Imagerie par microscopie à force atomique à grande vitesse de l’auto-assemblage du motif d’étoile à trois points d’ADN à l’aide d’un tapotement photothermique hors résonance

Résumé

Ici, nous montrons le protocole d’imagerie pour l’observation des interactions biomoléculaires avec le tapping photothermique hors résonance (PORT), où nous avons optimisé les paramètres d’imagerie, identifié les limites du système et étudié les améliorations potentielles dans l’imagerie de l’assemblage de motifs d’ADN en étoile à trois points.

Résumé

La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est une technique d’imagerie moléculaire populaire pour visualiser les processus biologiques d’une seule molécule en temps réel en raison de sa capacité à imager dans des conditions physiologiques dans des environnements liquides. Le mode de taraudage photothermique hors résonance (PORT) utilise un laser d’entraînement pour faire osciller le cantilever de manière contrôlée. Cet actionnement direct en porte-à-faux est efficace dans la gamme des MHz. Combiné à l’utilisation de la boucle de rétroaction sur la courbe de force du domaine temporel plutôt que sur l’amplitude de résonance, PORT permet une imagerie à grande vitesse jusqu’à dix images par seconde avec un contrôle direct des forces de l’échantillon de pointe. Il a été démontré que PORT permet l’imagerie de la dynamique d’assemblage délicate et le suivi précis des motifs formés par les biomolécules. Jusqu’à présent, la technique a été utilisée pour une variété d’études dynamiques in vitro , y compris les motifs d’assemblage d’ADN à 3 points en étoile montrés dans ce travail. Grâce à une série d’expériences, ce protocole identifie systématiquement les paramètres d’imagerie optimaux et les limites ultimes du système d’imagerie HS-PORT AFM et la manière dont ils affectent les processus d’assemblage biomoléculaire. De plus, il étudie les effets thermiques indésirables potentiels induits par le laser d’entraînement sur l’échantillon et le liquide environnant, en particulier lorsque le balayage est limité à de petites zones. Ces résultats fournissent des informations précieuses qui permettront de faire progresser l’application du mode PORT dans l’étude de systèmes biologiques complexes.

Introduction

La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est une technique d’imagerie 1,2,3,4 qui se développe rapidement. Il fonctionne à des vitesses qui permettent aux chercheurs de visualiser les interactions biomoléculaires en temps réel 5,6,7,8,9. Le tapping hors résonance photothermique (PORT) est un mode d’imagerie hors résonance similaire au tapping de force de crête^10,11, au mode de force pulsée^12,13 ou au mode de saut¹⁴. Cependant, plutôt que d’osciller verticalement le scanner, PORT oscille verticalement uniquement le cantilever grâce à un laser d’excitation focalisé sur le cantilever (généralement près du point de serrage). Le porte-à-faux se déforme en raison de l’effet bimorphe : un laser d’excitation modulé en puissance chauffe périodiquement le porte-à-faux revêtu, qui se plie en raison des différents coefficients de dilatation thermique du porte-à-faux et des matériaux de revêtement¹⁵. Le cantilever et le chauffage de l’échantillon peuvent être minimisés en utilisant un laser d’entraînement qui est périodiquement éteint et rallumé pendant chaque cycle d’oscillation, plutôt que d’utiliser un entraînement sinusoïdal complet⁵.

L’ADN a été utilisé pour former des motifs biologiquement pertinents, structurellement intéressants et biochimiquement utiles pendant un certain nombre d’années^{16, 17, 18, 19, 20}. De plus, il a été démontré que les structures de l’ADN sont parfaitement adaptées pour caractériser la qualité d’imagerie AFM²¹ et pour évaluer l’effet de pointe de l’AFM²² à grande vitesse. Les étoiles à trois points d’ADN à extrémité arrondie (3PS) sont devenues pratiques en tant que système modèle programmable pour étudier l’organisation supramoléculaire de molécules de structure similaire dans des systèmes biologiques autrement complexes¹⁹. Auparavant, l’auto-assemblage des réseaux formés par des monomères d’ADN trimérique à extrémité émoussée était suivi via HS-AFM²³. Finalement, ceux-ci s’organisent en grands réseaux d’ordre hexagonal. Ici, l’auto-assemblage d’étoiles à 3 points^{d’ADN 19} est imagé avec la technique PORT à des vitesses de balayage suffisamment rapides pour suivre l’auto-assemblage et ses mécanismes de correction²⁴ tout en assurant une perturbation minimale du processus ou des dommages à l’échantillon. Comme pour tout mode HS-AFM, il y a un compromis entre la qualité d’image réalisable, la vitesse d’imagerie et la perturbation indésirable de l’échantillon. En choisissant le bon compromis, on peut mieux comprendre les modèles d’auto-organisation des assemblages supramoléculaires. Ce protocole utilisera donc une configuration similaire avec DNA 3PS comme système modèle pour optimiser les paramètres spécifiques à PORT. Cela permettra de fonctionner à des vitesses d’imagerie rapides avec des tailles de balayage suffisamment grandes tout en minimisant les dommages aux échantillons.

