inutilisable. De plus, les cellules sont infectées par une protéine fluorescente verte sensible à la lumière ; Il est donc impératif d’ajouter rapidement et rapidement les médicaments et de commencer la deuxième lecture pour éviter de manquer la première partie de la réponse.
    5. Une fois la deuxième lecture terminée, assurez-vous que la plaque de tissu est éjectée du lecteur et que la collecte des données est terminée.
      REMARQUE : Avant de jeter la plaque de tissu, il est préférable de vérifier que les cellules sont toujours attachées à la plaque. Observez les cellules au microscope. Si les cellules se détachent, les résultats ne sont pas valides et doivent être ignorés. L’expérience devra être répétée.
    6. Exportez les données résultantes sous forme de fichier Excel.
    7. Ouvrez les données lisibles Excel exportées à partir du lecteur de plaques et copiez et collez les informations pertinentes dans le modèle de conversion Excel. Les données seront transformées du lecteur de plaques configuré en lectures de colonnes à puits unique à droite des données copiées.
      REMARQUE : Les colonnes de fluorescence d’un puits au fil du temps sont répertoriées aux RFU (transformation de colonne intitulée) et sous forme de changement décimal par rapport à la lecture RFU à la lecture initiale (t0 intitulé Delta F). Dans le modèle Excel, le tableau Delta F est défini sur la dernière lecture de référence avant l’ajout du médicament. Il s’agit du 6e point de collecte de données.
    8. Après la transformation des données, copiez les données de Delta F et collez-les dans un logiciel d’analyse de données sous forme de décomposition ou de décroissance relative de la fluorescence au fil du temps.
    9. Remplacez le titre X par « temps (s) » et le titre Y par « ΔF/F0 » pour les valeurs décimales relatives.

