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Article de méthode

Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ

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DOI :

10.3791/66451

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22 mars 2024

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1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

Dans cet article

Résumé

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

Résumé

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) est un nouveau biocapteur qui permet de mesurer en continu les niveaux d’AMPc dans les cellules vivantes. Le biocapteur est créé à partir d’une protéine fluorescente permutée circulairement liée à la région charnière d’Epac2. Cela crée un biocapteur fluorophore unique qui affiche une fluorescence accrue ou diminuée lors de la liaison de l’AMPc. Le biocapteur existe en versions rouges et vertes vers le haut, ainsi qu’en versions vertes vers le bas, et en plusieurs versions rouges et vertes ciblées sur des emplacements subcellulaires. Pour illustrer l’efficacité du biocapteur, la version verte vers le bas, dont la fluorescence diminue lors de la liaison à l’AMPc, a été utilisée. Deux protocoles utilisant ce capteur sont présentés : l’un utilisant un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits compatible avec le criblage à haut débit et l’autre utilisant l’imagerie unicellulaire sur un microscope fluorescent. Sur le lecteur de plaques, les cellules HEK-293 cultivées dans des plaques à 96 puits ont été stimulées avec de la forskoline 10 μM ou de l’isoprotérénol 10 nM, ce qui a induit des diminutions rapides et importantes de la fluorescence dans la version verte descendante. Le biocapteur a été utilisé pour mesurer les niveaux d’AMPc dans des cellules individuelles de muscle lisse des voies respiratoires humaines (HASM) surveillées au microscope fluorescent. Le biocapteur vert vers le bas a montré des réponses similaires à des populations de cellules lorsqu’il a été stimulé avec de la forskoline ou de l’isoprotérénol. Ce test unicellulaire permet de visualiser l’emplacement du biocapteur à des grossissements de 20x et 40x. Ainsi, ce biocapteur d’AMPc est sensible et flexible, permettant de mesurer en temps réel l’AMPc dans les cellules immortalisées et primaires, ainsi qu’avec des cellules uniques ou des populations de cellules. Ces attributs font de cADDest un outil précieux pour étudier la dynamique de signalisation de l’AMPc dans les cellules vivantes.

Introduction

L’adénosine 3',5′-monophosphate cyclique, AMPc, joue un rôle central dans la communication cellulaire et la coordination de divers processus physiologiques. L’AMPc agit comme un second messager, relayant les signaux externes des hormones, des neurotransmetteurs ou d’autres molécules extracellulaires pour initier une cascade d’événements intracellulaires1. De plus, l’AMPc est intimement impliquée dans diverses voies de signalisation, y compris celles associées aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et aux adénylyl cyclases. La compréhension du rôle de l’AMPc dans la signalisation cellulaire est fondamentale pour démêler les mécanismes complexes qui sous-tendent les fonctions cellulaires normales et le développement de thérapies potentielles pour un large éventail de conditions médicales2.

Dans le passé, diverses méthodes ont été employées pour mesurer l’AMPc directement ou indirectement. Il s’agissait notamment du radiomarquage des pools d’ATP cellulaires suivi d’une purification en colonne, d’une HPLC, de tests radio-immunologiques et d’immunotests liés à des enzymes 1,2. Ces tests hérités sont limités par le fait qu’il s’agit de mesures finales, nécessitant un grand nombre d’échantillons pour construire des réponses dépendantes du temps. Plus récemment, des capteurs FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ont été développés pour créer des tests dans des cellules vivantes, produisant des données dynamiques en temps réel et permettant aux capteurs d’être ciblés dans différents emplacements subcellulaires3. FRET exploite deux fluorophores, un donneur fluorescent et un accepteur fluorescent qui, lorsqu’ils sont à proximité, le fluorophore accepteur sera excité par la sortie fluorescente du donneur. Les deux fluorophores les plus utilisés sont la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) car elles ont des propriétés d’excitation et d’émission compatibles. En plus de la CFP et de la YFP, l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) et de la protéine fluorescente rouge (RFP) est couramment utilisée pour les biocapteurs FRET. Les biocapteurs FRET cAMP fonctionnent en ayant un donneur et un accepteur aux extrémités opposées de la protéine de liaison Epac2 cAMP. La liaison de l’AMPc modifie la confirmation de l’Epac et augmente la distance entre les fluorophores donneurs et accepteurs 3,4. Ce changement conformationnel est détecté par une perte de FRET, c’est-à-dire l’excitation du fluorophore accepteur par l’énergie transférée des gouttes de fluorophore donneuses3. Bien qu’il s’agisse d’un processus apparemment simple, le biocapteur FRET pour la recherche sur l’AMPc5 présente une multitude de limites et de problèmes. L’une d’entre elles est la sélection de protéines fluorescentes, par exemple la GFP, qui peuvent se dimériser naturellement, réduisant ainsi la sensibilité6. Les biocapteurs d’AMPc basés sur FRET ont été ciblés sur des microdomaines spécifiques7, mais il peut y avoir des limites en raison de la grande taille d’une construction avec deux fluorophores6. Un autre problème important est le faible rapport signal/bruit des signaux FRET résultant du chevauchement entre l’excitation et l’émission du fluorophore, ce qui entraîne une fréquence d’échantillonnage élevée et complique l’analyse des résultats 4,5.

