Hémostase de la plaie perforante et préparation d’échantillons pour l’analyse par microscopie électronique à large rayon

La formation d’un thrombus perforant qui conduit à l’arrêt de l’hémorragie est l’un des événements les plus essentiels de la vie¹. Pourtant, malgré cette essentialité, la connaissance de ce qui se passe structurellement lors de la formation d’un thrombus, que ce soit dans une veine, une artère, un événement athérosclérotique ou un caillot occlusif, a été limitée par la résolution et la profondeur de l’imagerie. La microscopie optique conventionnelle est limitée en profondeur par rapport à un thrombus de plaie perforante entièrement formé, de 200 à 300 μm en Z¹, et en niveau de résolution par rapport à la taille des organites plaquettaires et à leur espacement, souvent inférieur à 30 nm². La microscopie optique à deux photons peut fournir la profondeur d’imagerie nécessaire, mais n’améliore pas la résolution de manière significative. Les progrès les plus récents en microscopie optique, par exemple, les techniques de super-résolution, sont encore limités en résolution, en pratique ~20 nm en XY et deux fois plus en Z, et la profondeur limitée, pas plus que la microscopie optique conventionnelle. De plus, la microscopie optique à super-résolution, comme une grande partie de la microscopie optique de recherche, est basée sur la microscopie à fluorescence, une technique qui est intrinsèquement biaisée par rapport à un petit ensemble de protéines candidates pour lesquelles il existe de bons anticorps ou de bonnes constructions étiquetées³. En conclusion, la microscopie électronique à balayage conventionnelle peut, tout au plus, visualiser la surface du thrombus riche en plaquettes en formation.

Pour surmonter ces limitations techniques à la caractérisation de la structure du thrombus, nous avions trois objectifs. Tout d’abord, produire de manière reproductible une plaie perforante définie dans une veine ou une artère de souris qui pourrait ensuite être facilement stabilisée in situ par fixation chimique. Deuxièmement, appliquez une procédure préparative qui met l’accent sur la préservation de la membrane, un objectif compatible avec l’objectif de définir la position des plaquettes individuelles dans le thrombus en formation. Troisièmement, utilisez une technique de visualisation impartiale qui, en une seule image, pourrait être mise à l’échelle entre le nanomètre et le millimètre.

La microscopie électronique à large zone montée a été choisie comme technique majeure de visualisation finale pour une seule raison importante : en imagerie au microscope électronique, on voit un vaste éventail de caractéristiques à l’intérieur d’une cellule qui décrit ses organites et ses caractéristiques à l’intérieur des organites. De petits objets tels que les ribosomes peuvent être reconnus. Cette gamme de caractéristiques est observée parce que les colorants de métaux lourds denses en électrons, l’uranyle, le plomb et l’osmium, qui sont utilisés pour la microscopie électronique pour produire un contraste se lient à un large éventail de molécules. Dans une image au microscope électronique, on voit une grande partie de ce qui s’y trouve, tandis qu’avec les approches d’immunofluorescence et de marquage des protéines, on ne voit que ce qui s’allume. Il s’agit, par exemple, des sites antigéniques présents sur une espèce protéique individuelle donnée. Dans le cas d’une molécule marquée, souvent une protéine, il s’agit du ou des sites où se trouve cette protéine. Toutes les autres molécules sont sombres et non éclairées. Cependant, ce choix de la microscopie électronique est-il pratique ? Un thrombus perforant a une taille de 300 par 500 μm et, à une taille de pixel de 3 nm, cela représente une image de 100 000 par 167 000 pixels. Une caméra de microscope électronique de haute qualité a 4000 par 4000 pixels. Cela signifie qu’environ 1000 images doivent être assemblées/mélangées pour donner une seule image. C’est une possibilité qui a été présente dans la plupart des microscopes électroniques fabriqués au cours des 15 dernières années. La platine du microscope est informatisée et les images peuvent être assemblées avec un ordinateur. C’est la raison qui a conduit à faire les choix qui ont présidé à la formulation du protocole présenté.