2. Dosage unicellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée

  1. Ensemencement de cellules (HASM) avec le vecteur cADDis BacMam dans une boîte de 35 mm (Jour 1)
    1. Divisez et infectez les cellules dans un capuchon viral.
      1. Milieu HASM chaud (tableau 1), 0,25 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Désinfectez la cagoule et les matériaux et essuyez la cagoule avec des mouchoirs imbibés d’EtOH.
      3. Retirer et jeter le milieu HASM de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique.
      4. Ajouter 5 mL de DPBS libres de Mg2+ et de Ca2+ (37 °C) à l’aide d’une pipette sérologique neuve et incliner le ballon pour laver le fond avec le DPBS.
      5. Trypsinisez les cellules en ajoutant 3 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % réchauffé à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon pour vous assurer que le réactif recouvre entièrement le fond du ballon. Laissez reposer le réactif pendant 3 à 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher du ballon.
      6. Prélever 5 mL de milieu frais contenant des antibiotiques et expulser la pipette pour prélever les cellules du fond du ballon.
      7. Prélever le volume total de la centrifugeuse dans un tube à centrifuger à raison de 200 x g pendant 5 min.
      8. Après la centrifugation, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
      9. Sans déranger la pastille, ajoutez 500 μL de DPBS sans Mg2+ et Ca2+ DPBS sur le côté du tube de centrifugation. Retirez et jetez autant de liquide que possible et répétez l’opération une fois de plus.
        REMARQUE : Cette expérience est optimisée pour une fiole de75 cm 2 ; Il peut être nécessaire d’ajuster le volume des réactifs si un appareil de culture de taille différente est utilisé.
      10. Comptez les cellules et ajustez-les à une densité cellulaire de 40 000 cellules/ml.
      11. Préparez un mélange maître en fonction du volume de réactif nécessaire par puits d’une boîte de 35 mm. Voir les volumes ci-dessous :
        REMARQUE : Exemple de 1 puits (volume total 500 μL) : 20 μL du biocapteur BacMam vecteur (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 5 μL de trichostatine A (stock de 100 μM, concentration finale 1 μM), 500 μL de 40 000 cellules/mL de densité cellulaire. Exemple pour 4 puits (volume total 2 mL) : 80 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de gènes viraux/mL), 20 μL de trichostatine A (stock de 100 μM, concentration finale 1 μM), 2000 μL de milieu 40 000 cellules/mL de densité cellulaire.
      12. Ajouter 500 μL de mélange maître par puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant de poursuivre l’expérience.
        REMARQUE : Le numéro de cellule peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Pour éviter le chevauchement des cellules pour l’analyse, utilisez un nombre de cellules faible.
  2. Préparation des agents pharmacologiques (jour 2)
    1. Retirer délicatement le milieu dans chaque puits et le remplacer par 450 μL de DPBS avec du Mg2+ et du Ca2+ à 37 °C.
    2. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez le disque de 35 mm à 37 °C pendant 30 min-1 h.
    3. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur santé.
    4. Pendant ce temps, préparez les médicaments pour la lecture de 1 unité logarithmique au-dessus de la concentration finale souhaitée (10 fois supérieure). Préparez ainsi 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
    5. Pour les titres de dose logarithmique, préparer le médicament à 10 mM et utiliser des dilutions en série pour obtenir 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
  3. Acquisition de données
    REMARQUE : Les paramètres suivants sont pour un microscope inversé fluorescent. Le logiciel accompagnant chaque microscope peut différer ; Les paramètres généraux utilisés dans le protocole actuel sont décrits ici.
    1. Allumez le hub central, puis le microscope à fluorescence inversée.
    2. Ouvrez le logiciel qui sera utilisé pour la capture et choisissez l’option de capture en accéléré .
    3. Placez un porte-échantillon de parabole de 35 mm dans la platine du microscope.
    4. Réglez l’objectif sur x20.
    5. Utilisez l’autofocus et obtenez une image aussi claire que possible. S’il est difficile de trouver des cellules individuelles, commencez avec un objectif 4x, puis passez à 20x. Faites la mise au point manuelle de l’échantillon si le microscope ne dispose pas d’une fonction de mise au point automatique.
      REMARQUE : Le grossissement de 40x peut être utilisé si des détails morphologiques cellulaires plus importants sont nécessaires.
    6. Ajustez les paramètres suivants pour obtenir une acquisition de données optimale : Luminosité automatique (exposition), Longueur d’onde d’excitation, Balance des noirs (pour réduire le bruit de fond), Mise au point automatique.
    7. Après avoir trouvé une zone de vision avec plusieurs cellules fluorescentes cytoplasmiques, acquérez des données à l’aide de la capture en accéléré pendant 20 minutes toutes les 30 s.
    8. Cliquez sur l’itinéraire pour commencer la lecture.
    9. Courez pendant 3 minutes pour récupérer la ligne de base. Dès que la capture de 3 minutes est effectuée, ajoutez doucement 50 μL du médicament dans le puits approprié. Lorsque les médicaments sont ajoutés, la concentration finale sur la boîte sera de 10 μM de forskoline et de 10 nM d’isoprotérénol.
      REMARQUE : Le médicament doit être ajouté avec soin ; Ne touchez pas la plaque avec la pointe de la pipette, car cela pourrait déplacer le champ de vision créé et rendre l’échantillon impossible à analyser.
    10. Laissez l’expérience s’exécuter pendant 17 minutes de plus avec une capture de données toutes les 30 s.
    11. Une fois le test terminé, assurez-vous que les données sont prêtes pour l’analyse.
      REMARQUE : Bien que le protocole actuel n’intègre pas de contrôle de la dérive focale, il pourrait être bénéfique d’en inclure un dans l’expérience. Par exemple, l’utilisation de colorants nucléaires peut aider à gérer la dérive focale pendant l’analyse au microscope, en particulier lors de la capture d’images de cellules vivantes sur des durées prolongées. Les biocapteurs cADDis sont généralement largement répartis dans la cellule, ce qui fait d’un plan focal large la capture la plus efficace et réduit la nécessité de contrôler la dérive focale9.
  4. Analyse des données
    REMARQUE : Le logiciel accompagnant chaque microscope peut différer, de sorte que les paramètres généraux qui doivent être utilisés pour analyser les images capturées sont décrits ici.
    1. Ouvrez les fichiers d’image capturés pendant l’expérience.
    2. Utilisez l’outil Polygone ou cercle pour sélectionner la région d’intérêt de chaque cellule afin d’effectuer l’analyse. L’analyse doit donner la luminosité de chaque cellule à chaque point temporel.
      REMARQUE : La meilleure pratique consiste à sélectionner des cellules individuelles et non des cellules touchant la paroi de la parabole ou d’autres cellules. Cela garantit la meilleure collecte de données possible. Sélectionnez un minimum de 5 cellules à analyser dans chaque condition et répétez l’expérience au moins trois fois.
    3. Après avoir analysé les données, ouvrez les données dans une feuille Excel et calculez la luminosité moyenne pour chaque condition à chaque photo, en commençant par l’image juste avant d’ajouter les agents pharmacologiques ou le véhicule. Dans cet exemple, à la marque des 3 minutes ou à la6ème photo prise au microscope, puisque chaque photo est prise toutes les 30 s.
    4. Calculez ΔF/F0 pour chaque valeur moyenne dans chaque condition.
    5. Chargez-le dans un logiciel d’analyse statistique et tracez ΔF/F0 en fonction du temps en s.
      REMARQUE : La figure 1 fournit une vue d’ensemble schématique des principales étapes des protocoles.