Protocole

1. Echantillon et tampons

REMARQUE : La tuile d’ADN utilisée dans cette étude est le motif d’étoile à 3 points développé au laboratoire Mao de l’Université Purdue^19,25. Tous les oligonucléotides utilisés dans cette étude ont été achetés auprès d’Integrated DNA Technologies, Inc. Rassemblez les matériaux et les réactifs nécessaires.

1. Mélangez les ADN monocaténaires (ADNsb) à un rapport molaire de 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM pour S2 et 1,8 μM pour S3) dans le tampon de recuit (5 mM TRIS, 1 mM EDTA et 10 mM MgAc₂). La concentration finale du motif d’ADN doit être de 0,6 μM (49 ng/μL avec un poids moléculaire de 3PS de 82020,3 g/mol).
2. Placez la solution d’ADN dans un récipient résistant à la chaleur et chauffez-la à 80 °C. Refroidissez lentement la solution d’ADN de 80 °C à 20 °C sur une période de 4 h. Ce processus de recuit aide les oligonucléotides d’ADNsb à former le motif d’ADN double brin souhaité.
3. Pour la purification, chargez la solution d’ADN recuit sur un gel d’agarose à 3 % pour éliminer l’excès d’ADNsb et tout produit secondaire indésirable. Faites fonctionner le gel à 3 % à 60 V pendant environ 2,5 h dans un tampon de fonctionnement contenant 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) et 10 mM Mg (CH₃COO)₂.
4. Identifiez et localisez la bande sur le gel qui contient le motif d’ADN. Assurez-vous que le groupe a migré vers une position spécifique en fonction de sa taille.
5. Excisez soigneusement la bande contenant le motif d’ADN du gel. Extrayez le motif d’ADN du fragment de gel excisé en le plaçant dans une colonne de centrifugation d’extraction de gel et en le centrifugant à 3 000 x g et 4 °C pendant 10 min.
6. Remplacez le tampon dans le motif d’ADN extrait par le tampon de recuit à l’aide d’un concentrateur centrifuge. Centrifuger à 3000 x g à température ambiante (ou moins) jusqu’à ce que la solution concentrée soit inférieure à 100 μL. Ensuite, ajoutez 300 μL de tampon de recuit et répétez cette étape deux fois pour vous assurer que le tampon est remplacé.
7. Diluer le motif d’ADN à 6 nM à des fins d’imagerie. Utilisez un spectrophotomètre ou d’autres méthodes appropriées pour déterminer et ajuster avec précision la concentration. Le motif de l’ADN est maintenant prêt pour l’imagerie.
   REMARQUE : Tous les tampons du protocole ont un pH de 8,0. Les informations de séquence pour les trois bandes respectives sont les suivantes :
   S1 : AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2 : ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3 : CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Croissance de la pointe en porte-à-faux

1. Montage en porte-à-faux sur le support de porte-à-faux SEM : Assurez-vous que les porte-à-faux sont propres et exempts de tout contaminant. Montez les porte-à-faux sur un support approprié compatible avec le système SEM. La conception du support en porte-à-faux sur mesure peut être partagée sur demande.
2. Injection de gaz : Chauffer le gaz précurseur (par exemple, le phénanthrène C₁₄H₁₀ précurseur pour les pointes en carbone amorphe) à utiliser sur le système d’injection de gaz pour faire pousser la nouvelle pointe. Dès que le vide est inférieur à ^10-5 mbar, purgez la conduite d’injection de gaz 10 fois pendant 2 s pour vous assurer qu’il n’y a pas d’air résiduel indésirable dans la conduite de la buse (cela doit être fait avec la vanne vers la chambre du pistolet fermée).
3. Réglage de la position de la pointe : Utilisez la microscopie électronique à balayage (MEB) pour localiser l’extrémité du cantilever. Inclinez le support en porte-à-faux à un angle (par exemple, 11° dans ce cas) équivalent à celui que le porte-à-faux présentera lorsqu’il sera placé sur le support en porte-à-faux AFM par rapport à la surface afin que l’extrémité cultivée soit perpendiculaire à la surface pendant l’imagerie. Ajustez la position et la mise au point du MEB pour obtenir une vue claire de la pointe du cantilever, où une nano-pointe de carbone pointue sera développée.
4. Dépôt induit par faisceau d’électrons focalisé (FEBID) :
   1. Réglez les paramètres de dépôt sur le logiciel sélectionné (dans ce cas, SmartFIB), tels que le courant de faisceau (I) et la tension d’accélération (V), la distance de travail (WD), le grossissement, la forme exposée, la dose/le temps de dépôt et le temps de séjour. Les paramètres suivants ont été utilisés pour développer des pointes en carbone amorphe, qui présentent de bonnes propriétés mécaniques pour l’imagerie AFM, conduisant à des longueurs d’environ 130 nm et à des rayons dans la gamme de 2 à 4 nm :
      Sélectionnez un point/point comme forme exposée
      WD = 5 mm
      I = 78 pA et V = 5 kV
      Temps de séjour = 1 μs
      Dose = 0,05 nC et temps de dépôt = 0,64 s
      Grossissement = 20000x
   2. Commencez le processus de dépôt pour faire croître la pointe en irradiant le faisceau d’électrons à un endroit sur la pointe en porte-à-faux tout en injectant simultanément le gaz précurseur, fermant le gaz lorsque le dépôt est terminé. Dans ce cas, le logiciel SmartFIB le fait automatiquement après avoir configuré la recette mentionnée ci-dessus.
5. Analyse post-croissance : Effectuez une imagerie MEB post-croissance pour examiner l’extrémité nouvellement cultivée et vous assurer de sa qualité et de ses caractéristiques (rayon et longueur de l’extrémité). Attendez 1 à 2 minutes après la croissance de la pointe pour vous assurer que tout le gaz précurseur est pompé afin d’éviter un redépôt pendant l’imagerie MEB. Retirez le porte-échantillon de la chambre MEB.
6. Recyclage en porte-à-faux : Si le système MEB dispose également d’un faisceau d’ions focalisés (FIB) combiné, retirez une pointe endommagée ou sale précédemment cultivée en la fraisant avec le système FIB en utilisant de faibles courants FIB (par exemple, 1 pA, pour éviter d’endommager le porte-à-faux). Effectuez l’enlèvement de la pointe en fraisant en section transversale, de l’extrémité de la pointe à la base, pour éviter l’affaissement de la pointe. Cela permettra d’en faire repousser un nouveau.

