Caractérisation des systèmes d’efflux multimédicamenteux chez Acinetobacter baumannii à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

Summary

Nous décrivons une procédure simple pour la complémentation chromosomique à copie unique d’un gène de pompe d’efflux à l’aide d’un système d’expression basé sur mini-Tn7 dans une souche modifiée d’Acinetobacter baumannii déficiente en efflux. Cet outil génétique précis permet une expression génique contrôlée, ce qui est essentiel pour la caractérisation des pompes d’efflux chez les pathogènes multirésistants.

Abstract

Acinetobacter baumannii est reconnu comme un agent pathogène à Gram négatif difficile en raison de sa résistance généralisée aux antibiotiques. Il est crucial de comprendre les mécanismes à l’origine de cette résistance pour concevoir de nouvelles options thérapeutiques efficaces. Malheureusement, notre capacité à étudier ces mécanismes chez A. baumannii est entravée par le manque d’outils de manipulation génétique appropriés. Ici, nous décrivons des méthodes d’utilisation d’un système chromosomique à base de mini-Tn7 pour obtenir l’expression génique d’une seule copie dans une souche d’A. baumannii dépourvue de mécanismes d’efflux fonctionnels de type RND. L’insertion en copie unique et l’expression inductible de la pompe d’efflux sont très avantageuses, car la présence d’opérons d’efflux RND sur des plasmides à nombre élevé de copies est souvent mal tolérée par les cellules bactériennes. De plus, l’incorporation de vecteurs d’expression mini-Tn7 recombinants dans le chromosome d’un hôte de substitution d’A. baumannii avec une sensibilité accrue à l’efflux aide à contourner les interférences d’autres pompes d’efflux. Ce système est utile non seulement pour étudier les pompes d’efflux bactériennes non caractérisées, mais aussi pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs potentiels ciblant ces pompes.

Introduction

Acinetobacter baumannii est un agent pathogène prioritaire de l’Organisation mondiale de la santé en raison de sa résistance globale à toutes les classes d’antibiotiques¹. C’est un agent pathogène opportuniste qui touche principalement les personnes hospitalisées, blessées ou immunodéprimées. A. baumannii échappe en grande partie aux antibiotiques via des pompes à efflux, la plus pertinente étant la famille d’exportateurs Résistance-Nodulation-Division (RND)². Comprendre comment ces pompes d’efflux fonctionnent mécaniquement permettra de développer des options thérapeutiques ciblées.

Une façon courante de distinguer spécifiquement les processus cellulaires est la manipulation génétique. Cependant, les outils disponibles pour les études génétiques d’A. baumannii sont limités et, pour compliquer davantage la conception expérimentale, les isolats cliniques sont souvent résistants aux antibiotiques couramment utilisés pour la sélection dans les manipulations génétiques³. Un deuxième obstacle rencontré lors de l’étude spécifique des pompes d’efflux est qu’elles sont strictement réglementées - souvent par des facteurs inconnus - ce qui rend difficile l’isolement et l’attribution précis de la fonction à une seule pompe⁴. Voyant ce besoin d’élargir la boîte à outils de recherche, nous avons développé un système d’expression inductible à base de mini-Tn7, à insertion d’une seule copie, qui intègre une cassette de cible de recombinase Flp (FRT), qui permet de supprimer le marqueur de sélection ^5,6,7 (Figure 1). Créé à l’origine pour Pseudomonas ^8,9,10, cet élégant système de clonage et d’expression a été utilisé pour générer des compléments de pompe d’efflux à copie unique dans une souche déficiente en pompe d’efflux RND d’A. baumannii (ATCC 17978 ::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB : ci-après dénommée A. baumannii AB258) que nous avons générée¹¹. En étant capable d’étudier une pompe d’efflux à la fois et de ne pas submerger les cellules bactériennes avec une expression à forte copie (comme on le voit généralement avec les systèmes d’expression à base de plasmides), on peut mieux connaître les aspects physiologiques critiques de chaque pompe d’efflux avec un minimum d’interférence et des complications réduites.

Cet article décrit comment utiliser le système mini-Tn7 pour compléter un gène d’intérêt supprimé, RND efflux pump adeIJK, dans le chromosome d’A. baumannii AB258 par une série d’étapes simples effectuées sur une période de 9 jours⁷. La première série d’étapes réintroduit les gènes de la pompe d’efflux supprimés clonés dans le plasmide d’insertion à base de mini-Tn7 (Figure 2A) au site d’insertion unique attTn7 en aval du gène glmS bien conservé (Figure 3A). Ce processus est facilité par un plasmide auxiliaire non réplicatif (Figure 2B) qui code pour les gènes de transposase nécessaires à l’insertion de Tn7. La deuxième série d’étapes utilise un plasmide d’excision (figure 2C) pour l’élimination médiée par la recombinase Flp du gène de la gentamicine flanquée de sites FRT (figure 3B) pour créer une souche non marquée. Bien que ce système soit utilisé pour élucider les rôles essentiels et les inhibiteurs possibles des pompes d’efflux RND en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques, il peut être utilisé pour étudier n’importe quel gène d’intérêt.