Résultats

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La présente étude a validé le biocapteur cytosolique dans des tests au microscope et au lecteur de plaques. Une fois que les cellules ont exprimé le biocapteur, elles ont été stimulées avec de la forskoline 10 μM (un activateur direct de l’adénylyl cyclase), de l’isoprotérénol 10 nM (un agoniste à ß1AR etß 2AR), ou un véhicule (Figure 1). Les changements subséquents de fluorescence, indicatifs de la production d’AMPc, ont été capturés toutes les 30 s.

Les données ont été transformées comme le changement de fluorescence par rapport à la fluorescence initiale (ΔF/F0). Un modèle de désintégration à un seul site a été appliqué aux données de fluorescence pour quantifier les changements temporels des niveaux d’AMPc dans les différentes conditions (figure 2 et figure 3). Les paramètres de ces courbes de désintégration peuvent être utilisés pour quantifier la réponse à une concentration donnée du médicament. Le produit du taux de décomposition (k) et du plateau en tant que valeur unique qui quantifie la réponse au médicament a été utilisé, et ceux-ci ont été utilisés pour créer des courbes concentration-réponse lorsque plusieurs concentrations du même médicament sont appliquées13.

Sur le lecteur de plaques, lors de la stimulation avec de la forskoline 10 μM, le capteur cytosolique a montré une diminution considérable de l’intensité de la fluorescence en quelques secondes et a progressé sur de nombreuses minutes (de la ligne de base 0 ΔF/Fo à 200 s à -0,7 ΔF/Fo à 600 s) dans les cellules HEK-293 (Figure 2A). Compte tenu de la conception du capteur vert, une diminution de la fluorescence indique une augmentation de la production d’AMPc, indiquant que la forskoline a provoqué une augmentation uniforme des niveaux d’AMPc dans le cytosol. La stimulation des cellules HEK-293 avec une concentration sous-maximale d’isoprotérénol (10 nM) a entraîné des diminutions rapides mais plus faibles de la fluorescence du biocapteur (-0,3 ΔF/Fo à 600 s, Figure 2A). Lorsque ces concentrations plus faibles d’isoprotérénol (10 nM et 100 nM) ont été examinées dans un seul puits de cellules au fil du temps, des oscillations des niveaux d’AMPc ont été observées dans les cellules HEK-293 (figure 2B). La périodicité de ces oscillations était constamment d’environ 200 s. L’analyse de routine des données comprend l’ajustement de la réponse à un modèle de décroissance à un seul site, qui calcule la moyenne de ces oscillations (voir la ligne de connexion). Le fait de faire la moyenne de plusieurs expériences ensemble a généralement conduit à ce que ces oscillations soient obscurcies dans les données. Néanmoins, le biocapteur fait preuve d’une sensibilité et d’une cinétique rapide qui permettent l’observation des oscillations de l’AMPc.

cADDis peut également être mesuré à l’aide d’un microscope à fluorescence. Cette approche permet de surveiller l’AMPc dans des cellules uniques et peut également être adaptée pour visualiser des biocapteurs ciblés sur différents emplacements subcellulaires. Dans la présente étude, le biocapteur a été utilisé dans des cellules primaires de muscle lisse des voies respiratoires humaines (HASM). La stimulation de l’HASM avec l’un ou l’autre véhicule, de la forskoline 10 μM ou de l’isoprotérénol 10 nM, entraîne une diminution observable de l’intensité de la fluorescence au fil du temps (de la ligne de base 0 ΔF/Fo à 120 s à -0,9 ΔF/Fo à 410 s) (Figure 3) (Vidéo 1, Vidéo 2 et Vidéo 3). La fluorescence est uniformément répartie dans tout le cytosol des cellules et exclut le noyau (voir les vidéos en accéléré). Ainsi, la forskoline et l’isoprotérénol ont produit une diminution rapide et importante similaire des cellules HASM de fluorescence. Ces données démontrent la capacité d’utiliser le biocapteur dans les cultures de cellules primaires.

