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Article de méthode

Caractérisation des systèmes d’efflux multimédicamenteux chez Acinetobacter baumannii à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

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DOI :

10.3791/66471

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5 janvier 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une procédure simple pour la complémentation chromosomique à copie unique d’un gène de pompe d’efflux à l’aide d’un système d’expression basé sur mini-Tn7 dans une souche modifiée d’Acinetobacter baumannii déficiente en efflux. Cet outil génétique précis permet une expression génique contrôlée, ce qui est essentiel pour la caractérisation des pompes d’efflux chez les pathogènes multirésistants.

Résumé

Acinetobacter baumannii est reconnu comme un agent pathogène à Gram négatif difficile en raison de sa résistance généralisée aux antibiotiques. Il est crucial de comprendre les mécanismes à l’origine de cette résistance pour concevoir de nouvelles options thérapeutiques efficaces. Malheureusement, notre capacité à étudier ces mécanismes chez A. baumannii est entravée par le manque d’outils de manipulation génétique appropriés. Ici, nous décrivons des méthodes d’utilisation d’un système chromosomique à base de mini-Tn7 pour obtenir l’expression génique d’une seule copie dans une souche d’A. baumannii dépourvue de mécanismes d’efflux fonctionnels de type RND. L’insertion en copie unique et l’expression inductible de la pompe d’efflux sont très avantageuses, car la présence d’opérons d’efflux RND sur des plasmides à nombre élevé de copies est souvent mal tolérée par les cellules bactériennes. De plus, l’incorporation de vecteurs d’expression mini-Tn7 recombinants dans le chromosome d’un hôte de substitution d’A. baumannii avec une sensibilité accrue à l’efflux aide à contourner les interférences d’autres pompes d’efflux. Ce système est utile non seulement pour étudier les pompes d’efflux bactériennes non caractérisées, mais aussi pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs potentiels ciblant ces pompes.

Introduction

Acinetobacter baumannii est un agent pathogène prioritaire de l’Organisation mondiale de la santé en raison de sa résistance globale à toutes les classes d’antibiotiques1. C’est un agent pathogène opportuniste qui touche principalement les personnes hospitalisées, blessées ou immunodéprimées. A. baumannii échappe en grande partie aux antibiotiques via des pompes à efflux, la plus pertinente étant la famille d’exportateurs Résistance-Nodulation-Division (RND)2. Comprendre comment ces pompes d’efflux fonctionnent mécaniquement permettra de développer des options thérapeutiques ciblées.

Une façon courante de distinguer spécifiquement les processus cellulaires est la manipulation génétique. Cependant, les outils disponibles pour les études génétiques d’A. baumannii sont limités et, pour compliquer davantage la conception expérimentale, les isolats cliniques sont souvent résistants aux antibiotiques couramment utilisés pour la sélection dans les manipulations génétiques3. Un deuxième obstacle rencontré lors de l’étude spécifique des pompes d’efflux est qu’elles sont strictement réglementées - souvent par des facteurs inconnus - ce qui rend difficile l’isolement et l’attribution précis de la fonction à une seule pompe4. Voyant ce besoin d’élargir la boîte à outils de recherche, nous avons développé un système d’expression inductible à base de mini-Tn7, à insertion d’une seule copie, qui intègre une cassette de cible de recombinase Flp (FRT), qui permet de supprimer le marqueur de sélection 5,6,7 (Figure 1). Créé à l’origine pour Pseudomonas 8,9,10, cet élégant système de clonage et d’expression a été utilisé pour générer des compléments de pompe d’efflux à copie unique dans une souche déficiente en pompe d’efflux RND d’A. baumannii (ATCC 17978 ::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB : ci-après dénommée A. baumannii AB258) que nous avons générée11. En étant capable d’étudier une pompe d’efflux à la fois et de ne pas submerger les cellules bactériennes avec une expression à forte copie (comme on le voit généralement avec les systèmes d’expression à base de plasmides), on peut mieux connaître les aspects physiologiques critiques de chaque pompe d’efflux avec un minimum d’interférence et des complications réduites.