Protocol

1. Préparation expérimentale

1. Purifier le plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plasmide d’insertion, Figure 2A) avec le gène d’intérêt.
   NOTE : Ici, le gène d’intérêt est adeIJK. La concentration finale du plasmide doit être de ≥100 ng/μL.
2. Purifier le plasmide auxiliaire (pTNS2)⁹ et le plasmide d’excision (pFLP2^ab)⁶ (Figure 2B,C, respectivement), idéalement jusqu’à une concentration finale d’ADN plasmidique de ≥100 ng/μL.
3. Préparez 50 mL d’eau stérile ultrapure et 25 mL de bouillon stérile LB (Lennox) (voir la table des matières).
4. Préparez au moins 10 lb de gélose sur plaques, chacune contenant les additifs suivants : ordinaire (sans additifs), gentamicine (Gm) à 50 μg/mL, carbénicilline (Cb) à 200 μg/mL (pour la sélection par le gène de résistance à l’ampicilline) et saccharose à 5 % (voir le tableau des matières).
5. Éplucher la souche à utiliser pour l’insertion sur la gélose LB et incuber à 37 °C pendant 16 à 18 h. Ici, A. baumannii AB258 est utilisé.
   REMARQUE : Ce protocole doit être effectué dans un environnement stérile autant que possible en utilisant un bec Bunsen sur la paillasse ou une enceinte de sécurité biologique. Tous les consommables (pointes de pipette, boucles d’inoculation, tubes de microfuge, etc.) doivent être stériles.

2. Préparation de la culture

1. Inoculer une seule colonie d’A. baumannii AB258 dans 4 mL de bouillon LB dans un tube de culture stérile de 13 mL à l’aide d’une anse d’inoculation stérile ou d’un bâtonnet d’inoculation stérile en bois.
   REMARQUE : Une seule culture de 4 mL est utilisée pour un échantillon et un témoin. Augmentez le nombre de cultures en fonction du nombre d’échantillons nécessaires.
2. Incuber une nuit à 37 °C en secouant (250 tr/min).
3. Placer une bouteille d’eau distillée stérile (25-50 ml) à 4 °C pendant la nuit pour l’utiliser à l’étape 3.

3. Préparation des cellules électrocompétentes

1. Placer tous les tubes de microfuge stériles de 1,5 mL (deux par culture) et les cuvettes d’électroporation stériles (deux par culture) sur de la glace (voir le tableau des matériaux). Gardez les échantillons sur de la glace autant que possible tout au long de la procédure.
2. Placez la bouteille d’eau stérile conservée à 4 °C sur de la glace.
3. Transvasez 1,5 mL de la culture bactérienne de nuit dans l’un des tubes de microfuge de 1,5 mL.
4. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
   REMARQUE : La centrifugation devrait idéalement être effectuée à 4 °C, mais la centrifugation à température ambiante est acceptable et non préjudiciable.
5. À l’aide d’une pipette de 1 ml, retirez tout le surnageant sans perturber la culot cellulaire.
6. Ajouter 1,5 mL de culture bactérienne dans le même tube de microfuge. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min, puis retirer tout le surnageant.
7. Répétez l’étape 3.6 une dernière fois avec le 1 ml de culture restant.
8. Ajouter 1 mL d’eau stérile glacée à la pastille cellulaire et remettre en suspension avec un pipetage doux jusqu’à ce que la pastille ne repose plus au fond du tube de la microfuge.
9. Centrifuger les cellules remises en suspension à 13 000 x g pendant 2 min.
10. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL. Ne versez pas le surnageant, en particulier dans les étapes de lavage suivantes, lorsque les cellules ont tendance à former des granulés moins compacts.
11. Répétez cette étape de lavage avec de l’eau stérile glacée, étapes 3.8 à 3.10, deux fois de plus.
12. Remettre délicatement en suspension la pastille cellulaire finale dans 200 μL d’eau stérile glacée.
13. Transférer 100 μL de la suspension cellulaire finale dans le deuxième tube microfuge glacé de 1,5 mL. Cette deuxième aliquote deviendra le témoin négatif de l’électroporation. Conservez les échantillons de cellules sur de la glace.