3. Matériel HS-AFM

1. La configuration d’imagerie est composée de la tête PORT^{5, 26} (Figure 1A) sur mesure, d’un scanner haute vitesse²⁶ avec un disque d’échantillon avec mica sur le dessus, d’un contrôleur compatible²⁷, d’un amplificateur haute tension avec la bande passante élevée requise pour l’imagerie haute vitesse, d’une base AFM et d’un PC avec le logiciel requis pour contrôler l’équipement mentionné ci-dessus²⁷.
   REMARQUE : Dans ce cas, il s’agit de composants open-source pour lesquels des plans peuvent être obtenus auprès du Laboratoire de bio- et nano-instrumentation de l’EPFL^{27, 28}. Il est également possible d’assister à des ateliers sur la construction de la tête et du contrôleur PORT²⁹, ainsi que de télécharger et d’utiliser le logiciel basé sur LabView.
2. Placez avec précaution un porte-à-faux ultra-court (par exemple, AC10DS ou équivalent) sous la pince à ressort du support en porte-porte-à-faux à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous que la puce en porte-à-faux est fixe et stable.
3. Ajouter 50 μL de liquide à l’aide d’une seringue par l’orifice d’accès au liquide gauche, comme le montre la figure 1B. Avec le laser d’excitation toujours éteint, alignez le laser de lecture sur le cantilever à l’aide des trois boutons dédiés sur la tête AFM illustrés à la Figure 1A. Pour ce faire, observez l’ombre du porte-à-faux sur un papier blanc tout en maximisant la somme (méthode de l’ombre). Ensuite, centrez le spot laser sur la photodiode à l’aide des deux boutons dédiés.
4. Allumez et alignez le laser d’entraînement en cochant la case Activation de l’excitation dans Excitation VI, de sorte qu’il actionne et fasse osciller le cantilever. Affichez le signal d’excitation en porte-à-faux et le signal de déviation en porte-à-faux sur un oscilloscope connecté. Si l’oscillation de déflexion est trop faible (ou inexistante), il se peut que le laser d’entraînement soit très éloigné du cantilever. Dans ce cas, utilisez la méthode de l’ombre et désactivez le laser de déviation pour un alignement plus facile. Maximisez l’amplitude d’oscillation à l’aide des boutons de réglage du laser d’entraînement illustrés à la Figure 1A.
5. Pour régler l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux dans PORT, entrez dans la commande correspondante du logiciel la tension crête à crête envoyée au circuit de commande de la diode laser (désormais, entrée AC crête à crête) dans Excitation VI. Pour maintenir la diode laser dans le régime de conduction et, par conséquent, le laser, ajoutez une tension continue au circuit de commande de la diode laser (désormais, entrée de décalage CC), ce qui se fait également à partir d’une boîte de configuration dans Excitation VI. Les deux affecteront également la puissance du laser, qui peut être mesurée avec un wattmètre laser et est utilisée pour régler l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux.
6. Déterminez la fréquence maximale d’excitation photothermique qui peut être appliquée au cantilever, qui doit être inférieure à la fréquence de résonance du cantilever. Déterminez la fréquence de résonance à l’aide d’une mélodie thermique ou d’un balayage de fréquence. Les cantilevers utilisés dans cette étude (AC10DS), dont la fréquence de résonance dans les liquides est d’environ 400 kHz (1 MHz dans l’air)³⁰, ont une région de courbure quasi statique inférieure à 300 kHz5^. Ainsi, des fréquences PORT inférieures à cette limite (environ 100-200 kHz) doivent être utilisées.
7. Ajustez les paramètres d’imagerie et les paramètres de vitesse de PORT et de vitesse de balayage aux valeurs requises dans l’excitation et le balayage visuel respectivement (les paramètres utilisés dans cet article sont indiqués dans les descriptions des figures). Une fois la configuration et les paramètres d’imagerie configurés, effectuez les expériences d’imagerie requises pour observer et suivre les interactions moléculaires.
   REMARQUE : Étant donné que les cantilevers AC10DS ne sont plus vendus, une alternative telle que Fastscan D ou BioLever³¹ peut devoir être utilisée jusqu’à ce qu’un équivalent soit disponible.