En conclusion, nous présentons ci-dessous une série d’étapes qui donnent une plaie reproductible dans la veine ou l’artère de souris qui, ensuite, après des étapes de fixation in situ et plus tard des étapes d’encastrement, peut être visualisée par microscopie électronique à transmission à large zone à l’échelle nm et dans l’image assemblée visualisée à une échelle proche du mm, l’échelle de l’in situ réel thrombus fixe. Une telle évolutivité est nécessaire pour comprendre que la formation de thrombus est à la fois un problème d’hématologie et de santé et un système de biologie du développement dans lequel les plaquettes sont le principal type de cellule. Ces avancées offrent une vertu majeure de la microscopie électronique, à savoir que l’on voit ce qu’il y a, pas seulement ce qui s’allume. Pour un protocole détaillé sur la préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à balayage en série (SBF-SEM), le lecteur est invité à consulter un article récent de Joshi et ^al.4.

Les expériences ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Arkansas pour les sciences médicales. Ici, des souris C57BL/6 mâles et femelles de type sauvage, âgées de 8 à 12 semaines, ont été utilisées. Ces souris sont de jeunes adultes avec peu d’accumulation de graisse. Les mêmes procédures s’appliquent aux mutants murins pour diverses protéines importantes pour l’hémostase, telles que le facteur de von Willebrand ou la glycoprotéine plaquettaire VI (GPVI)^5,6. Tous les équipements, instruments chirurgicaux, réactifs et autres matériaux utilisés sont illustrés à la figure 1 et répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Plaie perforante de la veine jugulaire/de l’artère fémorale ^1,7