4. Électroporation

1. Préchauffer 1 mL de bouillon LB et une plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ (préparée à l’étape 1.4) pour chaque échantillon et témoin dans un incubateur statique réglé à 37 °C.
2. Dans un volume combiné de 5 μL ou moins, ajouter 100 à 200 ng chacun du plasmide auxiliaire pTNS2 et du plasmide d’insertion pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK à une aliquote de cellules électrocompétentes.
3. Mélanger en tapotant doucement du bout des doigts pour assurer un mélange complet des plasmides avec les cellules électrocompétentes sans introduire de bulles.
4. Ajouter un volume équivalent d’eau distillée stérile dans l’aliquote de la cellule témoin négative et mélanger doucement comme ci-dessus.
5. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 min.
6. Transférez l’échantillon entier de la cellule dans une cuvette d’électroporation glacée, puis replacez la cuvette sur de la glace. Répétez l’opération pour l’échantillon négatif de la cellule témoin.
7. Électroporez l’échantillon de cellule.
   1. Allumez l’électroporateur et réglez-le sur 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (voir Tableau des matériaux).
   2. Essuyez la surface de la cuvette avec un mouchoir en papier pour éliminer toute glace ou humidité adhérente.
   3. Insérez la cuvette dans l’électroporateur et délivrez le choc électrique.
   4. Ajouter immédiatement 0,9 ml de bouillon LB préchauffé dans les cellules de la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger les cellules avec le milieu.
   5. Transférez toute la suspension cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 mL (température ambiante).
   6. Vérifiez la valeur de la constante de temps sur l’électroporateur ; Pour de meilleurs résultats, cette valeur doit être comprise entre 4 et 6.
8. Répéter la procédure d’électroporation (étapes 4.7.1 à 4.7.6) pour l’échantillon de la cellule témoin négative.
9. Incuber les échantillons électroporés à 37 °C pendant 1 h à 250 tr/min pour permettre la récupération des cellules.
10. À l’aide d’un épandeur d’inoculation, étaler 100 μL de chaque échantillon de cellule électroporatée sur une plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ préchauffée.
    1. Centrifuger les échantillons restants à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
    2. Après avoir retiré tout le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans 100 μL de bouillon LB.
    3. Étaler chaque échantillon entier sur des plaques individuelles de gélose LB + Gm⁵⁰ préchauffées.
       REMARQUE : L’efficacité de l’électroporation peut dépendre de la déformation. Lors de l’électroporation d’une souche pour la première fois, il peut être instructif de mettre en plaque différents volumes, voire dilutions, de l’échantillon d’électroporation pour s’assurer que les plaques résultantes ont des colonies isolées.
11. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.

5. Sélection des colonies transformées pour le criblage par PCR

1. Vérifiez les plaques d’électroporation. Le témoin négatif ne doit pas avoir de colonies ; l’échantillon doit avoir des colonies distinctes.
   NOTA : Les plaques contenant des colonies, à cette étape et à toutes les étapes ultérieures où des plaques de gélose contenant des colonies ou des plaques sont produites, peuvent être entreposées à 4 °C jusqu’à 3 jours avant d’être traitées.
2. À l’aide de cure-dents stériles, prélevez jusqu’à 10 colonies individuelles dans les plaques de gélose LB + Gm⁵⁰ et patchez-les sur une nouvelle plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ .
3. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.

6. Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie

1. Retirez les plaques de gélose LB + Gm⁵⁰ contenant les colonies pansées de l’incubateur.
2. À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette stérile, prélever une petite portion (environ la taille d’une grande colonie) d’un timbre dans 20 μL d’eau distillée stérile dans un tube PCR de 0,2 mL ; Bien mélanger. L’échantillon d’eau doit devenir visiblement trouble lorsque les cellules sont libérées du cure-dent. Préparez un nombre illimité d’échantillons qui doivent être examinés, mais 6 devraient suffire.
3. Incuber le tube PCR contenant la suspension bactérienne à 100 °C pendant 5 à 10 min.
4. À l’aide d’une mini-centrifugeuse (voir tableau des matériaux), faites tourner l’échantillon à la vitesse maximale fixe pendant 2 min pour granuler les débris cellulaires.
5. Transférez le surnageant dans un nouveau tube PCR de 0,2 mL et placez-le sur de la glace. Cet échantillon contient l’ADN matrice pour la réaction PCR.
   REMARQUE : Cet ADN matrice peut être conservé à -20 °C avant de procéder à la PCR.
6. Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New amorce directe, 0,18 μM Tn7R d’amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC), comprenant tout sauf l’ADN matrice (voir le tableau des matériaux).
7. Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 49 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.
8. Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, chargez 10 μL de chaque réaction de PCR sur un gel d’agarose à 2 % et faites fonctionner à 80 V pendant 40 minutes. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 382 pb. Le NTC ne devrait pas avoir de bandes.
9. Identifier les échantillons qui ont produit le produit PCR attendu. Préparez une plaque de stries sur des plaques de gélose LB + Gm⁵⁰ à partir de l’un des patchs positifs à la PCR ; incuber à 37 °C pendant 16-18 h. L’objectif est de générer une plaque avec des colonies uniques pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche marquée et comme point de départ pour créer une souche non marquée (décrite ci-dessous).