4. Obtenir des courbes d’interaction appropriées

1. Dans un premier temps, approchez-vous de la surface de l’échantillon en mode contact en cliquant sur Démarrer sur le VI du contrôleur Z réglé sur le mode contact.
   1. Dans ce mode, la pointe AFM entre en contact direct avec l’échantillon. Une fois la surface atteinte, effectuez une courbe force en fonction de la distance dans la rampe VI pour obtenir l’étalonnage de la sensibilité à la déflexion en porte-à-faux.
   2. Estimez également la constante de ressort en porte-à-faux, soit à partir des spécifications du fournisseur de cantilever (moins précisément), obtenues avec un interféromètre, soit par un étalonnage basé sur la mélodie thermique après l’étalonnage de la sensibilité à la déflexion. Un étalonnage précis en porte-à-faux est essentiel pour un contrôle précis de la force de l’échantillon de pointe.
2. Après avoir complètement rétracté le piézo Z de la surface où la pointe ne peut pas atteindre la surface en cliquant sur Haut dans le VI du contrôleur Z, passez en mode PORT dans le VI du contrôleur Z et activez le laser d’excitation dans la case à cocher VI d’excitation. Pour commencer, réglez le mode PORT pour qu’il fonctionne à la fréquence souhaitée dans Excitation VI, qui, dans ce cas expérimental, est de 100 kHz, à l’aide d’un cantilever AC10DS.
3. Enregistrez l’oscillation sans porte-à-faux à proximité mais sans toucher la surface. Ensuite, tournez le Feedback dans le contrôleur Z ON en contact avec la surface à enregistrer et cliquez sur Corriger pour obtenir l’oscillation du cantilever lorsque le cantilever est en contact intermittent avec la surface, tous deux en nanomètres. Soustrayez la courbe d’oscillation libre de la courbe de contact intermittent pour obtenir la courbe d’interaction réelle, en les convertissant en pN à l’aide de la constante de ressort en porte-à-faux (dans ce cas, 0,1 N/m).

5. Imagerie HS-AFM

1. Préparer une solution de Mg(CH₃COO)₂ à une concentration de 10 mM. À l’aide d’une seringue Hamilton, injecter 50 μL de la solution préparée de 10 mM de Mg(CH₃COO)₂ dans le canal fluidique du support en porte-à-faux, créant ainsi une goutte de liquide qui enveloppe le porte-à-faux.
2. Approchez progressivement le cantilever de la surface en cliquant sur Démarrer sur le Z Controller VI. Une fois la surface détectée, activez la fonction de rétroaction et trouvez le sommet de la courbe d’interaction dans les courbes de force ORT VI. Trouvez la force de consigne la plus basse qui permet un suivi correct (en dessous de 300 pN pour éviter d’endommager les échantillons biologiques fragiles).
3. Réglez la taille de balayage dans le VI de balayage sur 800 nm par 800 nm et le débit de ligne sur 100 Hz. Numérisez la surface en cliquant sur la flèche de l’image (vers le bas) dans le VI de balayage pour vérifier la qualité de la surface. Si des contaminations sont détectées, résolvez le problème en nettoyant la surface, le porte-à-faux et/ou le support en porte-à-faux avant de continuer.
4. Après le balayage, rétractez le porte-à-faux de la surface en cliquant sur Retirer dans le VI du contrôleur Z. Retirez la solution tampon du trou du support en porte-à-faux à l’aide d’une seringue Hamilton pour éviter les problèmes de volume mort.
5. Préparez une solution d’ADN 3PS dilué à partir de la partie 1 du protocole. Injectez 50 μL de la solution d’ADN 3PS dilué dans le canal dédié du support en porte-à-faux.
6. Démarrez le processus d’imagerie en répétant les étapes 5.2 et 5.3, en balayant une zone de 800 nm sur 800 nm à une fréquence de ligne par défaut de 100 Hz (256 lignes × 256 pixels). Après le balayage initial, ajustez la taille et la vitesse de l’image dans Scan VI aux valeurs spécifiées pour une acquisition de données ultérieure.
7. Maintenez le point de consigne de force d’entrée de l’interaction pointe-échantillon dans la boîte de point de consigne VI du contrôleur Z au niveau le plus bas requis pour un suivi correct (inférieur à 300 pN) tout au long du processus d’imagerie afin de minimiser les dommages/perturbations de l’échantillon, sauf indication contraire. Répétez ce processus pour toutes les zones d’échantillonnage requises.

