Article de méthode

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

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DOI :

10.3791/66461

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9 février 2024

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1ITMO University, 2University of Central Florida

Dans cet article

Résumé

Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Résumé

Les nanomachines à base d’ADN (DNM) pour la détection de séquences d’ADN et d’ARN (analytes) sont des structures multifonctionnelles constituées d’oligonucléotides. Leurs fonctions comprennent la liaison serrée de l’analyte, la reconnaissance hautement sélective de l’analyte, l’amplification du signal fluorescent par plusieurs clivages catalytiques d’un substrat rapporteur fluorogène et l’attraction du substrat fluorogène pour une augmentation de la réponse du capteur. Les unités fonctionnelles sont attachées à un échafaudage d’ADN commun pour leur action coopérative. Les DNM 10-23 à clivage de l’ARN présentent une sensibilité améliorée par rapport aux sondes d’hybridation non catalytiques. La stabilité du DNM et les chances accrues de reconnaissance du substrat sont fournies par un fragment d’ADN double brin, une tuile. Le DNM peut différencier deux analytes avec une seule différence nucléotidique dans un ARN replié et un ADN double brin et détecter des analytes à des concentrations ~1000 fois inférieures à celles des autres sondes d’hybridation sans protéines. Cet article présente le concept derrière le potentiel diagnostique de l’activité des nanomachines d’ADN et donne un aperçu de la conception, de l’assemblage et de l’application de DNM dans les tests de détection d’acides nucléiques.

Introduction

L’une des premières méthodes de détection des acides nucléiques est la liaison complémentaire d’oligonucléotides sélectifs aux séquences d’ARN ou d’ADN analysées. Cette méthode utilise des fragments d’acide nucléique (sondes) qui peuvent former des paires de bases Watson-Crick avec unanalyte d’ADN ou d’ARN 1 ciblé. Le complexe est ensuite différencié de l’analyte et de la sonde non liée par diverses techniques. Certaines méthodes, comme le Northern blot, l’hybridation in situ , ou qPCR, sont basées sur le phénomène de liaison complémentaire2. Les sondes d’hybridation les plus courantes présentent deux inconvénients importants : une faible sensibilité (elles peuvent atteindre des niveaux micromolaires à nanomolaires) ainsi qu’une faible sélectivité aux variations nucléotidiques uniques (SNV), y compris les mutations ponctuelles. La question nécessite une approche sophistiquée puisque les solutions à ces inconvénients entrent en conflit les unes avec les autres3. Pour offrir la meilleure sélectivité, l’oligonucléotide de détection doit être suffisamment court pour former des hybrides instables avec des analytes non appariés. De tels oligonucléotides courts ne sont pas capables de lier étroitement les acides nucléiques ciblés et de dérouler leurs structures secondaires, échouant ainsi souvent à fournir un signal détectable. Il est particulièrement difficile de détecter des fragments riches en CG dans l’ARN biologique, ou ADN double brin (ADNdb). En revanche, les sondes longues sont insensibles à SNV3. Pour sortir de l’impasse, le concept d’une sonde binaire a été développé4.

Des capteurs binaires divisent une seule sonde de détection en deux morceaux et spécialisent ses fragments, en gardant l’un d’entre eux long pour dérouler les épingles à cheveux ou envahir l’ADNdb. Le deuxième fragment de sonde binaire reste court pour être sensible à une base non appariée, fournissant ainsi un moyen de détecter SNV. Le signal sera produit si les deux parties du capteur binaire sont jointes4. Le complexe complet peut être visualisé via FRET5, la sonde de balise moléculaire 6,7, ou les G-quadruplexes avec une activité semblable à celle de la peroxydase 8,9,10, ou bien 11,12,13 DNAzyme de clivage de l’ARN. Les capteurs binaires avec un noyau DNAzyme de 10 à 23 ont été amplement décrits. Ils ont été adaptés pour détecter des fragments d’acide nucléique simple brin créés synthétiquement11, ou des produits d’amplification simple brin 14,15. Une détection sans amplification est également possible, par exemple, dans le cas de l’ARNr 16S extrait d’une culture cellulaire, puisque cette molécule est abondante dans les cellules12,16. Les capteurs binaires avec un noyau DNAzyme 10-23 peuvent également être adaptés pour la détection d’acides non nucléiques, comme pour les ions plomb17. Néanmoins, la faible sensibilité est toujours considérée comme l’un des principaux inconvénients des capteurs binaires 10-23 DNAzyme, et diverses approches, y compris les cascades18 ou des méthodes alternatives d’amélioration du signal19, ont été développées pour résoudre ce problème. Malheureusement, les techniques ci-dessus augmentent considérablement le coût et l’instabilité des composants du capteur, et ne sont donc pas encore entrées en pratique.