Cet article décrit comment utiliser le système mini-Tn7 pour compléter un gène d’intérêt supprimé, RND efflux pump adeIJK, dans le chromosome d’A. baumannii AB258 par une série d’étapes simples effectuées sur une période de 9 jours7. La première série d’étapes réintroduit les gènes de la pompe d’efflux supprimés clonés dans le plasmide d’insertion à base de mini-Tn7 (Figure 2A) au site d’insertion unique attTn7 en aval du gène glmS bien conservé (Figure 3A). Ce processus est facilité par un plasmide auxiliaire non réplicatif (Figure 2B) qui code pour les gènes de transposase nécessaires à l’insertion de Tn7. La deuxième série d’étapes utilise un plasmide d’excision (figure 2C) pour l’élimination médiée par la recombinase Flp du gène de la gentamicine flanquée de sites FRT (figure 3B) pour créer une souche non marquée. Bien que ce système soit utilisé pour élucider les rôles essentiels et les inhibiteurs possibles des pompes d’efflux RND en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques, il peut être utilisé pour étudier n’importe quel gène d’intérêt.

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Protocole

1. Préparation expérimentale

  1. Purifier le plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plasmide d’insertion, Figure 2A) avec le gène d’intérêt.
    NOTE : Ici, le gène d’intérêt est adeIJK. La concentration finale du plasmide doit être de ≥100 ng/μL.
  2. Purifier le plasmide auxiliaire (pTNS2)9 et le plasmide d’excision (pFLP2ab)6 (Figure 2B,C, respectivement), idéalement jusqu’à une concentration finale d’ADN plasmidique de ≥100 ng/μL.
  3. Préparez 50 mL d’eau stérile ultrapure et 25 mL de bouillon stérile LB (Lennox) (voir la table des matières).
  4. Préparez au moins 10 lb de gélose sur plaques, chacune contenant les additifs suivants : ordinaire (sans additifs), gentamicine (Gm) à 50 μg/mL, carbénicilline (Cb) à 200 μg/mL (pour la sélection par le gène de résistance à l’ampicilline) et saccharose à 5 % (voir le tableau des matières).
  5. Éplucher la souche à utiliser pour l’insertion sur la gélose LB et incuber à 37 °C pendant 16 à 18 h. Ici, A. baumannii AB258 est utilisé.
    REMARQUE : Ce protocole doit être effectué dans un environnement stérile autant que possible en utilisant un bec Bunsen sur la paillasse ou une enceinte de sécurité biologique. Tous les consommables (pointes de pipette, boucles d’inoculation, tubes de microfuge, etc.) doivent être stériles.

2. Préparation de la culture

  1. Inoculer une seule colonie d’A. baumannii AB258 dans 4 mL de bouillon LB dans un tube de culture stérile de 13 mL à l’aide d’une anse d’inoculation stérile ou d’un bâtonnet d’inoculation stérile en bois.
    REMARQUE : Une seule culture de 4 mL est utilisée pour un échantillon et un témoin. Augmentez le nombre de cultures en fonction du nombre d’échantillons nécessaires.
  2. Incuber une nuit à 37 °C en secouant (250 tr/min).
  3. Placer une bouteille d’eau distillée stérile (25-50 ml) à 4 °C pendant la nuit pour l’utiliser à l’étape 3.

3. Préparation des cellules électrocompétentes

  1. Placer tous les tubes de microfuge stériles de 1,5 mL (deux par culture) et les cuvettes d’électroporation stériles (deux par culture) sur de la glace (voir le tableau des matériaux). Gardez les échantillons sur de la glace autant que possible tout au long de la procédure.
  2. Placez la bouteille d’eau stérile conservée à 4 °C sur de la glace.
  3. Transvasez 1,5 mL de la culture bactérienne de nuit dans l’un des tubes de microfuge de 1,5 mL.
  4. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
    REMARQUE : La centrifugation devrait idéalement être effectuée à 4 °C, mais la centrifugation à température ambiante est acceptable et non préjudiciable.
  5. À l’aide d’une pipette de 1 ml, retirez tout le surnageant sans perturber la culot cellulaire.
  6. Ajouter 1,5 mL de culture bactérienne dans le même tube de microfuge. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min, puis retirer tout le surnageant.
  7. Répétez l’étape 3.6 une dernière fois avec le 1 ml de culture restant.
  8. Ajouter 1 mL d’eau stérile glacée à la pastille cellulaire et remettre en suspension avec un pipetage doux jusqu’à ce que la pastille ne repose plus au fond du tube de la microfuge.
  9. Centrifuger les cellules remises en suspension à 13 000 x g pendant 2 min.
  10. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL. Ne versez pas le surnageant, en particulier dans les étapes de lavage suivantes, lorsque les cellules ont tendance à former des granulés moins compacts.
  11. Répétez cette étape de lavage avec de l’eau stérile glacée, étapes 3.8 à 3.10, deux fois de plus.
  12. Remettre délicatement en suspension la pastille cellulaire finale dans 200 μL d’eau stérile glacée.
  13. Transférer 100 μL de la suspension cellulaire finale dans le deuxième tube microfuge glacé de 1,5 mL. Cette deuxième aliquote deviendra le témoin négatif de l’électroporation. Conservez les échantillons de cellules sur de la glace.