1. Anesthésie de la souris
   1. Placez la souris dans la chambre d’induction et tournez le vaporisateur d’isoflurane à un débit élevé (500 ml/min, 3 % d’isoflurane). L’isoflurane est choisi parce qu’il a peu d’effet sur le diamètre des vaisseaux sanguins.
      ATTENTION : Une exposition à long terme à l’isoflurane peut avoir des effets néfastes sur la santé. L’utilisation d’un vaporisateur à faible débit, de cartouches de capture de gaz d’anesthésie et d’une bonne ventilation de la pièce peut réduire considérablement l’exposition.
   2. Lorsque la souris semble endormie, pincez l’un des orteils de la souris pour voir si la souris réagit. Si c’est le cas, replacez la souris dans la chambre d’induction pendant quelques minutes, puis réessayez le test de pincement. Si la souris ne réagit pas, placez-la en position couchée sur la plaque chauffante (préalablement recouverte d’une feuille d’aluminium).
   3. Baissez le vaporisateur à un faible débit (100 ml/min, 1,75 % d’isoflurane). Placez le nez de la souris dans le cône nasal. Étendez chaque membre et fixez-le avec de petits morceaux de ruban adhésif.
   4. Insérez la sonde de température rectale et réglez la température à 37 °C sur le régulateur de température. Fixez avec du ruban adhésif le cordon de la sonde de température pour éviter qu’elle ne soit retirée accidentellement.
2. Incision de souris
   1. À l’aide de la tondeuse, rasez le cou et la poitrine de la souris (pour la veine jugulaire) ou l’intérieur de la jambe droite (pour l’artère fémorale). Essuyez les coupures de fourrure avec un tampon imbibé d’alcool. Si nécessaire, passez à nouveau sur la zone avec la tondeuse pour enlever toute fourrure restante.
   2. Essuyez à nouveau la zone avec un tampon d’alcool frais pour éliminer toutes les coupures. Il est très important que la zone soit aussi propre que possible. Confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie par pincement des orteils.
   3. À l’aide de ciseaux et d’une pince émoussée, soulevez et coupez la peau sur la veine jugulaire droite. Découpez une fenêtre ronde dans la peau suffisamment grande pour exposer la veine jugulaire et une partie des tissus environnants.
3. Nettoyage de la veine jugulaire (les mêmes principes s’appliquent à l’artère fémorale)
   1. À l’aide de la technique de dissection émoussée, écartez doucement les ganglions adipeux et lymphatiques ainsi que le tissu conjonctif.
      REMARQUE : Un nettoyage général autour du récipient a lieu à cette étape ; Cependant, un nettoyage minutieux et approfondi aura lieu au microscope après que la veine jugulaire ait été fixée dans du paraformaldéhyde pendant 24 h.
   2. Remplissez une seringue de 20 ml avec une solution saline normale réchauffée à 37 °C. Chargez la seringue dans la pompe à perfusion de la seringue. Fixez l’aiguille papillon 27G et le tube associé à la seringue.
   3. Réglez le pousse-seringue à un débit de 0,5 mL/min. Le léger jet de solution saline éliminera le sang de la veine ou de l’artère perforée. Placez le jet de solution saline à quelques mm sur le côté du site de ponction, et non directement au-dessus de celui-ci.
4. Perforation de la veine jugulaire/artère fémorale
   1. Démarrez le minuteur. Procurez-vous une aiguille hypodermique 30G (diamètre nominal 300 μm) pour la veine jugulaire et une aiguille hypodermique 33G (200 μm de diamètre) pour l’artère fémorale. L’utilisation d’une aiguille plus petite ne donne qu’un temps de saignement légèrement plus long pour la situation artérielle à haute pression.
   2. Tournez le biseau vers le haut. Positionnez l’aiguille à un angle de 25° sur la veine jugulaire/l’artère fémorale. Notez l’heure.
   3. Percez rapidement le récipient, en vous assurant de ne percer que le haut du récipient. Veillez à ne pas percer le fond du récipient. Notez le moment où le saignement s’arrête complètement.
   4. Attendre le temps approprié pour obtenir la formation d’un thrombus (Figure 2A) avant de commencer la fixation par perfusion (c’est-à-dire 1, 5, 10 ou 20 minutes pour obtenir les différents stades de développement du thrombus). Euthanasier l’animal par exsanguination ou suivre les directives institutionnelles locales pour l’euthanasie.
5. Réalisation de la fixation de perfusion transcardique
   1. Installez la pompe péristaltique avant le début de la chirurgie. Placez deux tubes coniques de 50 ml dans un support de tube à essai. Remplir un tube avec une solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 % préparée dans une solution tampon de cacodylate de sodium (cacodylate de sodium 0,2 M, chlorure de sodium 0,15 M à pH 7,4) pour les études de ponction jugulaire et remplir l’autre tube avec une solution tampon de cacodylate de sodium.
      REMARQUE : Les conditions détaillées ici sont suffisantes pour le cas de basse pression de la jugulaire et sont ensuite modifiées pour le cas de pression plus élevée d’une artère. Pour les études de systèmes à haute pression avec des artères, c’est-à-dire l’artère fémorale, le fixateur de paraformaldéhyde est complété par 0,1% de glutaraldéhyde, et la fixation externe par goutte à goutte est associée à la fixation par perfusion.
   2. Placez l’extrémité d’absorption du tube de la pompe dans le tube contenant la solution tampon. Fixez une aiguille papillon 27G avec le tube associé à l’extrémité de sortie du tube de la pompe et placez l’aiguille dans un bécher propre.
   3. Réglez la pompe péristaltique sur un débit de 10 mL/min. Allumez la pompe de perfusion.
   4. Lorsque la solution tampon commence à s’écouler de l’aiguille dans le bécher, éteignez la pompe. La tubulure et l’aiguille sont maintenant prêtes pour la perfusion transcardique.
   5. Exposez la cavité thoracique en faisant une coupe médiane dans la peau du haut du sternum jusqu’à quelques millimètres au-delà du bas du sternum à l’aide de ciseaux de dissection et d’une pince émoussée. Faites des incisions transversales le long de la base de la cage thoracique, en commençant par la ligne médiane et en coupant de la médiale à la latérale de chaque côté.
   6. Immédiatement avant de commencer la perfusion transcardique, ouvrez rapidement la cage thoracique et réfléchissez chaque côté pour exposer le cœur.
   7. Allumez la pompe péristaltique. Placez la pointe de l’aiguille papillon 27G dans la base du ventricule gauche.
   8. Tout en tenant l’aiguille bien en place dans le ventricule gauche, faites une fente dans le pavillon droit à l’aide de ciseaux de dissection tranchants pour permettre au sang et au liquide de perfusion de s’écouler. Notez l’heure sur la minuterie.
   9. Perfuser avec une solution tampon pendant 3 min pour évacuer le sang du système circulatoire. Tout en maintenant l’aiguille bien en place dans le ventricule gauche, éteignez la pompe péristaltique et déplacez l’extrémité ascendante de la tubulure de la pompe péristaltique vers le tube de 50 ml contenant la solution fixatrice.
   10. Notez l’heure sur la minuterie. Allumez à nouveau la pompe péristaltique et perfuser avec la solution fixatrice pendant 7 min. Éteignez la pompe péristaltique.
   11. Retirez l’aiguille du ventricule gauche et placez-la dans un bécher à déchets. Placez l’extrémité ascendante du tube de la pompe dans un bécher d’eau distillée.
   12. Allumez la pompe péristaltique et laissez environ 20 ml d’eau s’écouler à travers le tube et sortir l’aiguille 27G dans le bécher à déchets pour nettoyer le tube. Assurez-vous de laisser toute l’eau sortir du tube et de l’aiguille avant d’éteindre la pompe.