6. Traitement d’image

1. Configurez l’environnement pour l’exécution du code de traitement par lots Pygwy (Python pour Gwyddion) personnalisé, en vous assurant que Python et toutes les bibliothèques nécessaires sont disponibles. Plus d’informations peuvent être trouvées sur le site Web de Gwyddion³² sont correctement installés sur le système. Cela garantit que le code fonctionne sans problème et peut accéder aux fonctionnalités requises.
2. Ouvrez le code de traitement par lots Pygwy personnalisé (fourni sur demande). Cela permettra d’accéder aux outils et fonctionnalités nécessaires au traitement et à l’analyse des images.
3. Commencez le traitement de l’image en effectuant une correction de la ligne médiane horizontale sur les images. Cette étape vise à éliminer toutes les irrégularités ou artefacts présents dans les lignes de balayage, en veillant à ce que les étapes de traitement ultérieures soient basées sur des données précises. Après la suppression de l’arrière-plan du plan, appliquez la correction de ligne. Utilisez l’élimination des cicatrices pour améliorer davantage les images en éliminant toutes les marques ou imperfections indésirables causées par des facteurs externes. Cette étape améliore l’aspect visuel général des images.
4. Améliorez la visibilité et le contraste des images en ajustant la carte de hauteur des couleurs. Cela permet de s’assurer que les caractéristiques d’intérêt sont clairement visualisées et se démarquent dans les images.
5. Sélectionnez les images traitées qui doivent être combinées dans une vidéo. Déterminez la fréquence d’images souhaitée pour la vidéo. Dans ce cas, réglez-le sur 7 images par seconde (fps).
6. Calculez la durée de chaque image. Utilisez Fiji (ImageJ) pour combiner les images traitées dans une vidéo. Assurez-vous que la fréquence d’images et la durée d’image sont correctement définies.

Résultats

Dans cette étude, le processus d’assemblage dynamique de motifs d’ADN en étoiles à 3 points en îlots stables a été observé avec succès en utilisant les capacités de l’AFM HS-PORT. Cette technique nous a permis de capturer l’assemblage de ces structures en temps réel. Dans la figure 2A,B, nous obtenons une image claire à des fréquences de ligne de 100 Hz et 200 Hz, respectivement, pour une fréquence de PORT de 100 kHz (taille de balayage de 800 nm par 800 nm). Cela correspond à 3,9 et 1,95 cycles d’oscillation par pixel, respectivement. Cependant, l’imagerie à des vitesses plus élevées sans augmentation simultanée du taux PORT qui permettrait un minimum d’un cycle d’oscillation par pixel réduira considérablement la qualité de l’image, comme le montre la figure 2C (0,78 d’un cycle d’oscillation par pixel). La vitesse d’imagerie est limitée par la vitesse à laquelle le porte-à-faux sonde la surface avec un contrôle approprié de la force de l’échantillon de pointe, car le taux de changement de topographie devient trop rapide pour être suivi à la vitesse d’échantillonnage de surface.

En plus de définir un taux PORT suffisamment élevé, il est important que les courbes PORT contiennent les informations nécessaires pour contrôler les forces. En particulier, la traînée hydrodynamique et la faible bande passante de détection peuvent masquer la force appliquée. La figure 3 montre la déviation en porte-à-faux à différentes distances de la surface de l’échantillon et les taux de fréquence d’excitation en utilisant une moyenne de 4096 courbes pour réduire le bruit. Les courbes bleues de la figure 3A (pour un débit PORT de 100 kHz) et de la figure 3D (pour un débit PORT de 500 Hz) représentent le mouvement en porte-à-faux lorsque le porte-à-faux est éloigné de la surface et oscille librement (sans toucher la surface pendant un cycle d’oscillation). Les courbes rouges montrent la déviation en porte-à-faux lorsque le cantilever oscille près de la surface et entre en contact par intermittence avec la surface, sondant l’échantillon. Pour obtenir la courbe d’interaction réelle et, par conséquent, l’interaction pointe-échantillon, nous soustrayons la courbe bleue de la courbe rouge pour obtenir les figures 3B et E, respectivement. La figure 3B illustre un exemple de courbe d’interaction claire requise pour l’imagerie non destructive d’échantillons biologiques. Cette configuration permet d’obtenir la bonne qualité d’image illustrée à la figure 3C, où le débit PORT est de 100 kHz. Lorsque nous augmentons la fréquence d’excitation à proximité de la résonance en porte-à-faux, à un moment donné, le contrôle de rétroaction se détériore, même lorsque le cantilever affiche une oscillation d’amplitude suffisante pour se détacher de la surface après avoir augmenté la puissance du laser d’excitation (Figure 3E). Si la fréquence PORT est trop proche de la fréquence de résonance en porte-à-faux, la résonance en porte-à-faux limite la réponse temporelle de la dynamique en porte-à-faux. La flexion en porte-à-faux ne représente donc plus précisément l’interaction pointe-échantillon, et la courbe d’interaction que nous obtenons est obscurcie. Cela entraîne une dégradation de la qualité de l’image, comme le montre la figure 3F.