Plus récemment, le nouveau biocapteur (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis, a résolu ces limitations et d’autres lorsqu’il s’agit d’étudier la régulation de la signalisation de l’AMPc8. Une amélioration importante est la dépendance à l’égard d’un seul fluorophore. Cela permet d’obtenir un signal rapide et efficace avec une plage dynamique plus large et un rapport signal/bruit élevé. Par conséquent, il peut y avoir plus de précision car il y a une gamme moins large de longueurs d’onde pour passer au peigne fin8. Comme les sondes FRET, le biocapteur a été ciblé sur des emplacements subcellulaires, ce qui a permis la recherche sur la théorie de la compartimentation et l’exploration dans les radeaux lipidiques et les non-radeaux, ainsi que dans d’autres domaines subcellulaires9. Le plus important est peut-être l’adéquation d’un seul biocapteur fluorophore pour le criblage à haut débit, qui a amélioré la sensibilité et la reproductibilité par rapport aux biocapteurs basés sur FRET. Le biocapteur est encapsulé dans un vecteur BacMam pour faciliter la transduction d’un large éventail de types de cellules et un contrôle précis de l’expression des protéines.

Le contrôle de l’expression via le vecteur BacMam peut être particulièrement utile dans les tests utilisant des orthologues GPCR de différentes espèces pour faciliter l’interprétation des données issues d’études animales. De plus, le contrôle de l’expression des récepteurs est essentiel pour mesurer les différents degrés d’efficacité des médicaments (par exemple, les agonistes inverses et les agonistes partiels), et de faibles niveaux d’expression des récepteurs sont utiles pour imiter les faibles niveaux trouvés dans les tissus animaux. BacMam est un vecteur de baculovirus qui a été modifié pour transduire des cellules de mammifères telles que des cultures cellulaires primaires et les lignées10 de HEK-293. Les marqueurs dominants sélectionnables permettent à BacMam d’offrir une plus grande stabilité par rapport aux infections plasmidiques traditionnelles11. De tels promoteurs sélectifs permettent une livraison et une expression plus efficaces des gènes. De plus, l’ajout de trichostatine A (un inhibiteur de l’histone désacétylase) augmente les niveaux de protéine rapporteure11. Les niveaux d’expression peuvent être contrôlés via le titre du virus BacMam utilisé et doivent être optimisés pour chaque type de cellule. Dans le cas de ce biocapteur, une protéine fluorescente rouge ou verte est liée à l’Epac aux extrémités N et C. Lorsque l’AMPc se lie, un changement conformationnel dans le biocapteur déplace les acides aminés adjacents à la protéine fluorescente. Un tel décalage déplace l’absorbance de l’état anionique à l’état neutre à 400 nm, diminuant ainsi la fluorescence.

Il existe 90 à 120 RCPG exprimés dans une seule cellule qui répondent à une grande variété de signaux neurohumoraux12. Par conséquent, on peut supposer qu’au moins plusieurs dizaines de RCPG par cellule peuvent stimuler ou inhiber l’AMPc par le couplage Gs ou Gi, respectivement. Bien qu’il y ait eu des progrès dans la surveillance de ce deuxième messager en temps réel, comme le FRET, des méthodes plus efficaces sont nécessaires. La méthodologie de surveillance de la synthèse et de la dégradation des signaux d’AMPc à l’aide de cADDis en temps réel est présentée ici. Le changement de fluorescence peut être surveillé en temps réel à l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence pour les tests à haut débit ou à l’aide d’un microscope fluorescent pour les tests unicellulaires. Ces méthodes sont utiles pour un large éventail de questions biologiques concernant la signalisation des RCPG via l’AMPc.