L’expérience décrite dans ce travail utilise 10-23 nanocapteurs d’ADN basés sur DNAzyme, appelés nanomachines d’ADN (DNM)20,21. Ces structures comprennent des capteurs binaires et aussi (1) des facilitateurs d’ADN flanquant la sonde binaire, déroulant les régions structurées et envahissant l’ADN double brin, et (2) une tuile d’ADN qui maintient toutes les parties DNM ensemble à proximité et augmente les chances de formation de signaux (Figure 1). Dans l’ensemble, les 10-23 DNM basés sur DNAzyme abaissent la limite de détection (LOD) jusqu’à la plage picomolaire21 ; ils peuvent être utilisés pour détecter l’ARN16r dans les lysats cellulaires22 ou signaler la présence d’ARN viral sans amplification 23,24. Dans le même temps, les DNM restent sensibles au SNV et peuvent même être utilisés pour génotyper les allèles chez les organismes hétérozygotes25. La méthode DNM peut être utilisée comme technique complémentaire à tout type d’amplification pour la visualisation de produits ou l’identification du produit dans un mélange complexe à haute sélectivité. Les DNM, contrairement aux sondes TaqMan et aux sondes de balise conventionnelles, ne nécessitent pas de chauffage de l’échantillon et peuvent donc être utilisées dans les protocoles de détection de points finaux, ce qui rend la détection globale rentable.

Cet article décrit le développement in silico d’un DNM et démontre les procédures d’assemblage et de caractérisation fonctionnelle du DNM. Le travail a été réalisé à l’aide d’un fragment synthétique du virus d’Epstein-Barr (VEB) correspondant aux positions 13972-14154 de l’ADN viral (OR652423.1) (voir Tableau des matériaux).