Une courbe d’interaction compromise à des fréquences PORT plus élevées pourrait également se produire en raison de l’efficacité d’actionnement réduite à des fréquences plus élevées³³, qui est actuellement l’un des facteurs limitants des porte-à-faux AFM commerciaux à grande vitesse. Cette diminution finit par atteindre un niveau seuil dans l’attraction, auquel une imagerie correcte est entravée : l’amplitude d’oscillation peut être insuffisante pour se détacher de la surface, et la pointe est toujours en contact, endommageant les structures de l’échantillon. Pour contrer la diminution de l’amplitude causée à des taux de PORT plus élevés, nous avons exploré une augmentation de la puissance laser. Nous avons utilisé une tête PORT qui peut atteindre des puissances laser plus élevées pour mieux observer cet effet. La puissance laser du laser d’excitation, que nous avons mesurée à l’aide d’un wattmètre, a été divisée en composants DC et AC. La puissance totale est contrôlée en ajustant sur le logiciel la tension crête à crête (entrée CA crête à crête) et la tension continue (entrée de décalage CC) envoyée au circuit de commande de la diode laser. La figure 4A montre l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux crête résultant d’une augmentation de l’entrée CA crête à crête. Comme prévu, l’amplitude d’oscillation est bien corrélée avec la valeur d’entrée AC. Il est important de noter que ces amplitudes de crête à crête sont plus élevées que ce qui est normalement utilisé dans l’imagerie PORT. Lors de l’imagerie d’échantillons fragiles, l’amplitude AC est de l’ordre de 10 à 30 nm. La figure 4B montre l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux crête pour augmenter les entrées de décalage CC. L’amplitude d’oscillation crête à crête reste assez constante sur la plage de tension de décalage CC. Nous attribuons les petites variations aux non-linéarités dans la détection. La figure 4C illustre l’augmentation des composants de puissance laser AC et DC résultant de l’augmentation du courant alternatif crête à crête. La figure 4D illustre l’augmentation des composants de puissance laser AC et DC résultant de l’augmentation du décalage d’entrée DC.

Les effets de l’augmentation de l’entrée CA crête à crête et de l’entrée de décalage CC ont été testés séparément pour déterminer les effets respectifs sur la puissance totale et l’amplitude d’oscillation. Une augmentation de la puissance du laser provoque une perturbation de l’échantillon, probablement en raison d’une augmentation de la température, tandis qu’une augmentation de l’amplitude d’oscillation augmentera la force d’impact sur l’échantillon⁵. L’augmentation exclusive de l’entrée CA crête à crête aura moins d’impact sur l’augmentation totale de la puissance laser, comme le montre la figure 4C, et augmentera principalement l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux (et par conséquent la force d’impact), comme le montre la figure 4A. L’augmentation de l’entrée de décalage CC aura un effet plus important sur l’augmentation de la puissance de sortie du laser, comme le montre la figure 4D, qui chauffe l’échantillon mais aura un effet négligeable sur l’amplitude de déviation, comme le montre la figure 4B. Les résultats d’imagerie sont représentés dans les figures 4E,F. La figure 4E représente l’ADN 3PS pour l’entrée CA crête à crête la plus basse (image de gauche, entourée en bleu) et l’entrée CA crête à crête la plus élevée (image de droite, entourée en rouge), ce qui entraîne des dommages à l’échantillon, probablement en raison des forces plus élevées. La figure 4F présente l’ADN 3PS pour l’entrée de décalage CC la plus basse (image de gauche, entourée en bleu) et l’entrée de décalage CC la plus élevée (image de droite, entourée en rouge), où les structures sont endommagées.

(A) La tête PORT sur le scanner et la base de l’AFM, montrant (i) le bouton de réglage de la mise au point du laser de lecture sur le porte-à-faux, (ii) le bouton de réglage de la position du laser de lecture sur le porte-à-faux, (iii) le bouton de réglage de la position horizontale du laser sur la photodiode, (iv) le bouton de réglage de la position verticale du laser sur la photodiode, et (v) des boutons pour régler la position du laser d’entraînement photothermique sur le cantilever. (B) Un gros plan du porte-à-faux dans la vue en coupe transversale de la tête avec l’étage d’échantillonnage, où (vi) est l’agrafe à ressort qui maintient le porte-à-faux. Le canal d’injection de liquide est marqué en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Échantillon d’ADN 3PS imagé avec AC10 à une fréquence PORT de 100 kHz à différentes fréquences de lignes. (A) 100 Hz (3,9 cycles d’oscillation par pixel), (B) 200 Hz (1,95 cycles d’oscillation par pixel) et (C) 500 Hz (0,78 cycles d’oscillation par pixel). Les images ont été prises à des points de consigne de 350 pN ou moins. Barre d’échelle 200 nm. Une courbe de force pour obtenir la sensibilité à la déflexion a été prise après l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Déviation en porte-à-faux, courbe d’interaction et qualité d’image à des fréquences de port de 100 KHz et 500 kHz. (A) Déviation en porte-à-faux (oscillation libre en porte-à-faux proche mais ne touchant pas la surface en bleu, et l’oscillation du porte-à-faux lorsque le porte-à-faux est en contact intermittent avec la surface en rouge), (B) courbe d’interaction et (C) qualité d’image respective pour une fréquence de PORT de 100 kHz. (D) Déviation en porte-à-faux (oscillation libre du porte-à-faux proche mais ne touchant pas la surface en bleu, et l’oscillation du porte-à-faux lorsque le porte-à-faux est en contact intermittent avec la surface en rouge), (E) courbe d’interaction et (F) qualité d’image respective pour une fréquence de port de 500 kHz. Les images ont été prises à une fréquence de ligne de 100 Hz. Échelle barre 200 nm. Une courbe de force pour obtenir la sensibilité à la déflexion a été prise après l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de la tension d’entrée CA crête à crête Tension d’entrée décalée CC. Effet de l’augmentation de la tension d’entrée AC crête à crête (A) et de la tension d’entrée de décalage CC (B) sur l’oscillation crête à crête du porte-à-faux. Effet de l’augmentation de la tension d’entrée AC crête à crête (C) et de la tension d’entrée de décalage DC (D) sur l’alimentation laser AC et DC. Qualité d’image au minimum (entouré en bleu) et maximum (entouré en rouge) (E) tension d’entrée AC crête à crête et (F) tension d’entrée décalée CC. Lors de l’augmentation de la tension d’entrée AC crête à crête, la tension d’entrée de décalage DC a été maintenue à 600 mV. Lors de l’augmentation de la tension d’entrée de décalage CC, la tension d’entrée CA crête à crête a été maintenue à 200 mV. L’intégrité de l’échantillon est compromise pour la configuration haute puissance. La fréquence PORT a été maintenue à 100 kHz et la fréquence de ligne à 100 Hz. Barre d’échelle 200 nm. Une courbe de force pour obtenir la sensibilité à la déflexion a été prise après l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Lors de l’imagerie d’échantillons biologiques délicats, les modes d’imagerie par tapotement hors résonance dans l’AFM sont particulièrement utiles car ils peuvent contrôler directement les forces d’interaction pointe-échantillon¹⁰. Parmi eux, le mode PORT se distingue par les taux d’oscillation plus élevés qu’il peut atteindre, ce qui permet des taux de balayage plus élevés. Comme PORT actionne directement et uniquement le cantilever avec un laser, il permet une excitation à des fréquences beaucoup plus élevées que les modes de tapotement conventionnels hors résonance, en particulier lors de l’utilisation de cantilevers ultracourts avec des fréquences de résonance élevées⁵. Cependant, lors de l’utilisation de PORT pour HS-AFM, il faut faire attention aux paramètres d’imagerie pour obtenir une bonne qualité d’image.