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Protocole

Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Spectrophotomètre à lecture de plaque à haut débit

  1. Ensemencement de cellules HEK-293 avec le vecteur BacMam cADDis dans une plaque de 96 puits (Jour 1)
    1. Divisez et infectez les cellules dans un capuchon viral.
      1. Milieu HEK chaud (tableau 1) et 0,25 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Désinfectez la cagoule et les matériaux en les essuyant avec des mouchoirs imbibés d’EtOH.
      3. Retirer et jeter le milieu HEK de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique.
      4. Ajouter 5 mL de DPBS libres de Mg2+ et de Ca2+ (37 °C) à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon d’avant en arrière pour laver le fond avec DPBS. Retirer et jeter le DPBS à l’aide d’une pipette sérologique.
      5. Trypsinisez les cellules en ajoutant 3 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % réchauffé à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon pour vous assurer que le réactif recouvre entièrement le fond du ballon. Mettez le couvercle sur le ballon et laissez reposer le réactif pendant 3 à 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher du ballon.
        REMARQUE : Cette expérience est optimisée pour une fiole de75 cm 2 ; Il peut être nécessaire d’ajuster le volume des réactifs si un appareil de culture de taille différente est utilisé.
      6. Prélever 5 mL de milieu frais contenant des antibiotiques. Expulsez et tirez le volume du ballon pour laver les parois du ballon et détacher physiquement les cellules.
      7. Prélever le volume total de la fiole (8 mL) et centrifuger (25 °C) dans un tube de 15 mL à 200 x g pendant 5 min.
      8. Après la centrifugation, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
      9. Pour laver les cellules sans déranger la pastille, ajoutez 500 μL de DPBS sans Mg2+ et Ca2+ DPBS sur le côté du tube de 15 mL. Après avoir délicatement ajouté le DPBS, retirez et jetez autant de tampon que possible sans déranger le granulé. Répétez l’opération une fois de plus.
      10. Comptez les cellules et ajustez-les à une densité cellulaire de 250 000 cellules/mL de cellules.
      11. Préparez un mélange maître en fonction des volumes de réactifs nécessaires par puits d’une plaque noire à fond transparent à 96 puits. C’est ce qu’on appelle la « plaque tissulaire ». Voir les volumes ci-dessous :
        REMARQUE : Exemple de 1 puits (volume total 200 μL) : 40 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 2 μL de trichostatine A (stock de 100 μM ; concentration finale 1 μM), 158 μL de 250 000 cellules/mL de densité cellulaire. Exemple de 10 puits (volume total 2 mL) : 400 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 20 μL de trichostatine A (stock de 100 μM), 1 580 μL de milieu avec une densité cellulaire de 250 000 cellules/mL.
      12. Ajouter 200 μL de mélange maître par puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur pendant 24 h avant de les faire fonctionner sur le spectrophotomètre à lecture de plaques.
  2. Fonctionnement sur un lecteur de plaques
    1. Sur une paillasse, retirez soigneusement tous les milieux de chaque puits et remplacez-les par 180 μL de DPBS avec du Mg2+ et du Ca2+ à 37 °C.
    2. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur santé.
    3. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez à 37 °C pendant 30 min-1 h.
    4. Pendant l’incubation, préparez les médicaments pour la lecture à une dilution de 1:10 (également appelée 10-up) pour la dose finale souhaitée. Préparez ainsi 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
    5. Ajouter 60 μL de chaque médicament en colonne dans une plaque transparente à 96 puits (appelée « plaque de médicament »).
      REMARQUE : Avec la dilution appropriée du médicament et pour optimiser la lecture, les médicaments sont ajoutés à une plaque transparente à 96 puits, appelée « plaque de médicament », pour être transférés au moment de la lecture sur la « plaque tissulaire » à l’aide d’un multi-pipeteur de 96, ce qui permet d’ajouter le médicament à tous les puits simultanément et d’être lu rapidement par le spectrophotomètre fluorescent.
  3. Configuration du lecteur de plaques de fluorescence
    1. Ajustez les paramètres du lecteur de plaques de fluorescence.
      1. Mode de lecture : fluorescence. Type de lecture : cinétique. Longueurs d’onde relevées : 494 nm et 522 nm.
      2. Temps de lecture : Entrez 3 min pour la lecture fluorescente de base et 7 min pour l’ajout post-médicament. Intervalle" est entré sous la forme 00:00:30 pendant 30 s entre chaque lecture.
        REMARQUE : Le temps de lecture peut être optimisé et augmenté en fonction du temps requis.
  4. Acquisition de données
    1. Retirez la plaque de tissu de l’incubateur, retirez la feuille d’aluminium et le couvercle de la plaque, puis placez la plaque de tissu dans le lecteur de plaques. Fermez le tiroir du lecteur pour permettre à la plaque de tissu de reposer et de s’équilibrer à la température du lecteur (37 °C).
    2. Placez la plaque transparente à 96 puits (plaque médicamenteuse) avec les dilutions du médicament sous la pipette multi-96 et entraînez-vous à prélever 20 μL dans les puits. Assurez-vous qu’il y a un volume uniforme de médicament tiré dans les pointes de la pipette.
    3. Lancez une mesure de « référence ».
      REMARQUE : 40 RFU ou plus sont considérés comme des données viables. Si les données sont inférieures à cette valeur, l’expérience doit être arrêtée et supprimée.
    4. La plaque de tissu s’éjectera du lecteur à la fin de la course de base. Ajoutez rapidement et soigneusement 20 μL de la plaque de médicament transparente à la plaque de tissu noir. Ensuite, commencez rapidement la course de « traitement ». La plaque de tissu ne doit pas être hors du lecteur pendant plus de 30 secondes après l’ajout des médicaments.
      REMARQUE : Si le médicament est ajouté trop rapidement, les cellules se détachent de la plaque tissulaire, créant une expérience inutilisable. De plus, les cellules sont infectées par une protéine fluorescente verte sensible à la lumière ; Il est donc impératif d’ajouter rapidement et rapidement les médicaments et de commencer la deuxième lecture pour éviter de manquer la première partie de la réponse.
    5. Une fois la deuxième lecture terminée, assurez-vous que la plaque de tissu est éjectée du lecteur et que la collecte des données est terminée.
      REMARQUE : Avant de jeter la plaque de tissu, il est préférable de vérifier que les cellules sont toujours attachées à la plaque. Observez les cellules au microscope. Si les cellules se détachent, les résultats ne sont pas valides et doivent être ignorés. L’expérience devra être répétée.
    6. Exportez les données résultantes sous forme de fichier Excel.
    7. Ouvrez les données lisibles Excel exportées à partir du lecteur de plaques et copiez et collez les informations pertinentes dans le modèle de conversion Excel. Les données seront transformées du lecteur de plaques configuré en lectures de colonnes à puits unique à droite des données copiées.
      REMARQUE : Les colonnes de fluorescence d’un puits au fil du temps sont répertoriées aux RFU (transformation de colonne intitulée) et sous forme de changement décimal par rapport à la lecture RFU à la lecture initiale (t0 intitulé Delta F). Dans le modèle Excel, le tableau Delta F est défini sur la dernière lecture de référence avant l’ajout du médicament. Il s’agit du 6e point de collecte de données.
    8. Après la transformation des données, copiez les données de Delta F et collez-les dans un logiciel d’analyse de données sous forme de décomposition ou de décroissance relative de la fluorescence au fil du temps.
    9. Remplacez le titre X par « temps (s) » et le titre Y par « ΔF/F0 » pour les valeurs décimales relatives.