Protocole

1. Conception DNM

  1. Sélectionnez une région unique dans le génome d’intérêt.
    REMARQUE : Ce travail utilise une région du génome du virus d’Epstein-Barr (VEB) aux positions 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Créez un jeu d’amorces pour l’amplification du fragment sélectionné, par exemple, via l’outil Primer3 intégré à Ugene26.
  3. Ouvrez l’outil Web UNAFold27 (voir la table des matériaux) et insérez la région sélectionnée. Modifiez la température de repliement à 55 °C et les conditions ioniques à 250 mM d’ions monovalents et 200 mM de Mg2+.
    1. Ouvrez la structure secondaire résultante du fragment d’ADNsb et sélectionnez une épingle à cheveux stable. Localiser le site de liaison des nanomachines d’ADN dans les régions non structurées ou, alternativement, sur les boucles des structures en épingle à cheveux pour obtenir une liaison plus forte de la cible.
  4. Si le site de l’analyte ciblé est plié dans une structure tige-boucle, placez les bras 1 et 2 comme suit : Assurez-vous que le bras 2 lie un côté de la tige, l’anse, et 3 à 5 nt du deuxième côté de la tige ; Le bras 1 lie un fragment du deuxième côté de la tige.
  5. Ouvrez l’outil DinaMelt28 (voir Tableau des matériaux) et analysez les séquences des bras et leurs séquences de complément inverse. À l’aide de l’outil DinaMelt, assurez-vous que le Tm des bras 2 et 3 est supérieur à 65 °C : au moins 10 °C au-dessus de la température de dosage (55 °C).
    1. Maintenir le Tm du bras 1 à au moins 1-3 °C au-dessus de la température de réaction (55 °C) si l’on veut obtenir une sélectivité de reconnaissance élevée29.
  6. Combinez les séquences Arms 1 et 2 avec les moitiés du noyau DNAzyme et les fragments de liaison F-sub13.
  7. Analysez la structure secondaire des brins d’ADN conçus à l’aide d’UNAFold27.
    REMARQUE : 55 °C (température d’essai), 200 mM Mg2+, 250 mM ions monovalents (HEPES, Na+, K+).
    1. N’utilisez le modèle que si le ΔG de pliage est inférieur à - 4 kcal/mol. Essayez d’éviter les longues séquences riches en images de synthèse. Si la structure secondaire est trop stable, introduire une mutation dans le bras pour augmenter le repliement ΔG30. Alternativement, placer le bras 3 à 2-3 nt loin du bras 2 est une autre stratégie pour changer la séquence du bras 3 afin d’éviter des structures intermoléculaires stables.
  8. Créez une séquence aléatoire pour le fragment de tuile d’ADN aussi long que l’Arm 3. Combinez la séquence Arm 3 avec la séquence de tuiles d’ADN via (dT)4-6 ou éthylène glycol (par exemple, triéthylène glycol (TEG) ou hexaéthylène glycol (HEG)). La version DNM présentée dans l’expérience utilise (dT)6.
  9. Reliez le bras 2 avec la séquence complémentaire au fragment de tuile d’ADN sélectionné à l’étape 1.8 via un éditeur de liens.
  10. Analysez la structure secondaire des brins d’ADN conçus à l’aide de l’application Web UNAFold. Assurez-vous que l’énergie de repliement de chaque brin d’ADN est supérieure à 4 kJ/mol à 55 °C, et évitez les longues séquences enrichies en CG. De préférence, modifiez la séquence de tuiles d’ADN.
  11. Dessinez la structure à l’aide de n’importe quel logiciel de graphisme vectoriel disponible. Cet article utilise Biorender et Pixelmator Pro pour la visualisation (voir la Table des matériaux). Vérifiez la précision dans les directions 5'->3' pour chaque brin.
    REMARQUE : Procurez-vous les séquences auprès d’un fournisseur commercial fiable.

2. Test fonctionnel du DNM

  1. Préparation du tampon et des réactifs
    1. Préparez le tampon réactionnel composé de 50 mM d’HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM de NaCl, 150 mM de KCl et 200 mM de MgCl2. Remplissez avec de l’eau déminéralisée jusqu’à 50 ml.
    2. Préparez 10 μM d’aliquotes d’oligonucléotides Dzb-Tile et Tile-Arm3. Préparez une solution de 1 μM de Dza, d’un F-sub de 100 μM et d’analytes de 1 nM, 10 nM et 100 nM dans de l’eau RNase/libre ou de l’eau désionisée stérile. Les détails des séquences d’oligonucléotides sont fournis dans la Table des matériaux.
  2. Assemblage DNM
    1. Décongelez complètement les solutions d’oligonucléotides avant de les utiliser. Mélanger délicatement en tapotant (ne pas tourbillonner intensément). Faites tourner (rapidement, pendant quelques secondes) la solution à l’aide d’une microcentrifugeuse.
    2. Mélangez 1 μM de Dzb-Tile et Tile-Arm3 dans 200 μL de tampon de réaction dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 mL.
    3. Mélangez doucement le tube et faites tourner la solution.
    4. Enveloppez le couvercle du tube fermé avec un film de paraffine. Vous pouvez également utiliser des tubes à bouchon à vis.
    5. Incuber le tube dans un bécher de 500 ml avec de l’eau bouillante pendant 2 min, puis éteindre le chauffage et laisser la température refroidir passivement pendant la nuit.
    6. Préparez le PAGE natif à 12 % : Mélangez 1 mL de tampon TBE 10х, 3 mL de 40 % d’AA :BA, de l’eau désionisée jusqu’à 10 mL, 50 μL d’APS et 5 μL de TEMED (voir le tableau des matériaux). Déplacez le mélange dans la cassette de gel et laissez-le polymériser.
    7. Mélangez 1 μL de chaque échantillon, à savoir le DNM, le Dzb-Tile et le Tile-arm assemblés3, avec 1 μL de colorant de chargement 4x et chargez-les dans le gel.
    8. Placez la cassette dans la chambre, remplissez-la avec 1 tampon TBE et laissez le gel fonctionner pendant 90 min à 80 V.
    9. Teindre le gel avec du bromure d’éthidium et le visualiser à l’aide d’un système de documentation du gel (voir le tableau des matériaux).
  3. Dosage LOD
    1. Préparez 160 μL de F-sub 200 nM dans le tampon de réaction. Ceci est fait pour évaluer le contexte de base de la stabilité du substrat.
    2. Préparez 7 aliquotes de 160 μL de DNM, F-sub et Dza préassemblés à des concentrations de 20 nM de DNM et de Dza et de 200 nM de F-sub dans le tampon de réaction. Sur les sept tubes, gardez le tube #1 comme arrière-plan vierge pour évaluer l’assemblage spontané du noyau de DNAzyme.
    3. Ajouter l’analyte dans les tubes #2-7 aux concentrations finales de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM et 1000 pM.
    4. Mélangez délicatement, faites tourner les tubes et classez les solutions en trois portions de 50 μL dans une plaque noire de 96 puits. Scellez la plaque avec un film optiquement transparent.
    5. Incuber la plaque au bain-marie à 55 °C pendant 1 h. Faites tourner l’assiette.
    6. Mesurez la fluorescence à 525 nm (λex = 495 nm). Calculez la moyenne et l’écart-type pour chaque point.
    7. Calculez le rapport blanc/de base en divisant le signal du tube qui contient F-sub et DNM par le signal du tube qui ne contient que F-sub. Assurez-vous que le rapport se situe dans la plage de 1,1 à 1,5.
    8. Calculez le rapport signal/blanc en divisant le signal du tube qui contient F-sub, DNM et l’analyte par le signal du tube qui contient uniquement F-sub et DNM. Considérez le signal comme vraiment positif s’il est supérieur à la moyenne de fond plus trois écarts-types.
    9. Répétez l’expérience deux fois et assurez-vous que l’écart-type entre les répétitions analytiques est inférieur à 0,5.