7. Retrait du marqueur Gm^R à l’aide de pFLP2^ab

1. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 2 : Préparation de la culture. L’échantillon utilisé pour préparer la culture de nuit est une seule colonie à partir des plaques de gélose LB + Gm⁵⁰ préparées pour générer des colonies discrètes à l’étape 6.9.
2. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 3 : Préparation des cellules électrocompétentes. Préparez les cellules de la culture de nuit pour l’électroporation.
3. Suivez la procédure mentionnée à l’étape 4 : Électroporation. Ici, le plasmide à introduire dans les cellules est pFLP2^ab (100-200 ng), qui va supprimer le gène de résistance à la gentamicine, flanquant le gène d’intérêt inséré chromosomiquement.
4. Une fois que les cellules ont récupéré pendant 1 h (étape 4.9), étalez 100 μL de l’échantillon de cellule électroporée sur une plaque gélosée LB + Cb²⁰⁰ préchauffée (préparée à l’étape 1.4). Cette pression sélective garantit que seules les cellules hébergeant le plasmide d’excision^ab pFLP2 se développeront.
5. Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.
6. Vérifiez la plaque pour les colonies. La plaque de contrôle négative ne doit pas avoir de colonies ; la plaque d’échantillon de gélose LB + Cb²⁰⁰ doit avoir des colonies distinctes.
7. À l’aide de cure-dents stériles, répartir jusqu’à 20 colonies isolées sur une plaque de gélose LB + Cb²⁰⁰ et une plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ .
8. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
9. Vérifiez les plaques pour les patchs. Les clones qui se développent sur la plaque de gélose LB + Cb²⁰⁰ mais pas sur la plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ ont eu le gène de résistance à la gentamicine retiré de l’insert d’origine.
10. Sélectionner les plaques résistantes à la carbénicilline et à la gentamicine susceptibles de s’étrier sur des plaques de gélose LB individuelles complétées par du saccharose à 5 % (p/v), ce qui force l’expulsion du plasmide^{pFLP2 ab} de la bactérie. Choisissez jusqu’à 10 colonies.
11. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
12. Vérifiez les plaques pour les colonies.
13. Comme confirmation finale de la perte du plasmide^{pFLP2 ab} , recouper 4 à 6 colonies isolées des plaques de saccharose à 5 % sur une plaque de gélose LB + Cb²⁰⁰ et une plaque de gélose LB.
14. Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.
15. Choisissez un clone qui pousse sur la plaque de gélose LB et qui est sensible à la carbénicilline pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche non marquée.
    1. La vérification génétique de la souche non marquée peut être effectuée par PCR de colonie (étape 6 : Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie) en utilisant les amorces qui ciblent le gène de résistance à la gentamicine.
    2. Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM Gm_F amorce directe, 0,18 μM Gm_R amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC) comprenant tout sauf l’ADN matrice, et un contrôle positif utilisant l’ADN de la souche marquée.
    3. Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 40 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.
    4. Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, charger 10 μL de chaque réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 % et exécuter à 80 V pendant 40 min. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 525 pb. Le témoin positif doit avoir une seule bande ; les échantillons et le NTC ne doivent pas avoir de bandes.

Results

La procédure d’insertion chromosomique ne prend que 2 h au total sur 3 jours pour voir un résultat - colonies se développer sur une plaque de gélose sélective (Figure 1A-C). Le nombre attendu de colonies sur la plaque de transformation dépend de la souche : on peut voir 20-30 voire des centaines de colonies car l’insertion de Tn7 sur les sites deTn7 est spécifique et efficace⁹. Le patchage des colonies de plaques de transformation sur des milieux sélectifs (figure 4A) préserve la souche transformée et fournit du matériel de départ pour le criblage par PCR des colonies (figure 1E et figure 4B). Le dépistage des colonies par PCR peut être réduit au minimum - pas plus de 10 colonies doivent être traitées, et la plupart doivent donner un résultat positif pour l’insertion. Le produit de PCR pour les amorces de criblage, ABglmS2_F_New et Tn7R (tableau 1), est de 382 pb (figure 4B, voie 4) ; les témoins négatifs de la réaction comprennent la souche ATCC 17978 d’A. baumannii de type sauvage (figure 4B, voie 2), AB258 (figure 4B, voie 3) et aucun gabarit (figure 4B, voie 5). Les colonies positives à la PCR représentent des souches complétées et marquées.