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Figure 1 : Représentation schématique des étapes du protocole du biocapteur. Dans un premier temps, les cellules de culture sont divisées et remises en suspension avec un milieu frais, puis infectées par le virus BacMam portant les capteurs cADDis. Les cellules post-transfection sont stimulées par des agents pharmacologiques déclenchant des voies cellulaires qui modifient l’AMPc. Les changements dans l’intensité de la fluorescence en réponse à la variation de la concentration d’AMPc sont capturés à l’aide d’un spectrophotomètre à lecture de plaque (A) ou d’un microscope à fluorescence (B), fournissant une quantification en temps réel de la dynamique de l’AMPc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Surveillance en temps réel de l’AMPc dans des cellules HEK-293 vivantes sur un spectrophotomètre à lecture de plaques. La fluorescence des cellules HEK-293 sur des plaques à 96 puits exprimant le biocapteur a été mesurée au fil du temps. Après l’établissement de la fluorescence de base, la décomposition de la fluorescence a été surveillée pendant 7 min. (A) La décomposition de la fluorescence après l’ajout de 10 μM de forskoline ou de 10 nM d’isoprotérénol est représentée comme la moyenne ± MEB de 10 à 15 expériences. (B) Les oscillations de décroissance de fluorescence sont mises en évidence en traçant une seule expérience après l’ajout de 10 nM ou de 100 nM d’isoprotérénol. Les données des deux graphiques sont ajustées à un modèle de décomposition à un seul site (ligne de connexion). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Surveillance en temps réel de l’AMPc dans des cellules HASM vivantes sur un microscope à fluorescence. La fluorescence des cellules HASM sur des boîtes plaquées de 35 mm exprimant le biocapteur a été mesurée au fil du temps. Après l’établissement des valeurs de référence, la décroissance de la fluorescence a été mesurée toutes les 30 s pendant 20 min. L’agent indiqué a été ajouté à 120 s (flèche). La décroissance de la fluorescence du biocapteur s’incurve en réponse à l’un ou l’autre véhicule, à la forskoline 10 μM ou à l’isoprotérénol 10 nM. Les données d’une seule expérience sont affichées à l’aide d’une ligne de connexion. Des vidéos en accéléré de cellules traitées avec un véhicule (contrôle), de la forskoline ou de l’isoprotérénol sont incluses pour fournir une représentation visuelle des réponses fluorescentes du biocapteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Vidéo en accéléré de la surveillance en temps réel de l’AMPc dans des cellules HASM en direct en réponse au véhicule. Courbes de décroissance de la fluorescence du biocapteur en réponse au véhicule (contrôle). Chaque image a été capturée toutes les 30 s pendant 20 min. Barre d’échelle : 40 μM. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Vidéo en accéléré de la surveillance en temps réel de l’AMPc dans des cellules HASM vivantes en réponse à la forskoline 10 μM. Courbes de décroissance de la fluorescence du biocapteur en réponse à la forskoline 10 μM. Chaque image a été capturée toutes les 30 s pendant 20 min. Barre d’échelle : 40 μM. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Vidéo en accéléré de la surveillance en temps réel de l’AMPc dans des cellules HASM vivantes en réponse à l’isoprotérénol 10 nM. Courbes de décroissance de la fluorescence du biocapteur en réponse à l’isoprotérénol de 10 nM. Chaque image a été capturée toutes les 30 s pendant 20 min. Barre d’échelle : 40 μM. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Formulation des milieux
HASM moyen
NomVolume
Le F-12K de Ham419,65 ml
FBS50 mL
HEPES (1M)12,5 ml
Solution d’hydroxyde de sodium6 mL
L-glutamine 200 mM (100X)5 mL
Chlorure de calcium (1 M)0,850 mL
Antibiotique-antimycosique (100X)5 mL
Primocin1 mL
HEK moyen
NomVolume
DMEM (1x)444 mL
FBS50 mL
Antibiotique-antimycosique (100X)5 mL
Primocin1 mL