2. Dosage unicellulaire à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée

  1. Ensemencement de cellules (HASM) avec le vecteur cADDis BacMam dans une boîte de 35 mm (Jour 1)
    1. Divisez et infectez les cellules dans un capuchon viral.
      1. Milieu HASM chaud (tableau 1), 0,25 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
      2. Désinfectez la cagoule et les matériaux et essuyez la cagoule avec des mouchoirs imbibés d’EtOH.
      3. Retirer et jeter le milieu HASM de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique.
      4. Ajouter 5 mL de DPBS libres de Mg2+ et de Ca2+ (37 °C) à l’aide d’une pipette sérologique neuve et incliner le ballon pour laver le fond avec le DPBS.
      5. Trypsinisez les cellules en ajoutant 3 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % réchauffé à l’aide d’une pipette sérologique. Inclinez le ballon pour vous assurer que le réactif recouvre entièrement le fond du ballon. Laissez reposer le réactif pendant 3 à 5 minutes pour permettre aux cellules de se détacher du ballon.
      6. Prélever 5 mL de milieu frais contenant des antibiotiques et expulser la pipette pour prélever les cellules du fond du ballon.
      7. Prélever le volume total de la centrifugeuse dans un tube à centrifuger à raison de 200 x g pendant 5 min.
      8. Après la centrifugation, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
      9. Sans déranger la pastille, ajoutez 500 μL de DPBS sans Mg2+ et Ca2+ DPBS sur le côté du tube de centrifugation. Retirez et jetez autant de liquide que possible et répétez l’opération une fois de plus.
        REMARQUE : Cette expérience est optimisée pour une fiole de75 cm 2 ; Il peut être nécessaire d’ajuster le volume des réactifs si un appareil de culture de taille différente est utilisé.
      10. Comptez les cellules et ajustez-les à une densité cellulaire de 40 000 cellules/ml.
      11. Préparez un mélange maître en fonction du volume de réactif nécessaire par puits d’une boîte de 35 mm. Voir les volumes ci-dessous :
        REMARQUE : Exemple de 1 puits (volume total 500 μL) : 20 μL du biocapteur BacMam vecteur (stock de 2 x10 10 gènes viraux/mL), 5 μL de trichostatine A (stock de 100 μM, concentration finale 1 μM), 500 μL de 40 000 cellules/mL de densité cellulaire. Exemple pour 4 puits (volume total 2 mL) : 80 μL du biocapteur vecteur BacMam (stock de gènes viraux/mL), 20 μL de trichostatine A (stock de 100 μM, concentration finale 1 μM), 2000 μL de milieu 40 000 cellules/mL de densité cellulaire.
      12. Ajouter 500 μL de mélange maître par puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant de poursuivre l’expérience.
        REMARQUE : Le numéro de cellule peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Pour éviter le chevauchement des cellules pour l’analyse, utilisez un nombre de cellules faible.
  2. Préparation des agents pharmacologiques (jour 2)
    1. Retirer délicatement le milieu dans chaque puits et le remplacer par 450 μL de DPBS avec du Mg2+ et du Ca2+ à 37 °C.
    2. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et incubez le disque de 35 mm à 37 °C pendant 30 min-1 h.
    3. Inspectez les cellules au microscope pour confirmer leur santé.
    4. Pendant ce temps, préparez les médicaments pour la lecture de 1 unité logarithmique au-dessus de la concentration finale souhaitée (10 fois supérieure). Préparez ainsi 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
    5. Pour les titres de dose logarithmique, préparer le médicament à 10 mM et utiliser des dilutions en série pour obtenir 100 μM de forskoline et 100 nM d’isoprotérénol.
  3. Acquisition de données
    REMARQUE : Les paramètres suivants sont pour un microscope inversé fluorescent. Le logiciel accompagnant chaque microscope peut différer ; Les paramètres généraux utilisés dans le protocole actuel sont décrits ici.
    1. Allumez le hub central, puis le microscope à fluorescence inversée.