Résultats

Le but de la première expérience était de montrer l’assemblage du DNM avant le fragment synthétique de l’analyte. Tous les brins DNM constitutifs ont été ajoutés au tampon de réaction et assemblés dans le bécher. La taille et l’homogénéité du complexe DNM assemblé ont été évaluées par PAGE natif. La PAGE native montre le DNM assemblé avec l’analyte dans la voie 1 et deux brins DNM dans les voies 2 et 4. Si la nanomachine à ADN n’était pas assemblée, 2 ou 3 bandes distinctes seraient visibles au lieu d’une seule bande à faible mobilité (voie 2 sur la figure 2A).

La deuxième partie du Protocole implique la caractérisation fonctionnelle des performances du DNM et la détection des acides nucléiques cibles. Dans cette étude, le fragment synthétique de l’EBV 13972-14154 a été utilisé. À cette fin, les fragments de DNM préassemblés, ainsi que le Dza, ont été incubés avec différentes concentrations de l’analyte pendant 1 h à 55 °C. Deux valeurs de signal fluorescent de contrôle ont été mesurées : celle des fragments de DNM préassemblés et de Dzb sans l’analyte (blanc), et celle du bruit de fond de F-sub (de base). Trois mesures techniques ont été effectuées. À titre de statistiques, trois essais indépendants ont également été menés. Il convient de noter que la concentration de magnésium dans cette étude est supérieure à ce que l’on peut trouver dans la littérature30. Des niveaux élevés d’ions magnésium augmentent le signal dans tous les tubes à essai, car ils favorisent un clivage spontané du F-sub31. Nous avons optimisé la composition du tampon réactionnel au cours des étapes préliminaires du développement technologique et n’avons pas répété ce processus à chaque étude entreprise.