2. Collecte d’échantillons pour la microscopie électronique

1. Après la fixation de perfusion complétée par un fixateur externe initial de 2 minutes dans le cas de plaies par perforation de l’artère fémorale, disséquez soigneusement la partie de la veine jugulaire/artère fémorale contenant le site de ponction et le thrombus (Figure 2A). Avec des ciseaux bien aiguisés, faites une coupe diagonale à l’extrémité distale du segment vasculaire et faites une coupe droite à travers l’extrémité proximale du segment vasculaire.
   REMARQUE : Faire des coupes de cette manière aide à orienter le vaisseau plus tard et à identifier la direction du flux sanguin dans le vaisseau.
2. Immergez le segment du récipient dans du paraformaldéhyde frais à 4 % à température ambiante dans une solution tampon de cacodylate de sodium (0,2 M de cacodylate de sodium, 0,15 M de chlorure de sodium à pH 7,4) et placez-le à température ambiante pendant 1 h.
3. Transférez le tissu fixé à 4 °C pendant 24 h. Le lendemain, prenez une boîte de culture de 35 mm contenant un tapis en silicone de ~5 mm d’épaisseur (préparé à l’avance selon les instructions du fabricant). Versez suffisamment de solution tampon de cacodylate de sodium dans la boîte pour immerger le segment de veine fixe.
4. Lors de l’observation au microscope optique (grossissement ~15x), transférez soigneusement le tissu dans la boîte de 35 mm contenant la solution tampon et épinglez chaque extrémité du récipient sur le tapis en silicone à l’aide de broches minutiennes en acier inoxydable et de pinces fines.
5. Nettoyez soigneusement le segment de la veine jugulaire/de l’artère fémorale à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince très fine.
   1. Pour la veine jugulaire uniquement : Retirez l’une des broches et, à l’aide des micro-ciseaux, coupez la paroi du vaisseau en face du site de ponction/thrombus dans le sens de la longueur. Ouvrez doucement le récipient et, à l’aide de 4 à 5 broches (chacune coupée en deux avec une pince coupante), épinglez-le sur le tapis de silicone avec le côté intraluminal vers le haut.
6. Aspirez la solution tampon, remplacez-la rapidement par une solution de paraformaldéhyde à 1 % dans une solution tampon de cacodylate de sodium et placez le couvercle sur le plat. Ne laissez pas le tissu se dessécher à tout moment. Gardez-le toujours immergé dans le liquide.
7. Conservez le tissu à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit temps de le traiter pour la microscopie électronique (Figure 2B). Traiter certains échantillons de plaies par perforation de la veine jugulaire et de l’artère fémorale pour l’imagerie par SBF-SEM⁴ et d’autres pour l’imagerie par WA-TEM ^8,9. Les étapes de la WA-TEM sont décrites en détail ci-dessous.
   ATTENTION : Effectuez tous les travaux impliquant du formaldéhyde, de l’oxyde de propylène, de l’OsO₄ et du 2,4,6-Tris(diméthylaminométhyl)phénol (DMP-30) dans une hotte chimique. Ce sont des produits chimiques dangereux. L’exposition à OsO₄ peut provoquer la cécité et la mort.
   REMARQUE : Tous les volumes de rinçage et de coloration sont au moins 2 fois le volume de l’échantillon. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x peut être substituée au tampon cacodylate de sodium 0,1 M. Pendant la procédure de fixation, il est très important de ne jamais laisser les échantillons se dessécher, car cela affecterait considérablement l’ultrastructure. Utilisez des tubes en polypropylène.

3. Préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique à transmission à large zone (WA-TEM)

REMARQUE : Cette étape représente un point de décision auquel l’enquêteur s’engage à se préparer pour WA-TEM. Cette procédure préparatoire ne prend pas en charge le SBF-SEM. Pour le SBF-SEM volume EM, toutes les colorations doivent être effectuées avant l’enrobage dans le plastique. Veuillez voir⁴ pour un protocole de préparation SBF-SEM.