L’élimination du gène de résistance à la gentamicine (non marquage) prend moins de 3 heures, s’étendant sur 6 jours, car les cellules transformées avec le plasmide d’excision doivent être choisies par placage sélectif, puis le plasmide d’excision doit être guéri de la bactérie (Figure 1F). L’excision par recombinaison Flp-FRT est précise et efficace et devrait donner ≥ 20 colonies sur la plaque de transformation. Les colonies qui sont regroupées sur la carbénicilline (sélection de la résistance à la β-lactame conférée par le plasmide d’excision) et à la gentamicine (recherche d’une perte de résistance à la gentamicine) doivent toutes être résistantes à la carbénicilline et sensibles à la gentamicine, respectivement. Le plasmide d’excision est expulsé de la bactérie par la croissance sur des plaques de gélose saccharose à 5 %. La croissance sur le saccharose force les cellules à éliminer pFLP2^ab car le gène sacB sur le plasmide favorise la conversion du saccharose en levans, un polysaccharide toxique pour les bactéries^12,13. Toutes les colonies qui se développent sur un milieu à 5 % de saccharose ne doivent alors se développer que sur des plaques de gélose LB ordinaires ; Il ne doit pas y avoir de croissance sur les plaques de gélose à la carbénicilline. Les colonies qui poussent sur les plaques de gélose LB représentent des souches non marquées. La confirmation de la perte du marqueur de la gentamicine peut être obtenue par PCR de la colonie à l’aide des amorces Gm_F et Gm_R (tableau 1 et figure 5). Cette paire d’amorces donne un amplicon de 525 pb uniquement dans le témoin positif (la déformation marquée initialement créée, Figure 5 voie 4) ; la souche ATCC 17978 de type sauvage (figure 5, couloir 2), AB258 (figure 5, couloir 3), toute colonie testée (figure 5, couloir 5) et le témoin sans gabarit (figure 5, couloir 6) ne devraient pas montrer d’amplification.

Une fois la souche non marquée confirmée, les tests fonctionnels peuvent commencer par des tests phénotypiques. Ici, le premier choix évident est de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’une gamme d’antibiotiques : la ciprofloxacine est un substrat connu d’AdeIJK, la tétracycline peut être éliminée par AdeIJK (la principale pompe d’efflux est AdeAB) et la kanamycine a un effet relativement mineur sur A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. En utilisant la méthode de micro-dilution en bouillon selon les directives^{CLSI 15}, la souche non marquée complémentaire AB258 ::adeIJK a été testée avec chaque antibiotique en l’absence et en présence de 50 μM IPTG ; la souche de type sauvage ATCC 17978 et la souche AB258 déficiente en efflux RND ont été incluses comme témoins (tableau 2). Dans l’ensemble, la tendance observée dans les valeurs de CMI indique la sensibilité attendue à la diminution de la sensibilité d’AB258 ::adeIJK à la ciprofloxacine et à la tétracycline avec expression induite de la pompe d’efflux, vérifiant que l’insertion d’adeIJK a réussi.