Après 1 h d’incubation, la fluorescence de l’échantillon a été mesurée à l’aide d’un spectrofluorimètre (voir tableau des matériaux). Pour confirmer la détection de l’ADN analysé par le DNM, nous avons comparé le signal fluorescent du capteur assemblé avec l’ADN analysé et celui du témoin négatif, qui ne contient aucun analyte ajouté. Le rapport signal/blanc (rapport entre les unités de fluorescence relatives moyennes des puits contenant l’analyte et des puits sans analyte) ne doit pas être inférieur à 1,5 pour confirmer la réussite de ladétection32. Le rapport blanc/base (fluorescence de la réponse du capteur en l’absence d’analyte divisée par celle du témoin F-sub uniquement) doit être compris entre 1,1 et 1,5 ; ce rapport peut être ajusté en modifiant les concentrations de DNM et de Dzb (la plage de concentration typique pour chacun est de 5 à 20 nM). Dans notre pratique, le LOD est quantifié comme l’intersection de la ligne de tendance et de trois écarts-types au-dessus du blanc moyen (Figure 2B). Le DNM est effectif si le niveau de détail est de <100 pM33. Le DNM doit être repensé si le niveau de détail est supérieur à 100 pM.

figure-results-1
Figure 1 : Le DNM à trois bras utilisé dans cette étude. Trois oligonucléotides, Dza, Dzb-Tile et Tile-Arm3, sont marqués respectivement en vert, bleu et violet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Caractérisation DNM. (A) Assemblage du DNM par électrophorèse native dans un gel de polyacrylamide à 12%, 80 V, 1 h, à l’aide d’une échelle d’ADN de 50 pb+. (B) La limite de détection de l’ADN synthétique après 60 minutes d’incubation à 55 °C. La ligne horizontale représente le seuil et la ligne verticale est le niveau de détail. Les valeurs moyennes de trois mesures indépendantes sont présentées avec un écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La conception de machines à ADN est simple mais nécessite une certaine expérience dans la conception de sondes d’hybridation ou de nanostructures d’ADN fonctionnelles. Il convient de garder le fragment d’analyte aussi court que possible afin de diminuer le nombre de structures secondaires possibles et de simplifier l’invasion de DNM dans la structure secondaire. La teneur en CG doit de préférence être inférieure à 60 % pour éviter des structures intramoléculaires stables. L’assemblage réussi du DNM est réalisé à des vitesses de refroidissement lentes. Dans certains cas, les DNM peuvent être assemblés spontanément dans le tube, et l’étape de recuit peut être éliminée. L’assemblage DNM peut être effectué dans un thermocycleur avec 0,1-0,3 °C/min ou dans de grands volumes d’eau de refroidissement. Dans le cas d’un mauvais assemblage DNM, nous suggérons de ralentir le changement de température pendant l’étape de recuit.

Pour mesurer la LD, au moins sept points de concentration de l’analyte sont nécessaires : la concentration de l’analyte 0 pM, qui est F-sub + DNM, et six concentrations d’analytes différentes, par exemple, dans la plage de 1 nM à 1 pM pour observer la dépendance linéaire (Figure 2B). Souvent, plus de sept points de concentration étaient utilisés pour une plus grande précision. Pour chaque point de concentration, trois essais techniques (50 μL chacun) doivent être effectués. Par conséquent, le volume total pour chaque concentration était de 160 μL (10 μL d’excès, compte tenu de l’erreur de la pipette).

La technique DNM présente une sensibilité plus élevée pour les SNV que les autres systèmes basés sur l’hybridation. Une sélectivité élevée à la SNV peut être pertinente pour certains objectifs, tels que l’identification de mutations ponctuelles associées au génotypage bactérien22 ou la sélection d’hétérozygotes chez les plantes25. Les analytes non spécifiques nécessiteraient la même procédure expérimentale. Pour éviter toute incompréhension de la SNV à une faible concentration d’analyte, nous suggérons de comparer le signal de l’analyte inconnu expérimental avec celui du signal d’un analyte totalement complémentaire connu de même concentration.