    2. Ouvrez le logiciel qui sera utilisé pour la capture et choisissez l’option de capture en accéléré .
    3. Placez un porte-échantillon de parabole de 35 mm dans la platine du microscope.
    4. Réglez l’objectif sur x20.
    5. Utilisez l’autofocus et obtenez une image aussi claire que possible. S’il est difficile de trouver des cellules individuelles, commencez avec un objectif 4x, puis passez à 20x. Faites la mise au point manuelle de l’échantillon si le microscope ne dispose pas d’une fonction de mise au point automatique.
      REMARQUE : Le grossissement de 40x peut être utilisé si des détails morphologiques cellulaires plus importants sont nécessaires.
    6. Ajustez les paramètres suivants pour obtenir une acquisition de données optimale : Luminosité automatique (exposition), Longueur d’onde d’excitation, Balance des noirs (pour réduire le bruit de fond), Mise au point automatique.
    7. Après avoir trouvé une zone de vision avec plusieurs cellules fluorescentes cytoplasmiques, acquérez des données à l’aide de la capture en accéléré pendant 20 minutes toutes les 30 s.
    8. Cliquez sur l’itinéraire pour commencer la lecture.
    9. Courez pendant 3 minutes pour récupérer la ligne de base. Dès que la capture de 3 minutes est effectuée, ajoutez doucement 50 μL du médicament dans le puits approprié. Lorsque les médicaments sont ajoutés, la concentration finale sur la boîte sera de 10 μM de forskoline et de 10 nM d’isoprotérénol.
      REMARQUE : Le médicament doit être ajouté avec soin ; Ne touchez pas la plaque avec la pointe de la pipette, car cela pourrait déplacer le champ de vision créé et rendre l’échantillon impossible à analyser.
    10. Laissez l’expérience s’exécuter pendant 17 minutes de plus avec une capture de données toutes les 30 s.
    11. Une fois le test terminé, assurez-vous que les données sont prêtes pour l’analyse.
      REMARQUE : Bien que le protocole actuel n’intègre pas de contrôle de la dérive focale, il pourrait être bénéfique d’en inclure un dans l’expérience. Par exemple, l’utilisation de colorants nucléaires peut aider à gérer la dérive focale pendant l’analyse au microscope, en particulier lors de la capture d’images de cellules vivantes sur des durées prolongées. Les biocapteurs cADDis sont généralement largement répartis dans la cellule, ce qui fait d’un plan focal large la capture la plus efficace et réduit la nécessité de contrôler la dérive focale9.
  4. Analyse des données
    REMARQUE : Le logiciel accompagnant chaque microscope peut différer, de sorte que les paramètres généraux qui doivent être utilisés pour analyser les images capturées sont décrits ici.
    1. Ouvrez les fichiers d’image capturés pendant l’expérience.
    2. Utilisez l’outil Polygone ou cercle pour sélectionner la région d’intérêt de chaque cellule afin d’effectuer l’analyse. L’analyse doit donner la luminosité de chaque cellule à chaque point temporel.
      REMARQUE : La meilleure pratique consiste à sélectionner des cellules individuelles et non des cellules touchant la paroi de la parabole ou d’autres cellules. Cela garantit la meilleure collecte de données possible. Sélectionnez un minimum de 5 cellules à analyser dans chaque condition et répétez l’expérience au moins trois fois.
    3. Après avoir analysé les données, ouvrez les données dans une feuille Excel et calculez la luminosité moyenne pour chaque condition à chaque photo, en commençant par l’image juste avant d’ajouter les agents pharmacologiques ou le véhicule. Dans cet exemple, à la marque des 3 minutes ou à la6ème photo prise au microscope, puisque chaque photo est prise toutes les 30 s.
    4. Calculez ΔF/F0 pour chaque valeur moyenne dans chaque condition.
    5. Chargez-le dans un logiciel d’analyse statistique et tracez ΔF/F0 en fonction du temps en s.
      REMARQUE : La figure 1 fournit une vue d’ensemble schématique des principales étapes des protocoles.