Figure 1 : Aperçu de la procédure. (A) Une culture de nuit de la souche A. baumannii à compléter est préparée. (B) Les cellules de la culture de nuit sont lavées à l’eau 3 fois par centrifugation et conservées sur de la glace. (C) Les plasmides d’administration et d’aide sont ajoutés aux cellules et incubés sur de la glace pendant 20 min. L’échantillon est électroporé, un milieu LB est ajouté et les cellules sont laissées récupérer pendant 1 h à 37 °C. Une aliquote de 100 μL de cellules est étalée sur des plaques de gélose LB + Gm⁵⁰ et incubée à 37 °C pendant la nuit. (D) Les colonies de la plaque de transformation sont patchées sur une plaque de gélose LB + Gm⁵⁰ et cultivées pendant une nuit à 37 °C. (E) Les colonies patchées sont préparées pour la PCR afin de dépister la présence d’un produit d’amplification couvrant le site d’insertion chromosomique. L’amplification par PCR est visualisée par électrophorèse sur gel d’agarose. Les échantillons positifs à la PCR représentent l’insertion réussie du gène d’intérêt dans le chromosome et la création d’une souche marquée. (F) Une colonie positive pour la gentamicine est préparée comme dans les étapes (A-C), avec électroporation du plasmide^ablif2 pour retirer la cassette de gentamicine de l’insertion chromosomique. Le placage sélectif sur gélose LB+Cb²⁰⁰ confirme l’absorption du plasmide. Le double patch sur les plaques de gélose LB + Cb²⁰⁰ et LB + Gm⁵⁰ révèle des colonies de Cb^R et^{Gm S} confirmant la perte de la cassette de gentamicine lors de l’insertion. La croissance de colonies de Cb^R sélectionnées sur 5% de saccharose guérit le plasmide^{pLFP2 ab} des cellules. Les colonies de la plaque de saccharose à 5 % sont patchées sur la gélose LB + Cb²⁰⁰ et la gélose LB pour révéler les colonies Cb^S et Gm^S souhaitées et confirmer la création de la souche non marquée. Gm⁵⁰, gentamicine à 50 μg/mL ; Cb²⁰⁰, carbénicilline à 200 μg/mL ; ^R, résistant ; ^S, sensible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Plasmides utilisés dans ce protocole. Cartes plasmidiques générales de (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (plasmide d’insertion), (B) pTNS2 (plasmide auxiliaire) et (C) pFLP2^ab (plasmide d’excision). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma d’insertion et de démarquage. (A) Insertion. Le site d’insertion unique de Tn7 dans le chromosome A. baumannii est situé à 24 pb de l’extrémité du gène glmS2. La co-électroporation du plasmide d’insertion et du plasmide auxiliaire permet la complémentation du gène d’intérêt (gène inséré, violet) avec le reste de la cassette d’insertion (sites FRT pour l’excision du marqueur, jaune ; gène accC1 pour la résistance à la gentamicine, vert ; lacIq pour l’expression inductible, bleu) dans le chromosome. (B) Démarquage. L’électroporation de la souche d’insertion complétée et marquée avec le plasmide d’excision^ab pFLP2 facilite l’élimination du gène de résistance à la gentamicine (accC1, vert) par recombinaison Flp-FRT (sites FRT, jaune), créant une souche non marquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Transformation, patch et confirmation d’insertion par PCR de colonie. Résultat représentatif de (A) la croissance des colonies de transformation après le patchage, et (B) l’amplification de la PCR de la colonie avec des amorces ABglmS_F_New (grises) et Tn7R (oranges) pour confirmer l’insertion chromosomique. Voie 1 : Échelle d’ADN de faible poids moléculaire ; Voie 2 : ATCC 179798 ; Voie 3 : AB258 ; Voie 4 : AB258 ::adeIJK-LAC-GM ; Voie 5 : contrôle sans modèle. La bande attendue de 382 pb est étiquetée. Notez que les amorces spécifiques à la gentamicine (Gm_F et Gm_R, vertes) pourraient également être utilisées pour affirmer l’insertion chromosomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Confirmation de la perte du marqueur par PCR de la colonie. Résultat représentatif de l’amplification de la PCR de la colonie avec des amorces spécifiques à la gentamicine (Gm_F et Gm_R) pour confirmer la perte du marqueur antibiotique par excision à base^d’abs pFLP. Voie 1 : échelle d’ADN de faible poids moléculaire ; Voie 2 : ATCC 179798 ; Voie 3 : AB258 ; Voie 4 : AB258 ::adeIJK-LAC-GM ; Voie 5 : AB258 ::adeIJK ; Voie 6 : contrôle sans modèle. La bande attendue de 525 pb est étiquetée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Souches, plasmides et amorces	Caractéristiques pertinentes	Référence
Tache
A. baumannii ATCC 17978	Type de variété	ATCC
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plasmides
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Cette étude
pTNS2	AmpR	9
pFLP2ab	Origine ou réplication du pWH1266, sacB, AmpR	7
Amorces	Séquence (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Cette étude
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Cette étude

Tableau 1 : Souches bactériennes, plasmides et amorces utilisés dans ce protocole. Gm, gentamicine ; Amp, ampicilline ; ^R, résistant.

	Ciprofloxacine		Tétracycline		Kanamycine
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258 ::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Changement de pli		4.01		4.03		0.25

Tableau 2 : Test de la fonctionnalité des gènes insérés via la sensibilité aux antibiotiques. Comparaison des valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) pour A. baumannii ATCC 17978, AB258, AB258 ::adeIJK non induite et AB258 ::adeIJK induite par IPTG par rapport à la ciprofloxacine, à la tétracycline et à la kanamycine. Changement de pli = induit (+ IPTG)/non induit (− IPTG) ; nd = non déterminé.

Discussion

Même si cette procédure d’insertion chromosomique d’un système d’expression génique inductible à copie unique chez A. baumannii est techniquement simple et ne demande pas beaucoup de travail, il y a quelques étapes importantes qui doivent être soulignées. Tout d’abord, la préparation des cellules compétentes doit se faire autant que possible sur de la glace car les cellules deviennent fragiles lors du remplacement du milieu par de l’eau glacée. Idéalement, les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 °C, mais la centrifugation à température ambiante est acceptable. Compte tenu de la fragilité croissante des cellules lors des lavages à l’eau, un pipetage doux est également essentiel. Deuxièmement, l’électroporation est sensible à la présence d’ions. Le lavage des cellules avec plusieurs cycles de granulation et la remise en suspension dans l’eau garantissent que le média est complètement éliminé. De plus, les plasmides doivent être fraîchement purifiés et peuvent être élués dans des tampons d’élution standard (normalement un tampon TE) tant que la concentration d’ADN plasmidique est suffisamment élevée. Nous visons à ajouter <5 μL de plasmide à 100 μL de suspension cellulaire pour maintenir la force ionique de l’échantillon très faible, bien que jusqu’à 10 μL doive être toléré. Troisièmement, des plaques de gélose sélective doivent être préparées au besoin pour assurer l’efficacité de l’antibiotique ajouté. Notez que la carbénicilline a été utilisée à la place de l’ampicilline habituelle pour la sélection lors de la transformation du plasmide d’excision, pFLP2^ab. A. baumannii est intrinsèquement résistant aux aminopenicillines (ampicilline)¹⁶ ; La substitution d’une carboxypénicilline (carbénicilline) permet une sélection continue avec la β-lactamase codée par plasmide.