La méthode peut être appliquée avec succès à l’ADNsb, aux miARN, à l’ARN replié ou aux amplicons d’ADNdb. Les fragments d’ARN longs ou d’ADNdb, en particulier ceux riches en CG, peuvent nécessiter un DNM équipé de 4 à 6 bras de liaison à l’analyte, tandis que deux bras de liaison à l’analyte sont suffisants pour les analytes monocaténaires avec une structure secondaire instable (repliement ΔG supérieur à -10 kcal/mol). La méthode peut être appliquée pour la détection d’amplicons PCR, SDA ou LAMP. Le DNM peut être utilisé pour la détection sans amplification de l’ARNr dans des échantillons bouillis de culture bactérienne sans isoler l’ARN total 22,34,35. La technique pourrait ne pas bien fonctionner avec des concentrations aussi faibles que le niveau femtomolaire et avec des fragments d’ADNdb, dont la teneur en CG dans les régions flanquantes est supérieure à 65 %. La teneur en CG peut être estimée, par exemple, à l’aide du calculateur de teneur en CG de Biologics36. Nous suggérons d’ajouter les partiesd’accroche 37 aux conceptions DNM pour augmenter la sensibilité ou transformer l’ADNdb en ADNsb dans les cas de forte teneur en CG. Une autre limitation de la méthode est que les DNM sont sensibles à la qualité des échantillons, de sorte que les acides nucléiques sont soigneusement purifiés. Il en va de même pour la qualité des séquences d’oligonucléotides des DNM. Il est donc suggéré de vérifier la stabilité et la pureté de chaque apport d’oligonucléotides. Par rapport aux techniques d’amplification conventionnelles, la conception des DNM nécessite des compétences et, à la date de publication de l’article, est presque entièrement manuelle. Les DNM ont besoin de quelques tests préliminaires sur des fragments synthétiques avant de les soumettre à des échantillons d’ADN ou d’ARN réels, ce qui augmente la durée globale du développement du système de test.

La méthode est polyvalente et peut adopter différents types de sondes rapporteures. Il peut être multiplexé38, et la technique peut être transformée en une version colorimétrique si le F-sub est remplacé par un substrat formant G-quadruplex39. La présence de polymérase est associée à des erreurs dans la croissance du brin ; par conséquent, cette méthode est avantageuse par rapport à la PCR conventionnelle en temps réel et à la PCR numérique, ainsi qu’à d’autres techniques dépendantes des nucléases, telles que SHERLOCK et DETECTR, en raison de l’absence d’enzymes protéiques périssables et de la procédure de détection robuste et simple40,41.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Ekaterina V. Nikitina pour avoir aimablement fourni l’ADNg de l’EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya et Maria S. Rubel remercient le ministère de l’Éducation et des Sciences de la Fédération de Russie (subvention n° FSER-2022-0009) et le programme Priority 2030.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 1,5 mLBiofilCFT011015
100 pb + Échelle d’ADNEvrogenNL002
100-1000 & micro ; Pipette LKirgenKG-Pro1000
10-100 & micro ; Pipette LKirgenKG-Pro100
1-10 & micro ; Pipette LKirgenKG-Pro10
20-200 & micro ; Pipette LKirgenKG-Pro200
2-20 & micro ; Pipette LKirgenKG-Pro20
4x Gel Chargement ColorantEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Persulfate d’ammoniumCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Acide boriqueTechSnabH-0202
Système d’imagerie ChemiDocBioRad12003153
Costar Plaque de polystyrène noir à 96 puitsCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Bromure d’éthidiumBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Chlorure de magnésiumAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µ ; pointes en LKirgenKG1111-L
pipette 1000 & micro ; pointes en LKirgenKG1636
pipette 200 & micro ; Embouts LKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Chlorure de potassiumCarl Roth1782751
PowerPac Alimentation de baseBioRad1645050
Eau sans RNAse/DNAseInvitrogen10977049
Film d’étanchéité pour plaques PCRSovtechP-502
Chlorure de sodiumVektonHCh (0,1)
Spark Lecteur de microplaques multimodeTecanSpark- 10M
T100 amplificateurBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxyméthyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Bain-marieLOIPLB-140
Oligos utilisés
Analyte :Evrogenordre direct, purification
de dessalage standardGAGCACTTGGTCAGGCACACgg
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
strong>Tile-Arm3 :Evrogencommande directe, purification de dessalage standard
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile : AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogencommande directe, purification de dessalage standard
Dza : TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGTGCCTGACCA		Evrogencommande directe, purification
de dessalage standardF-sub oligonucléotide : AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezordre direct, purification HPLC
<

Références

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