Tableau 1 : Formulation du milieu HASM et du milieu HEK.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une mesure précise et sensible de l’AMPc est cruciale pour comprendre son rôle dans divers processus cellulaires et pour étudier l’activité des voies de signalisation dépendantes de l’AMPc. Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour mesurer les niveaux d’AMPc, notamment l’ELISA, le dosage radio-immunologique, les biocapteurs FRET et le test GloSensorcAMP 14,15,16,17,18. Chaque test d’AMPc a des forces et des faiblesses. Le protocole permet la détection et la surveillance en temps réel, allant de quelques minutes à quelques heures, et la mesure de la dynamique de l’AMPc dans les cellules vivantes sans qu’il soit nécessaire d’inclure des inhibiteurs de la phosphodiestérase. Ce dernier point est essentiel pour les chercheurs qui s’intéressent à l’étude du rôle des isoformes de la phosphodiestérase dans la régulation de la signalisation de l’AMPc19. Le biocapteur est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en plusieurs versions : un fluorophore vert qui diminue la fluorescence lors de la liaison de l’AMPc, un fluorophore rouge qui présente une fluorescence accrue lors de la liaison de l’AMPc, et un fluorophore vert qui présente une fluorescence accrue lors de la liaison de l’AMPc. La version descendante du biocapteur est la plus utile car le principal facteur limitant est le niveau d’expression du biocapteur, et cette version affichera une fluorescence maximale au départ avant de commencer une expérience, atténuant ainsi la nécessité d’évaluer l’expression du biocapteur en ajoutant un stimulus maximal de l’AMPc. Le biocapteur est également disponible dans des versions qui ciblent les microdomaines membranaires, les cils primaires ou le noyau. Ces différentes versions permettent de mesurer simultanément l’AMPc dans les compartiments cytosoliques et membranaires/ciliaux au sein d’une même cellule. Ces nouveaux outils sont particulièrement aptes à la visualisation et à la quantification de la dynamique de l’AMPc à travers différents composants cellulaires, un domaine d’étude important et en évolution rapide20.

Les biocapteurs offrent une méthode simple pour surveiller efficacement la dynamique de l’AMPc en temps réel, ce qui permet aux chercheurs d’observer des changements rapides dans les niveaux d’AMPc avec une résolution temporelle exceptionnelle. L’une des principales forces du biocapteur réside dans sa haute sensibilité, qui permet de détecter des variations à la fois subtiles et significatives des concentrations d’AMPc8. Un exemple de ceci dans les oscillations de l’AMPc est observé à de faibles niveaux de stimulus isoprotérénol dans les cellules HEK-293 sans inhibiteur de phosphodiestérase présent (Figure 2B). Ce comportement oscillatoire n’est pas compris et semble propre à ces cellules, mais la sensibilité et la cinétique rapide du biocapteur permettent leur détection. Il convient toutefois de noter que le biocapteur peut être facilement saturé, de sorte que ce biocapteur peut être limité dans la quantification des différences entre les signaux d’AMPc moyens et grands. Cette caractéristique limitante est particulièrement pertinente lors de l’utilisation d’inhibiteurs de la phosphodiestérase qui provoquent une augmentation globale des niveaux d’AMPc lorsqu’un stimulus du récepteur est également présent. Bien que nous présentions l’infection par l’HASM dans cette étude, il est important de reconnaître le défi associé à l’infection des cellules primaires à l’aide du vecteur BacMam. Les conditions doivent être optimisées pour chaque type de cellule afin d’obtenir une expression suffisante du biocapteur. Néanmoins, la sensibilité et l’évolutivité du biocapteur le rendent bien adapté aux tests à haut débit.

Une autre amélioration de l’utilisation de ce biocapteur par rapport aux capteurs basés sur FRET est la minimisation du photoblanchiment. De nombreux biocapteurs fluorescents sont soumis à un photoblanchiment suite à une excitation prolongée et répétée. Les protocoles décrits ici impliquent des excitations de courte durée espacées de 30 s. Le biocapteur est également extrêmement lumineux, limitant ainsi le potentiel de photoblanchiment pour ce type d’analyse. Le photoblanchiment serait observé pendant la ligne de base initiale, lu comme une dérive. Si une dérive de la ligne de base devait se produire, on pourrait soustraire la ligne de base dérivée des données avant d’ajuster la courbe ou augmenter l’intervalle d’échantillonnage pour réduire la fréquence d’excitation.