L’optimisation du protocole expérimental est plus nuancée et variera entre les différentes espèces d’Acinetobacter (ou même les souches génétiquement manipulées au sein d’une même espèce) et éventuellement les réactifs particuliers utilisés en laboratoire. Par exemple, la tension utilisée pour l’électroporation peut varier entre 1,8 et 2,5 kV, et les conditions de thermocyclage peuvent devoir être légèrement modifiées en fonction de l’ADN polymérase utilisée pour la PCR. Des conseils utiles à considérer si les cellules se développent mal après l’électroporation comprennent la réduction de la concentration de gentamicine dans les plaques de gélose de 50 μg/mL à 30 μg/mL et/ou l’allongement du temps d’incubation des plaques de gélose à ≥24 h. En ce qui concerne les étapes de retrait de la cassette de gentamicine, il est possible d’obtenir un meilleur succès en utilisant des plaques de gélose LB avec 10 % de saccharose et/ou en les incubant à 30 °C pendant ≥24 h si la résistance à la carbénicilline persiste.

De nombreuses méthodes de préparation de cellules d’A. baumannii pour l’électroporation peuvent être trouvées dans la littérature, mais elles comprennent souvent une étape de sous-culture après la culture initiale pendant la nuit, puis une longue phase de croissance jusqu’à une densité optique prescrite. Nous avons constaté qu’une simple culture du jour au lendemain peut être utilisée tout aussi efficacement. L’électroporation d’A. baumannii a été bien décrite, et les lecteurs peuvent mieux comprendre cet aspect spécifique du protocole ici^17,18. Les principaux avantages de ce système de complémentation génique chromosomique mini-Tn7 par rapport à un système de complémentation à base de plasmides sont la capacité de réguler le niveau d’expression du gène complémentaire grâce au système répresseur lacI^q contrôlable par IPTG et le choix d’éliminer le marqueur de gentamicine (gène aacC1) via les sites de TRF adjacents. Il a été observé que la tolérance des cellules à l’expression des pompes d’efflux peut varier en fonction de la pompe insérée. Par exemple, les cellules sont plus sensibles à l’expression d’AdeIJK que celles d’AdeABC ou d’AdeFGH ; cela peut être résolu en modifiant la concentration d’IPTG dans des conditions de culture. La suppression du marqueur antibiotique réduit le risque mutationnel de la souche en raison d’une pression de sélection constante et permet également des enquêtes de sensibilité aux antibiotiques sans restriction³.

Ce système mini-Tn7 a été utilisé avec succès avec les espèces Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ et Acinetobacter ^5,6,21,22, cependant, certaines limites existent. Par exemple, chez A. baumannii, il n’y a qu’un seul site d’insertion fonctionnel attTn7 dans le génome⁵, de sorte qu’une souche peut être créée avec plusieurs délétions mais qu’un seul gène à la fois peut être complété. De plus, ce système n’a pas encore été prouvé efficace pour les bactéries à Gram positif¹⁰.

Les pompes d’efflux RND sont d’importants facilitateurs de la résistance aux antibiotiques chez A. baumannii. Ce qui les rend si puissants, c’est leur structure en trois parties qui s’étend sur les membranes interne et externe, permettant l’élimination des antibiotiques du périplasme vers l’extérieur de la cellule. Il a été démontré que les pompes RND les plus étudiées et les plus répandues - appelées AdeABC, AdeFGH et AdeIJK - éliminent les antibiotiques englobant toutes les classes. L’élucidation détaillée de la fonction de la pompe d’efflux constituera un bon point de départ pour concevoir de nouvelles options thérapeutiques contre les souches multirésistantes. L’utilisation de la souche de délétion de la pompe triple RND AB258 et le complément d’une pompe à la fois permettent d’étudier chaque pompe indépendamment des autres, en discernant pour chacune leurs profils de substrat uniques et les inhibiteurs les plus efficaces. Bien entendu, les pompes d’efflux jouent également un rôle « quotidien » dans le fonctionnement normal de la bactérie. Comprendre ces rôles pourrait conduire à une paralysie indirecte des pompes, ce qui, à son tour, interromprait l’efflux d’antibiotiques, rendant peut-être les bactéries multirésistantes sensibles aux antibiotiques couramment utilisés. En général, le système mini-Tn7 peut être utilisé pour introduire n’importe quel gène d’intérêt pour une étude détaillée ou des marqueurs utiles, par exemple, des protéines fluorescentes pour l’imagerie microscopique⁶.