4. Électroporation

  1. Préchauffer 1 mL de bouillon LB et une plaque de gélose LB + Gm50 (préparée à l’étape 1.4) pour chaque échantillon et témoin dans un incubateur statique réglé à 37 °C.
  2. Dans un volume combiné de 5 μL ou moins, ajouter 100 à 200 ng chacun du plasmide auxiliaire pTNS2 et du plasmide d’insertion pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK à une aliquote de cellules électrocompétentes.
  3. Mélanger en tapotant doucement du bout des doigts pour assurer un mélange complet des plasmides avec les cellules électrocompétentes sans introduire de bulles.
  4. Ajouter un volume équivalent d’eau distillée stérile dans l’aliquote de la cellule témoin négative et mélanger doucement comme ci-dessus.
  5. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 min.
  6. Transférez l’échantillon entier de la cellule dans une cuvette d’électroporation glacée, puis replacez la cuvette sur de la glace. Répétez l’opération pour l’échantillon négatif de la cellule témoin.
  7. Électroporez l’échantillon de cellule.
    1. Allumez l’électroporateur et réglez-le sur 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (voir Tableau des matériaux).
    2. Essuyez la surface de la cuvette avec un mouchoir en papier pour éliminer toute glace ou humidité adhérente.
    3. Insérez la cuvette dans l’électroporateur et délivrez le choc électrique.
    4. Ajouter immédiatement 0,9 ml de bouillon LB préchauffé dans les cellules de la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger les cellules avec le milieu.
    5. Transférez toute la suspension cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 mL (température ambiante).
    6. Vérifiez la valeur de la constante de temps sur l’électroporateur ; Pour de meilleurs résultats, cette valeur doit être comprise entre 4 et 6.
  8. Répéter la procédure d’électroporation (étapes 4.7.1 à 4.7.6) pour l’échantillon de la cellule témoin négative.
  9. Incuber les échantillons électroporés à 37 °C pendant 1 h à 250 tr/min pour permettre la récupération des cellules.
  10. À l’aide d’un épandeur d’inoculation, étaler 100 μL de chaque échantillon de cellule électroporatée sur une plaque de gélose LB + Gm50 préchauffée.
    1. Centrifuger les échantillons restants à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
    2. Après avoir retiré tout le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans 100 μL de bouillon LB.
    3. Étaler chaque échantillon entier sur des plaques individuelles de gélose LB + Gm50 préchauffées.
      REMARQUE : L’efficacité de l’électroporation peut dépendre de la déformation. Lors de l’électroporation d’une souche pour la première fois, il peut être instructif de mettre en plaque différents volumes, voire dilutions, de l’échantillon d’électroporation pour s’assurer que les plaques résultantes ont des colonies isolées.
  11. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.

5. Sélection des colonies transformées pour le criblage par PCR

  1. Vérifiez les plaques d’électroporation. Le témoin négatif ne doit pas avoir de colonies ; l’échantillon doit avoir des colonies distinctes.
    NOTA : Les plaques contenant des colonies, à cette étape et à toutes les étapes ultérieures où des plaques de gélose contenant des colonies ou des plaques sont produites, peuvent être entreposées à 4 °C jusqu’à 3 jours avant d’être traitées.
  2. À l’aide de cure-dents stériles, prélevez jusqu’à 10 colonies individuelles dans les plaques de gélose LB + Gm50 et patchez-les sur une nouvelle plaque de gélose LB + Gm50 .
  3. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.

6. Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie

  1. Retirez les plaques de gélose LB + Gm50 contenant les colonies pansées de l’incubateur.
  2. À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette stérile, prélever une petite portion (environ la taille d’une grande colonie) d’un timbre dans 20 μL d’eau distillée stérile dans un tube PCR de 0,2 mL ; Bien mélanger. L’échantillon d’eau doit devenir visiblement trouble lorsque les cellules sont libérées du cure-dent. Préparez un nombre illimité d’échantillons qui doivent être examinés, mais 6 devraient suffire.
  3. Incuber le tube PCR contenant la suspension bactérienne à 100 °C pendant 5 à 10 min.
  4. À l’aide d’une mini-centrifugeuse (voir tableau des matériaux), faites tourner l’échantillon à la vitesse maximale fixe pendant 2 min pour granuler les débris cellulaires.
  5. Transférez le surnageant dans un nouveau tube PCR de 0,2 mL et placez-le sur de la glace. Cet échantillon contient l’ADN matrice pour la réaction PCR.
    REMARQUE : Cet ADN matrice peut être conservé à -20 °C avant de procéder à la PCR.
  6. Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New amorce directe, 0,18 μM Tn7R d’amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC), comprenant tout sauf l’ADN matrice (voir le tableau des matériaux).
  7. Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 49 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.
  8. Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, chargez 10 μL de chaque réaction de PCR sur un gel d’agarose à 2 % et faites fonctionner à 80 V pendant 40 minutes. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 382 pb. Le NTC ne devrait pas avoir de bandes.
  9. Identifier les échantillons qui ont produit le produit PCR attendu. Préparez une plaque de stries sur des plaques de gélose LB + Gm50 à partir de l’un des patchs positifs à la PCR ; incuber à 37 °C pendant 16-18 h. L’objectif est de générer une plaque avec des colonies uniques pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche marquée et comme point de départ pour créer une souche non marquée (décrite ci-dessous).

7. Retrait du marqueur GmR à l’aide de pFLP2ab

  1. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 2 : Préparation de la culture. L’échantillon utilisé pour préparer la culture de nuit est une seule colonie à partir des plaques de gélose LB + Gm50 préparées pour générer des colonies discrètes à l’étape 6.9.
  2. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 3 : Préparation des cellules électrocompétentes. Préparez les cellules de la culture de nuit pour l’électroporation.
  3. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 4 : Électroporation. Ici, le plasmide à introduire dans les cellules est pFLP2ab (100-200 ng), qui va supprimer le gène de résistance à la gentamicine, flanquant le gène d’intérêt inséré chromosomiquement.
  4. Une fois que les cellules ont récupéré pendant 1 h (étape 4.9), étalez 100 μL de l’échantillon de cellule électroporée sur une plaque gélosée LB + Cb200 préchauffée (préparée à l’étape 1.4). Cette pression sélective garantit que seules les cellules hébergeant le plasmide d’excisionab pFLP2 se développeront.
  5. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.
  6. Vérifiez la plaque pour les colonies. La plaque de contrôle négative ne doit pas avoir de colonies ; la plaque d’échantillon de gélose LB + Cb200 doit avoir des colonies distinctes.
  7. À l’aide de cure-dents stériles, répartir jusqu’à 20 colonies isolées sur une plaque de gélose LB + Cb200 et une plaque de gélose LB + Gm50 .
  8. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
  9. Vérifiez les plaques pour les patchs. Les clones qui se développent sur la plaque de gélose LB + Cb200 mais pas sur la plaque de gélose LB + Gm50 ont eu le gène de résistance à la gentamicine retiré de l’insert d’origine.
  10. Sélectionner les plaques résistantes à la carbénicilline et à la gentamicine susceptibles de s’étrier sur des plaques de gélose LB individuelles complétées par du saccharose à 5 % (p/v), ce qui force l’expulsion du plasmidepFLP2 ab de la bactérie. Choisissez jusqu’à 10 colonies.
  11. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
  12. Vérifiez les plaques pour les colonies.
  13. Comme confirmation finale de la perte du plasmidepFLP2 ab , recouper 4 à 6 colonies isolées des plaques de saccharose à 5 % sur une plaque de gélose LB + Cb200 et une plaque de gélose LB.
  14. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
  15. Choisissez un clone qui pousse sur la plaque de gélose LB et qui est sensible à la carbénicilline pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche non marquée.
    1. La vérification génétique de la souche non marquée peut être effectuée par PCR de colonie (étape 6 : Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie) en utilisant les amorces qui ciblent le gène de résistance à la gentamicine.
    2. Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM Gm_F amorce directe, 0,18 μM Gm_R amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC) comprenant tout sauf l’ADN matrice, et un contrôle positif utilisant l’ADN de la souche marquée.
    3. Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 40 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.
    4. Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, charger 10 μL de chaque réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 % et exécuter à 80 V pendant 40 min. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 525 pb. Le témoin positif doit avoir une seule bande ; les échantillons et le NTC ne doivent pas avoir de bandes.

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Résultats

La procédure d’insertion chromosomique ne prend que 2 h au total sur 3 jours pour voir un résultat - colonies se développer sur une plaque de gélose sélective (Figure 1A-C). Le nombre attendu de colonies sur la plaque de transformation dépend de la souche : on peut voir 20-30 voire des centaines de colonies car l’insertion de Tn7 sur les sites deTn7 est spécifique et efficace9. Le patchage des colonies de plaques de transform...