Comme le montre la figure 2, l’augmentation des taux de balayage sans augmenter simultanément les taux de PORT entraînera une imagerie de mauvaise qualité. Tout d’abord, les taux PORT entraînant moins d’un cycle d’oscillation par pixel réduiront considérablement la qualité de l’image. La vitesse d’imagerie est intrinsèquement limitée par la vitesse à laquelle le porte-à-faux sonde la surface avec un contrôle approprié de la force de l’échantillon de pointe. Dans PORT, la commande de rétroaction agit discrètement à la fin de chaque cycle d’oscillation³⁴. Ce taux d’échantillonnage limité induit un retard pur dans la boucle de rétroaction, limitant ainsi la bande passante de rétroaction réalisable. Si le taux de changement de topographie devient trop rapide pour être suivi au taux d’échantillonnage PORT, la topographie ne peut plus être détectée ou suivie avec précision par la boucle de rétroaction. Le taux PORT doit donc être augmenté pour résoudre fidèlement l’échantillon à des vitesses de surface plus élevées. Cependant, la fréquence de résonance du cantilever limite intrinsèquement le taux de PORT maximal que nous pouvons utiliser. Si le taux PORT est proche de la fréquence de résonance du cantilever, la déviation mesurée par la méthode du levier optique ne représente plus fidèlement les forces de l’échantillon de pointe. Pour obtenir une courbe d’interaction pointe-échantillon correcte, la bande passante mécanique du porte-à-faux et la bande passante électrique du système AFM doivent être suffisamment grandes pour détecter les composantes de Fourier de la courbe de déviation qui sont plusieurs fois supérieures à celle de la fréquence PORT. Si l’une de ces largeurs de bande est trop faible, la courbe d’interaction ne montre plus la coupure unilatérale (Figure 3A), mais plutôt un comportement sinusoïdal (Figure 3D) qui masque l’interaction réelle de l’échantillon de pointe (Figure 3E). Cela conduit à un mauvais contrôle de la force dans l’imagerie (Figure 3F). Des porte-à-faux même plus petits affichant une fréquence de résonance élevée, qui possèdent en même temps de faibles constantes de ressort, sont donc nécessaires pour augmenter encore la vitesse du PORT. Des débits PORT et des vitesses de balayage aussi élevés représentent un défi pour l’électronique AFM, nécessitant une conception logicielle et électronique soignée qui offre les bandes passantes élevées requises et des stratégies de traitement du signal numérique optimisées.

L’un des avantages de PORT par rapport au mode de taraudage AFM à grande vitesse est que la vitesse d’échantillonnage de surface peut être réglée. En mode TAPOTEMENT AFM, le taux d’échantillonnage de surface est donné par la fréquence de résonance du cantilever. Lorsque nous opérons en PORT bien en dessous de la fréquence de résonance en porte-à-faux, nous supposons que chaque échantillonnage de surface fournit un point de données valide. Ainsi, la bande passante de détection PORT est donnée par la fréquence de Nyquist à la moitié du débit PORT. Dans le cas du mode de tapotement, la bande passante de détection est donnée par f₀/2Q³⁵. Avec les derniers développements de PORT, nous pouvons augmenter progressivement le taux de PORT jusqu’à la fréquence de résonance. Dans cette situation, PORT et le mode de taraudage deviennent presque identiques car, à ces fréquences, PORT ne peut pas détecter avec précision l’interaction entre le cantilever et la pointe de l’échantillon, comme le montre la figure 3E. Lorsqu’il fonctionne à la fréquence de résonance, l’amplitude d’oscillation plus grande de PORT par rapport au mode de tapotement devient un inconvénient. L’objectif de l’augmentation de la fréquence d’imagerie PORT reste donc d’augmenter la fréquence de résonance en porte-à-faux pour maintenir le fonctionnement avec une vitesse PORT suffisamment inférieure à la fréquence de résonance.