La prévalence croissante des bactéries multirésistantes est une préoccupation pour nous tous. Comprendre les mécanismes de protection fournis par les pompes d’efflux chez les agents pathogènes comme A. baumannii est essentiel pour lutter contre les infections graves. Ce système d’expression génique chromosomique à copie unique est un outil puissant pour les études mécanistes ainsi que pour l’identification des inhibiteurs permettant de contrecarrer la fonction de la pompe d’efflux.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube PCR 0,2 mL	VWR	20170-012	Pour préparations d’ébullition en colonie et réactions PCR
Tubes microfuges 1,5 mL	Sarstedt	72-690-301	générale
Tubes de culture 13 mL, Pyrex	Fisher	14-957K	Récipients de culture liquide
6x tampon de chargement d’ADN	Froggabio	LD010	Gel d’agarose électrophorèse colorant de chargement d’échantillon Acétique
acide, glaciaire	Fisher	351271-212	Composant tampon courant de gel d’agarose
Agar	Bioshop	AGR003	Milieu de croissance solide
Agarose	BioBasic	D0012	Séparation électrophorétique des produits de réaction PCR ; utilisé à une concentration de 0,8&ndash ; 2 %
Unité d’électrophorèse sur gel d’agarose	Fisher	29-237-54	Électrophorèse sur gel d’agarose ; séparation des produits de réaction de la PCR
Carbenicilline	Fisher	50841231	Milieux sélectifs
Fermetures de tubes de culture	Fisher	13-684-138	Fermeture en acier inoxydable pour tubes de culture de 13 mL
Kit de désoxynucléotide triphosphate (dNTP)	Biobasic	DD0058	composant de réaction PCR ; fourni sous forme de 100 mM chacun dATP, dCTP, dGTP, dTTP ; mélangé et dilué pour 10 mM chacun dNTP
Bain sec/chauffe-bloc	Fisher	88860023	Isotemp Bain sec numérique pour préparations d’ébullition
Cuvettes d’électroporation	VWR	89047-208	Cuvettes d’électroporation de 2 mm avec capuchon rond
Électroporateur	Cole Parmer	940000009	110 VAC, Électroporateur 60 Hz
Bromure d’éthidium	Fisher	BP102-1	Visualisation des produits de réaction PCR et des marqueurs d’ADN dans un gel d’agarose
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Composant tampon courant du gel d’agarose
Gentamicine	Biobasic	GB0217	Pour la préparation de milieux sélectifs
Glycérol	Fisher	G33	Préparation de stocks bactériens pour un stockage à long terme dans un congélateur à très faible teneur Incubateur
(agitation)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubateur Agitateur pour la croissance de cultures liquides
Incubateur (statique)	Fisher	11-690-550D	Four d’incubation Isotemp Modèle 550D pour la croissance de cultures solides (gélose LB)
Boucle d’inoculation	Sarstedt	86.1562.050	Balayage des colonies sur des plaques de gélose
Épandeur d’inoculation	Sarstedt	86.1569.005	Épandage de culture sur plaques
de gélose Bouillon de lysogénie (LB), Lennox	Fisher	BP1427	Milieu de croissance liquide (20 g/L : 5 g/L de chlorure de sodium, 10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 pour la centrifugation d’échantillons
Mini-centrifugeuse	Fisher	S67601B	Centrifugation de tubes PCR de 0,2 mL
Boîtes de Pétri	SPL Life Sciences	10090	Pour milieux de croissance solides (plaques de gélose) : 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Diverses	pipettes monocanaux Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Alimentation	Biorad	1645050	PowerPac Alimentation de base pour l’électrophorèse
Amorces	IDT	NA	PCR composant réactionnel ; spécifique au gène d’intérêt ; préparé à 100 &mu ; M comme indiqué sur la fiche technique
du produit Sucrose	BioBasic	SB0498	Pour la préparation de milieux contre-sélectifs pour l’élimination du plasmide pFLP2ab de l’ADN polymérase transformée d’A. baumannii
Taq	FroggaBio	T-500	Composant de réaction PCR ; polymérase fournie avec un tampon 10x
Thermocycleur	Biorad	1861096	modèle T100 pour PCR
Cure-dents	Fisher	S24559	Pour patcher les colonies sur des plaques de gélose
Trizma base	Sigma	T1503	Gel d’agarose composant tampon courant
Eau ultrapure	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ système de purification d’eau : eau ultra pure pour la préparation des milieux et des solutions, et le lavage des cellules
Marqueur d’ADN large gamme	Biobasic	M103R-2	Détermination de la taille des produits PCR sur un gel d’agarose
Bâtonnets d’inoculation en bois	Fisher	29-801-02	Inoculation de cultures avec des colonies à partir de plaques de gélose