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Discussion

Même si cette procédure d’insertion chromosomique d’un système d’expression génique inductible à copie unique chez A. baumannii est techniquement simple et ne demande pas beaucoup de travail, il y a quelques étapes importantes qui doivent être soulignées. Tout d’abord, la préparation des cellules compétentes doit se faire autant que possible sur de la glace car les cellules deviennent fragiles lors du remplacement du milieu par de l’eau glacée. Idéalement, les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 °C, mai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par une subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à AK. Les schémas utilisés dans les figures sont créés avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube PCR 0,2 mLVWR20170-012Pour préparations d’ébullition en colonie et réactions PCR
Tubes microfuges 1,5 mLSarstedt72-690-301générale
Tubes de culture 13 mL, PyrexFisher14-957KRécipients de culture liquide
6x tampon de chargement d’ADNFroggabioLD010Gel d’agarose électrophorèse colorant de chargement d’échantillon Acétique
acide, glaciaireFisher351271-212Composant tampon courant de gel d’agarose
AgarBioshopAGR003Milieu de croissance solide
AgaroseBioBasicD0012Séparation électrophorétique des produits de réaction PCR ; utilisé à une concentration de 0,8&ndash ; 2 %
Unité d’électrophorèse sur gel d’agaroseFisher29-237-54Électrophorèse sur gel d’agarose ; séparation des produits de réaction de la PCR
CarbenicillineFisher50841231Milieux sélectifs
Fermetures de tubes de cultureFisher13-684-138Fermeture en acier inoxydable pour tubes de culture de 13 mL
Kit de désoxynucléotide triphosphate (dNTP)BiobasicDD0058composant de réaction PCR ; fourni sous forme de 100 mM chacun dATP, dCTP, dGTP, dTTP ; mélangé et dilué pour 10 mM chacun dNTP
Bain sec/chauffe-blocFisher88860023Isotemp Bain sec numérique pour préparations d’ébullition
Cuvettes d’électroporationVWR89047-208Cuvettes d’électroporation de 2 mm avec capuchon rond
ÉlectroporateurCole Parmer940000009110 VAC, Électroporateur 60 Hz
Bromure d’éthidiumFisherBP102-1Visualisation des produits de réaction PCR et des marqueurs d’ADN dans un gel d’agarose
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)VWRCA-EM4050Composant tampon courant du gel d’agarose
GentamicineBiobasicGB0217Pour la préparation de milieux sélectifs
GlycérolFisherG33Préparation de stocks bactériens pour un stockage à long terme dans un congélateur à très faible teneur Incubateur
(agitation)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Incubateur Agitateur pour la croissance de cultures liquides
Incubateur (statique)Fisher11-690-550DFour d’incubation Isotemp Modèle 550D pour la croissance de cultures solides (gélose LB)
Boucle d’inoculationSarstedt86.1562.050Balayage des colonies sur des plaques de gélose
Épandeur d’inoculationSarstedt86.1569.005Épandage de culture sur plaques
de gélose Bouillon de lysogénie (LB), LennoxFisherBP1427Milieu de croissance liquide (20 g/L : 5 g/L de chlorure de sodium, 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 pour la centrifugation d’échantillons
Mini-centrifugeuseFisherS67601BCentrifugation de tubes PCR de 0,2 mL
Boîtes de PétriSPL Life Sciences10090Pour milieux de croissance solides (plaques de gélose) : 90 x 15 mm
PipettesMandelDiversespipettes monocanaux Gilson (P10, P20, P200, P1000)
AlimentationBiorad1645050PowerPac Alimentation de base pour l’électrophorèse
AmorcesIDTNAPCR composant réactionnel ; spécifique au gène d’intérêt ; préparé à 100 &mu ; M comme indiqué sur la fiche technique
du produit SucroseBioBasicSB0498Pour la préparation de milieux contre-sélectifs pour l’élimination du plasmide pFLP2ab de l’ADN polymérase transformée d’A. baumannii
TaqFroggaBioT-500Composant de réaction PCR ; polymérase fournie avec un tampon 10x
ThermocycleurBiorad1861096modèle T100 pour PCR
Cure-dentsFisherS24559Pour patcher les colonies sur des plaques de gélose
Trizma baseSigmaT1503Gel d’agarose composant tampon courant
Eau ultrapureMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ système de purification d’eau : eau ultra pure pour la préparation des milieux et des solutions, et le lavage des cellules
Marqueur d’ADN large gammeBiobasicM103R-2Détermination de la taille des produits PCR sur un gel d’agarose
Bâtonnets d’inoculation en boisFisher29-801-02Inoculation de cultures avec des colonies à partir de plaques de gélose
Utilisation

Références

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
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