1. Lavez l’échantillon de tissu dans la boîte de 35 mm 2 fois avec la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) ou le PBS à température ambiante (RT). Gardez l’échantillon épinglé, ce qui permet de suivre l’orientation de l’échantillon à travers ces étapes de préparation.
2. Fixer avec 0,8 mL de 0,05 % de vert de malachite / 2,5 % de glutaraldéhyde / 0,1 M de cacodylate de sodium (pH 6,7 - 7,0) pendant 20 min sur glace.
3. Retirer le fixateur et laver l’échantillon 4 fois pendant 5 minutes chacune avec 0,1 M de cacodylate de sodium. Retirer le cacodylate de sodium 0,1 M.
4. Postfix avec 0,8 mL de 0,8 % de K₃Fe(CN)₆ ou de K₄Fe(CN)₆ / 1,0 % d’OsO₄ K₃Fe(CN)₆ dans 0,1 M de cacodylate de sodium. Placez un couvercle sur le plat pour empêcher la lumière d’entrer (OsO₄ est sensible à la lumière). Colorer pendant 20 min à 1 h à RT.
5. Retirez l’OsO₄ et rincez-le 4 fois pendant 5 minutes chacun avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M. Retirer le tampon de cacodylate de sodium et colorer avec de l’acide tannique à 1 % pendant 20 minutes sur de la glace.
6. Retirer l’acide tannique et laver pendant 5 min avec un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 1x et 2x pendant 5 min chacun avec de l’eau distillée de qualité moléculaire (DI).
7. Colorer avec de l’acétate d’uranyle à 0,5 % (UA) pendant 1 h RT ou une nuit à 4 °C dans l’obscurité.
8. Retirez l’acétate d’uranyle et rincez 5 fois pendant 5 minutes chacune avec de l’eau distillée de qualité moléculaire. Avant le dernier lavage et pendant que l’échantillon est encore immergé dans de l’eau DI, coupez le tapis de silicone autour de l’échantillon épinglé avec une lame de rasoir. Soulevez ce petit morceau de tapis en silicone de la plaque et placez-le dans un tube en polypropylène.
   REMARQUE : Il est important que l’échantillon reste épinglé à la pièce de silicone lorsqu’il est dans le tube. Le passage aux tubes en polypropylène dans cette étape est nécessaire car l’oxyde de propylène utilisé dans les étapes suivantes dégradera le polystyrène des plaques de 35 mm.
9. Après avoir retiré le dernier tampon, rincez brièvement 1x avec de l’éthanol à 25%. Jetez l’éthanol à 25 % et incubez avec de l’éthanol à 25 % pendant 3 min sur de la glace.
10. Retirez l’éthanol à 25 %. Rincer brièvement 1x avec de l’éthanol à 50%. Jetez l’éthanol à 50 % et incubez avec de l’éthanol à 50 % pendant 3 minutes sur de la glace.
11. Retirez l’éthanol à 50 % et rincez brièvement 1 fois avec de l’éthanol à 75 %. Jetez l’éthanol à 75 % et incubez avec de l’éthanol à 75 % pendant 3 min sur de la glace.
12. Retirez l’éthanol à 75 % et rincez brièvement 1 fois avec de l’éthanol à 95 %. Jetez l’éthanol à 95 % et incubez avec de l’éthanol à 95 % pendant 3 minutes sur de la glace.
13. Retirez l’éthanol à 95 % et lavez 3 fois, au moins 10 min à chaque fois, avec de l’éthanol à 100 % (200 proof). Retirez l’éthanol à 100 % et ajoutez l’oxyde de propylène (PO). Rincer 3x au moins 10 min chacun, avec PO.
14. Préparez le mélange de résine comme décrit ci-dessous.
    1. Réchauffez les composants en résine à 60 °C pour qu’ils se liquéfient complètement. Bien mélanger 12,5 ml d’Embed-218, 7,5 ml d’Araldite 502 et 27,5 ml de DDSA dans un tube de 50 ml à 60 °C. Ce mélange se conserve 6 mois à 4 °C. Réchauffez-le à 60 °C avant de l’utiliser. Aliquote la quantité requise avant utilisation.
15. Intégrez les exemples comme décrit ci-dessous.
    1. Placez une partie aliquote du mélange de résine dans un tube et ajoutez 20 μL/mL d’activateur DMP-30. Bien mélanger en tournant à 60 °C ; La couleur devrait s’assombrir.
    2. Diluez cette aliquote de résine activée à 50% dans du PO et laissez la résine et le PO se mélanger complètement.
    3. Retirez le dernier rinçage PO du tube contenant l’échantillon et remplacez-le par le mélange 50 % de résine/PO, en remplissant presque complètement le tube. Faites pivoter l’échantillon pendant la nuit à température ambiante.
    4. Le lendemain, mélanger une nouvelle aliquote de résine (1 mL par échantillon) avec 20 μL/mL de DMP-30.
16. Placez l’échantillon dans une boîte en polypropylène avec un petit volume de mélange de résine et de PO à 50 % du tube d’échantillon sous un microscope à dissection (grossissement ~6x) et retirez soigneusement les broches du tissu. Transférez uniquement le tissu dans une autre boîte en polypropylène contenant une petite quantité de résine à 100 % avec un activateur DMP-30.
17. Remplissez un moule d’enrobage en silicone avec la résine à 100% avec l’activateur DMP-30 et placez soigneusement l’échantillon dans le moule. Mettre le moule au four et cuire à 60 °C pendant au moins 48 h. L’échantillon préparé est illustré à la figure 2B.
18. Effectuez une imagerie par microscopie électronique à transmission large zone (WA-TEM) comme décrit en^10,11. Voir la figure 3 pour une représentation du processus allant d’une ponction initiale à un thrombus de 1 minute rendu en 3 dimensions. L’inclusion d’un protocole détaillé pour l’imagerie par microscopie électronique WA-TEM montée n’est pas incluse ici et dépasse le cadre des protocoles actuels sur la préparation des échantillons.
    REMARQUE : Le WA-TEM est une capacité sous-estimée de la plupart des microscopes électroniques à transmission modernes dotés d’une platine informatisée. Un logiciel shareware prenant en charge ces fonctions^10,11 est disponible auprès du groupe du Dr David Mastronarde, Université du Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Quantification des effets du médicament sur le temps de saignement de la plaie perforante
Les temps de saignement des plaies par perforation fournissent un modèle physiologique d’un risque médicamenteux qui peut être facilement réalisé chez la souris. Les résultats qui découlent d’une expérience de plaie perforante sont prédictifs. Ici, nous montrons une courbe d’hémorragie dose-réponse dabigatran. Le dabigatran, un inhibiteur de la thrombine, est utilisé comme anticoagulant oral à action directe, ce que l’on appelle le DOAC12. Le modèle de plaie par perforation de la veine jugulaire a été utilisé pour évaluer le risque inhérent à différentes doses de dabigatran par le biais d’une hémorragie prolongée potentielle due à la formation retardée de thrombus chez la souris. Une dose variable de 15, 50 ou 150 μg/kg de dabigatran a été administrée par voie intraveineuse (i.v.) 20 minutes avant la ponction de la veine jugulaire. Nous montrons les moyennes du temps de saignement à différentes concentrations de dabigatran (Figure 4). Au niveau de la dose, on observe un allongement significatif du temps de saignement, p <0,051. Cela indique un facteur de risque important dans l’utilisation du médicament chez l’homme. Expérimentalement, le médicament à ces doses a un effet significatif sur l’ultrastructure du thrombus en formation.

