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Article de méthode

L’effet de la décoction anti-fatigue sur les comportements et les indicateurs sérologiques dans un modèle central de rat de fatigue

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DOI :

10.3791/66481

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12 avril 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous introduisons un protocole pour évaluer les effets de la décoction anti-fatigue (AFD) sur la fatigue centrale chez les rats modélisés par la méthode des plateformes multiples modifiées (MMPM) en surveillant à la fois leurs réponses comportementales et leurs marqueurs sérologiques.

Résumé

Cette étude visait à évaluer les effets de la décoction anti-fatigue (AFD) contre la fatigue centrale en observant les comportements et les indicateurs sérologiques de rats modélisés par la méthode multiplateforme modifiée (MMPM) après intervention médicamenteuse. Des mesures de la force de préhension ont été utilisées pour évaluer la force musculaire des rats. Le test en plein champ a été utilisé pour évaluer le comportement anxieux, tandis que le test du labyrinthe aquatique de Morris a été mené pour évaluer la fonction de mémoire des rats. À la suite des évaluations comportementales, des échantillons de sérum de rat ont été prélevés pour mesurer les concentrations de corticostérone (CORT) et d’acide lactique (LAC). La concentration de LAC a été déterminée à l’aide de la méthode colorimétrique, tandis que la concentration de CORT a été mesurée à l’aide de la méthode ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Par rapport au groupe témoin à blanc, après la modélisation MMPM, les rats ont montré des réductions significatives de la force de préhension et une altération de la capacité de mémoire. L’analyse sérique a révélé une augmentation des taux de LAC et de CORT chez les rats du groupe modèle. L’AFD peut sensiblement inverser ces changements négatifs dans une certaine mesure. Ces résultats mettent en évidence les effets positifs de l’AFD et de la coenzymeQ10 sur les capacités physiques et cognitives et les altérations des niveaux de biomarqueurs sériques des rats de fatigue centrale.

Introduction

La fatigue est un phénomène multiforme et non spécifique qui se caractérise généralement par des sensations de fatigue et une capacité réduite à fonctionner1. Elle peut être classée soit comme une fatigue périphérique, qui se produit au niveau musculaire, soit comme une fatigue centrale, originaire du système nerveux central 3,4. Une fatigue centrale prolongée peut contribuer de manière significative à des problèmes psychologiques, notamment l’anxiété, la dépression, la détresse psychologique et les problèmes de mémoire 5,6. Bien qu’il cause une détresse importante, il y a une pénurie de médicaments spécifiques ciblant la fatigue centrale7. Bien que le méthylphénidate, un stimulant du système nerveux central, puisse apporter un soulagement temporaire, ses effets secondaires, comme l’insomnie et les palpitations, peuvent aggraverla maladie.

Dans des applications cliniques antérieures, la médecine traditionnelle chinoise a montré des résultats prometteurs dans le traitement de la fatigue centrale, incorporant des approches telles que les décoctions orales, l’acupuncture et le Tai Chi 10,11,12. La décoction anti-fatigue (AFD) est une formule efficace développée par le professeur Li Feng sur la base d’une vaste expérience clinique et a démontré des effets thérapeutiques positifs. Il se compose d’Astragalus membranaceus (Huangqi), Fructus aurantii (Zhiqiao), Fructus crataegi (Shanzha), Schisandra chinensis (Wuweizi), Angelica sinensis (Danggui) et Dendrobium officinale (Shihu), dans un rapport de 15 : 15 : 10 : 5 : 7 : 8. La décoction d’AFD a été concentrée à 110 mL après ébullition avec dix fois le volume d’eau désionisée pendant 1 h trois fois. Dans une étude précédente, nous avons établi un modèle animal de fatigue centrale en utilisant la méthode multiplateforme modifiée (MMPM) et confirmé la manifestation de la fatigue centrale via des évaluations comportementales et des neurotransmetteurs du système nerveux central13. Dans cette étude, nous avons utilisé l’intervention de l’AFD dans le modèle animal de la fatigue centrale pour évaluer ses effets pharmacologiques par le biais d’évaluations comportementales.

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Protocole

Ce travail de recherche s’inscrit dans le respect des règles éthiques en matière de bien-être animal. Des soins et des conditions d’hébergement appropriés ont été maintenus pour assurer la santé et le bien-être des animaux, et toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Pékin (BUCM-4-2019041504-2094).

1. Élevage et regroupement des animaux

REMARQUE : Tout au long de l’étude, le bien-être animal a été maintenu conformément aux principes des 3R (réduction, raffinement et remplacement).

  1. Pour cette étude, sélectionnez 54 rats Wistar exempts d’agents pathogènes spécifiques (FPS) âgés de six semaines et pesant 210 g ± 10 g.
  2. Hébergez les rats dans l’animalerie dans des conditions contrôlées : température de 23 ± 2 °C, humidité relative de 50 % et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h. Laissez les animaux s’acclimater pendant 3 jours avant l’expérience.
  3. Répartissez au hasard les rats en un groupe témoin vierge (étiqueté « a » sur les figures), un groupe modèle (étiqueté « b » sur les figures), un groupe AFD-faible dose (AFD-L ; étiqueté « c » sur les figures), un groupe AFD-dose moyenne (AFD-M ; étiqueté « d » sur les figures), un groupe AFD-haute dose (AFD-H ; étiqueté « e » sur les figures), un groupe de coenzyme Q10 (CoQ10 ; étiqueté « f » sur les figures), avec 9 rats dans chaque groupe, à l’aide d’une méthode de table de nombres aléatoires.