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Résultats

La présente étude a validé le biocapteur cytosolique dans des tests au microscope et au lecteur de plaques. Une fois que les cellules ont exprimé le biocapteur, elles ont été stimulées avec de la forskoline 10 μM (un activateur direct de l’adénylyl cyclase), de l’isoprotérénol 10 nM (un agoniste à ß1AR etß 2AR), ou un véhicule (Figure 1). Les changements subséquents de fluorescence, indicatifs de la production d’AMPc, ont été capturés toutes les 30 s.

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Discussion

Une mesure précise et sensible de l’AMPc est cruciale pour comprendre son rôle dans divers processus cellulaires et pour étudier l’activité des voies de signalisation dépendantes de l’AMPc. Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour mesurer les niveaux d’AMPc, notamment l’ELISA, le dosage radio-immunologique, les biocapteurs FRET et le test GloSensorcAMP 14,15,16,17,18.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 96 puits (transparente)Fisherbrand21-377-203
Plat 35 mmGreiner Bio-One627870Plats de culture cellulaire à fond en verre
Plaque 96 puits  ;Corning3904Noir avec fond plat transparent
Antibiotique-Antimycosique (100x)Gibco15240062Pour les milieux HEK et HASM
Microscope à fluorescence BZ-XKeyence
Chlorure de calcium (IM)Quality Biological IncE506Pour les milieux HASM
Tube à centrifuger (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK media
DPBS avec Mg2+ et Ca2+ ;Gibco14040-133
DPBS sans Mg2+ et Ca2+Corning14040-133
Sérum fœtal de veau (FBS)R& D systemsS11195Pour les milieux HEK et HASM
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham’s F-12K  ;Gibco21127022Pour média HASM
HEPES (1M)Gibco15630080Pour média HASM
IsoprotérénolSigmaI6504Médicament
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081Pour média HASM
Microtube à centrifuger (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotique pour milieu HASM
RNAse awayThermo Scientific700511Réactif
Solution d’hydroxyde de sodiumSigmaS2770Pour milieu HASM
Spectrmax M5 lecteur de plaqueDispositifs
Trichostatine ATCI AmericaT2477Réactif
Trypsine EDTAGibco25200-056Réactif
moléculaires

Références

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
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