Évaluation de l’état d’activation plaquettaire dans la formation d’un thrombus de plaie perforante
L’approche WA-TEM fournit à la fois une vue d’ensemble d’une zone de blessure dans un seul plan lorsqu’elle est observée à un grossissement plus faible et beaucoup de détails à un grossissement plus élevé (figure 5). Les détails obtenus peuvent être directement placés dans le contexte de l’aperçu. Nous avons utilisé cette approche pour évaluer le recrutement de plaquettes en forme de discoïde dans un thrombus de plaie perforante en formation. Les plaquettes circulantes sont discoïdes, d’où leur nom, et contiennent un ensemble complet de granules sécrétoires. Une question clé a été de savoir comment les plaquettes circulantes peuvent être recrutées dans le thrombus en croissance sans perturber les propriétés de libre circulation des plaquettes restantes. Nos travaux mettent en évidence une hypothèse Tether and Activate dans laquelle les plaquettes circulantes sont recrutées dans le thrombus, une par une, par un processus d’attache sous forme de plaquettes discoïdes contenant un ensemble complet d’organites2. La preuve de cela provient de WA-TEM de thrombus de la veine jugulaire 1 minute après la ponction. Après la coupe pour obtenir des coupes complètes du thrombus à partir du milieu de la plaie encore saignante, nous avons imagé 500 à 800 images, 4 000 x 4 000 pixels, une taille de pixel de 3,185 nm dans une grille raster XY rectangulaire sur toute la dimension du thrombus en coupe efficace à l’aide d’une platine automatisée et d’un microscope électronique à transmission à l’aide du logiciel SerialEM10. Les cadres ont ensuite été assemblés à l’aide du logiciel eTomo, qui fait partie de la suite de programmes IMOD11. Il en résulte une seule image de taille variable, par exemple, 120 000 pixels sur 90 000 pixels qui est en plein écran à faible zoom, 0,02, ou en détail à zoom élevé, de 0,25 à 1,0 à l’aide du logiciel 3DMOD, qui fait également partie de la suite de programmes IMOD (Figure 5). Dans le net, l’analyse assistée par logiciel a révélé que les plaquettes discoïdes liées en périphérie, associées à des thrombus, dans le trou de ponction étaient espacées comme des perles sur une ficelle. À une courte distance à l’intérieur du thrombus, la forme discoïde était moins distincte et les plaquettes étaient plus étroitement associées les unes aux autres. Plus profondément dans le thrombus, les plaquettes étaient arrondies, serrées et partiellement dégranulées. Une séquence morphologique suggérait la liaison initiale des plaquettes au thrombus par le biais d’une longue molécule d’attache, probablement le facteur de von Willebrand, et que toutes les autres étapes d’activation plaquettaire étaient limitées à l’intérieur du thrombus en formation. Par conséquent, le recrutement plaquettaire dans le thrombus pourrait se produire sans perturber la circulation du sang dans la veine jugulaire.