Au fur et à mesure que nous augmentons le taux PORT pour permettre des taux de balayage plus rapides, nous serons confrontés à un autre problème inhérent à l’excitation photothermique en porte-à-faux : à des fréquences plus élevées, l’amplitude d’oscillation diminue en raison d’une diminution de l’efficacité de l’excitation photothermique, au point que nous devons augmenter la puissance du laser, ce qui entraîne une augmentation de la température de l’échantillon. L’augmentation de la vitesse PORT entravera l’équilibrage de la puissance laser et de l’amplitude d’oscillation, car une puissance d’excitation plus élevée est nécessaire pour compenser une efficacité d’actionnement réduite qui entraîne des dommages à l’échantillon. À des niveaux de puissance laser plus élevés, nous ne pouvions plus observer l’échantillon, malgré l’utilisation du point de consigne de force le plus bas possible (panneaux de droite sur les figures 4E et F). Nous devons faire attention à la façon dont nous allons augmenter l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux et augmenter la puissance du laser. Il y a deux paramètres que nous pouvons régler pour augmenter la puissance du laser. Tout d’abord, l’entrée CA crête à crête qui contrôle le signal sinusoïdal envoyé à la diode laser pour faire varier sinusoïdalement l’intensité de la puissance laser délivrée. Deuxièmement, la tension d’entrée de décalage CC qui maintient la diode laser sur le régime de conduction et, par conséquent, le laser. Une augmentation du premier doit être combinée avec une augmentation du second, car une augmentation de l’amplitude du signal alternatif envoyé au laser nécessite une augmentation de la tension continue pour éviter de franchir le seuil laser. Cependant, seule l’entrée CA crête à crête influence l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux, comme le montre la figure 4A. Les tensions continues n’entraînent pas de variations d’amplitudes d’oscillation (Figure 4B). Ainsi, si nous voulons un actionnement sinusoïdal, nous devons régler la tension continue à la tension minimale qui permet au laser à diode d’être dans le régime laser. Alternativement, nous pouvons minimiser l’échauffement en éteignant et en rallumant périodiquement la diode laser pendant chaque cycle d’oscillation plutôt que d’utiliser un entraînement sinusoïdal complet⁵. L’oscillation de température nécessaire pour actionner le porte-à-faux dans l’excitation photothermique peut être obtenue plus efficacement en éteignant le laser pendant une partie du cycle, ce qui fait baisser la température du porte-à-faux et, par conséquent, conduit à une flexion en porte-à-faux. Cela minimisera l’énergie délivrée au cantilever et à l’échantillon et diminuera ainsi la température totale dans l’environnement, atténuant ainsi les dommages causés par la chaleur de l’échantillon.

Dans cette étude, nous montrons les limites des paramètres d’imagerie dans HS-PORT qui empêchent les dommages causés aux échantillons de chaleur et un contrôle approprié de la rétroaction. La compréhension de ces limites permettra d’utiliser au mieux l’état actuel de la méthode PORT AFM, ce qui permettra un meilleur contrôle de l’interaction pointe-échantillon et aidera à préserver l’état natif des motifs d’ADN dans ces mesures. Grâce aux taux de balayage élevés atteints combinés à un bon contrôle de la rétroaction, PORT nous a permis d’obtenir des images claires et détaillées de l’ADN 3PS et de leurs interactions ^7,8,36. Grâce à la possibilité d’augmenter la vitesse d’imagerie et de contrôler directement la force de l’échantillon^{de pointe 23}, nous sommes en mesure de suivre plus précisément la croissance et la réorganisation des assemblages biomoléculaires et d’observer une dynamique détaillée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinué  ;
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199  ;	Unité d’électrophorèse
Thermocycleur Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	pour le recuit
AFM personnalisée	Laboratoire d’instrumentation Bio-Nano, Institut interfacultaire de bio-ingénierie, École d’ingénierie, École polytechnique Fé ; dé ; rale Lausanne		Peut être obtenu par l’intermédiaire du Laboratoire pour l’instrumentation bio-nano EDTA
	ITW	Réactifs A5097	En tampon de recuit
Capteur de puissance laser	Thorlabs	PM100D	Numérique Handheld Optical  ; Console de mesure de puissance et d’énergie
Alimentation 3AP animée, MP-310	Major Science	MP-310	Alimentation par électrophorèse
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	Tampon de recuit
en cours TBE	Thermo Scientific	327330010	Tampon de roulement pour électrophorèse
TRIS	Bio-Rad	1610719	Tampon de recuit