Comme les autres biocapteurs cAMP, ce biocapteur a une grande spécificité pour la liaison à l’AMPc. Par conséquent, les signaux générés par ce test sont directement corrélés aux niveaux d’AMPc, ce qui réduit considérablement les interférences potentielles d’autres composants cellulaires et fournit des résultats fiables. De plus, la polyvalence du biocapteur mérite d’être soulignée. Bien que le test GloSensor soit largement utilisé sur le terrain, il présente certaines limites. Par exemple, le fait de s’appuyer sur la transfection transitoire peut entraîner des inefficacités dans des types de cellules spécifiques, et l’analyse de plusieurs paramètres ou processus au sein d’une même cellule est un défi. De plus, le test repose sur des enzymes luciférases qui peuvent être influencées par certains composés, ce qui peut compromettre la précision des résultats21. D’autre part, le biocapteur peut être utilisé dans divers types de cellules et de systèmes expérimentaux, y compris les cellules adhérentes et en suspension. Sa compatibilité avec divers contextes cellulaires permet aux chercheurs d’étudier la dynamique de l’AMPc dans différents systèmes biologiques 22,23,24. L’intégration de ce test de biocapteur avec la microscopie à fluorescence renforce encore son utilité, car des informations morphologiques cellulaires peuvent également être recueillies 25,26,27.

Ce test offre aux chercheurs une grande flexibilité dans la conception expérimentale, permettant un large éventail d’études liées à la signalisation de l’AMPc. Il sert à plusieurs fins, permettant de mesurer les niveaux basaux d’AMPc, d’étudier les fluctuations de l’AMPc en réponse à divers stimuli ou traitements, et d’explorer la dynamique de l’AMPc dans diverses conditions physiologiques ou pathologiques. L’une des principales forces du test est sa compatibilité avec d’autres techniques, ce qui permet une compréhension plus complète de la signalisation de l’AMPc. En combinant le biocapteur avec des méthodes telles que la coloration par immunofluorescence ou la manipulation génétique10, les chercheurs peuvent obtenir des informations plus approfondies sur la régulation spatiale et temporelle précise de l’AMPc dans des compartiments cellulaires ou des voies de signalisation spécifiques. Grâce à cette intégration, les chercheurs peuvent étudier les diverses fonctions de l’AMPc dans divers contextes, ce qui permet d’obtenir des informations précieuses sur les complexités des processus cellulaires médiés par l’AMPc. L’utilisation de ces techniques permet aux chercheurs de visualiser et de quantifier les niveaux d’AMPc à la fois au niveau de la cellule individuelle et de la population, offrant une compréhension complète de sa distribution dans la cellule, y compris l’identification des pools d’AMPc. De ce fait, la combinaison de ces méthodes permet l’acquisition de données précises, contribuant de manière significative à notre connaissance de la signalisation de l’AMPc.

Bien que les méthodes traditionnelles aient été précieuses pour l’analyse de l’AMPc, l’introduction de cADDis représente une avancée prometteuse dans ce domaine. Sa spécificité, sa sensibilité et ses capacités en temps réel en font un ajout précieux à la boîte à outils du chercheur, notamment en raison de sa compatibilité avec les cellules vivantes. Grâce à sa capacité à surveiller les niveaux d’AMPc en temps réel et à sa grande sensibilité, le biocapteur offre un avantage significatif dans divers contextes expérimentaux. Ces progrès contribuent à une compréhension plus approfondie de la nature dynamique de la signalisation de l’AMPc et de ses implications fonctionnelles dans les processus physiologiques et pathologiques.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 96 puits (transparente)Fisherbrand21-377-203
Plat 35 mmGreiner Bio-One627870Plats de culture cellulaire à fond en verre
Plaque 96 puits  ;Corning3904Noir avec fond plat transparent
Antibiotique-Antimycosique (100x)Gibco15240062Pour les milieux HEK et HASM
Microscope à fluorescence BZ-XKeyence
Chlorure de calcium (IM)Quality Biological IncE506Pour les milieux HASM
Tube à centrifuger (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK media
DPBS avec Mg2+ et Ca2+ ;Gibco14040-133
DPBS sans Mg2+ et Ca2+Corning14040-133
Sérum fœtal de veau (FBS)R& D systemsS11195Pour les milieux HEK et HASM
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham’s F-12K  ;Gibco21127022Pour média HASM
HEPES (1M)Gibco15630080Pour média HASM
IsoprotérénolSigmaI6504Médicament
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081Pour média HASM
Microtube à centrifuger (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotique pour milieu HASM
RNAse awayThermo Scientific700511Réactif
Solution d’hydroxyde de sodiumSigmaS2770Pour milieu HASM
Spectrmax M5 lecteur de plaqueDispositifs
Trichostatine ATCI AmericaT2477Réactif
Trypsine EDTAGibco25200-056Réactif
moléculaires

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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