Figure 1 : Configuration chirurgicale pour réaliser une expérience de thrombus de ponction de la veine jugulaire ou de l’artère fémorale. L’équipement chirurgical (A) et les instruments (B) sont soigneusement disposés pour assurer l’efficacité du mouvement, car le timing est critique pendant l’expérience. (C) Après la fixation par perfusion, la partie du vaisseau contenant le thrombus de la plaie perforante est épinglée à un tapis de silicone dans une boîte de culture de 35 mm pendant l’observation au microscope optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Passage d’un vaisseau sanguin à des échantillons intégrés dans du plastique qui seront sectionnés pour WA-TEM ou SBF-SEM. (A) Une artère fémorale avec une plaie perforante et une formation de thrombus extravasculaire en accumulation (cercle et flèche) est représentée. (B) Un thrombus (cercle et flèche) est incrusté dans du plastique pour la coupe pour WA-TEM avec un microtome pour l’imagerie 2D ultérieure. (C) Un thrombus (cercle et flèche) est incrusté dans du plastique, découpé de manière à donner un bâton court, de moins de 1 mm, pour la fixation à une broche à l’intérieur d’une chambre d’imagerie SBF-SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Formation d’une plaie perforante à un thrombus : schéma du flux préparatif d’une plaie perforante (A) à une coupe d’image d’un thrombus de la veine jugulaire post-ponction de 1 min (B). La paroi du vaisseau est étiquetée en bleu sur la tranche d’image, les petits points noirs près de la paroi du vaisseau sont des globules rouges et les agrégats de plaquettes du thrombus apparaissent sous forme de zones gris foncé. Ce chiffre a été modifié au lieu de1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Exemple de données, sous forme graphique, générées dans une expérience de plaie par perforation de la veine jugulaire. Une courbe d’hémorragie dose-réponse du dabigatran est illustrée. Ce chiffre a été modifié au lieu de1. Les moyennes du temps de purge à différentes concentrations de dabigatran sont indiquées ainsi que des barres d’erreur indiquant un écart type plus ou moins. L’analyse statistique à l’aide du test t de Student a indiqué une valeur p de <0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images WA-TEM d’une tranche assemblées pour former un montage. (A) Des images individuelles à haute résolution sont collectées, puis assemblées dans le but de placer les caractéristiques dans un contexte plus large. (B) En zoomant vers le haut, des détails importants peuvent être mis en contexte (poly : leucocyte polymorphonucléaire, endo : endothélium et col : fibres de collagène). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.