2. Modélisation et intervention

REMARQUE : L’établissement de ce modèle s’est basé sur la littérature antérieure13.

  1. Utilisez la boîte de modélisation faite maison (fournie par le laboratoire de neuroimmunologie de l’Université de médecine chinoise de Pékin).
    REMARQUE : La boîte de modelage a une longueur de 110 cm, une largeur de 60 cm et une hauteur de 40 cm. Le fond est fixé par 15 plates-formes circulaires (diamètre 6,5 cm, hauteur 8 cm). L’espacement horizontal entre les deux plates-formes est de 13 cm et l’espacement vertical est de 10 cm. La boîte à champ ouvert a une longueur, une largeur et une hauteur de 100 cm, 100 cm et 35 cm, respectivement. Le fond est noir et le mur est bleu foncé. Le fond de la boîte à champ ouvert est divisé en 25 sections carrées de dimensions 25 cm, les 9 carrés centraux étant désignés comme la zone centrale et les 16 carrés extérieurs comme la zone périphérique.
  2. Assurez-vous que le niveau de l’eau dans la piscine est d’environ 1 cm au-dessus de la plate-forme et que la température de l’eau est maintenue à 23 ± 2 °C.
  3. Une fois l’expérience commencée, placez le rat dans la boîte recouverte d’un treillis métallique sur la surface et appuyez dessus avec des poids pour empêcher les animaux de s’échapper. Suspendez suffisamment de nourriture sous le grillage et fournissez de l’eau potable propre.
  4. Placez le rat dans le groupe de modèles dans la boîte à 18h00 tous les jours et sortez-le à 8h00 le lendemain. Après chaque séance de modelage, séchez le rat et remettez-le dans une cage propre. Effectuez la modélisation en continu pendant 21 jours.
  5. Pendant l’expérience, nettoyez la boîte, changez l’eau tous les jours et fournissez suffisamment de nourriture.
  6. Le 15ème jour de la modélisation, administrez les agents par lavage gastrique à 10h00 tous les jours pendant une période continue de 7 jours.
    1. Administrer le groupe AFD-L à une dose de 3,24 g/kg/j, le groupe AFD-M à 6,48 g/kg/j et le groupe AFD-H à 12,96 g/kg/j. Administrer la coenzyme Q10 à une dose de 10 mg/kg/j.
    2. Lors de l’administration des agents par lavage gastrique, préparez une suspension en mélangeant la dose requise dans de l’eau distillée. Le volume d’administration pour chaque groupe est de 10 mL/kg. Donnez au groupe de blancs et de modèles la même quantité d’eau distillée.
      REMARQUE : Les doses administrées aux rats ont été calculées à l’aide de la méthode de la surface corporelle (BSA) et converties selon les doses thérapeutiques normales pour les humains14.

3. Évaluations comportementales

  1. Force de préhension des rats
    1. Saisissez la queue du rat et placez-la doucement sur le compteur de force de préhension.
    2. Tirez le rat vers l’arrière avec une force uniforme tout en vous assurant que le système informatique enregistre correctement les données.
      REMARQUE : Avant les expériences, les techniciens étaient formés pour manipuler les rats afin d’appliquer une force constante.
    3. Répétez ce processus trois fois et calculez la moyenne des trois mesures comme valeur finale de la force de préhension.
      REMARQUE : Pour minimiser les erreurs causées par des facteurs humains, laissez une seule personne mener l’ensemble de l’expérience.
  2. Test en plein champ chez le rat
    1. Menez les expériences de comportement dans un environnement faiblement éclairé et calme. Avant le début de chaque expérience, placez les rats dans la salle de comportement pour 1 h d’adaptation.
    2. Assurez-vous que trois expérimentateurs participent à l’opération et portez des vêtements noirs lorsque vous placez ou guidez les rats. Tout au long de l’expérience, assurez-vous que les expérimentateurs ne franchissent pas les limites de la boîte avec leur corps ou leurs bras.
    3. Ouvrez le logiciel d’analyse.
      1. Cliquez sur Fichier dans le menu supérieur, puis sélectionnez Nouvelle expérience pour créer un nouveau projet. Dans les paramètres de l’arène, choisissez la forme correspondant à l’arène où le rat se déplacera.
      2. À l’aide de la souris, dessinez l’arène à l’écran. Calibrez la caméra et enregistrez les paramètres de l’arène.
    4. Permettez à un deuxième expérimentateur, vêtu de noir, de tenir le rat par le dos, de le placer séquentiellement au centre de la zone désignée et de retirer rapidement sa main.
    5. Démarrez un nouvel enregistrement. Réglez la durée d’enregistrement sur 5 min.
    6. Après la période d’observation de 5 minutes, retirez rapidement le rat de la boîte à champ ouvert et nettoyez ses excréments. Utilisez de l’alcool à 75 % pour nettoyer la boîte à champ ouvert.
    7. Répétez le processus pour tous les rats.
    8. Observez et notez (1) la distance totale parcourue, (2) le nombre de passages de la zone centrale : le nombre de fois où les membres du rat se croisent dans les carrés centraux de la grille, et (3) le temps passé dans la zone centrale, c’est-à-dire le temps passé par le rat dans les 9 carrés centraux de la grille.
  3. Labyrinthe d’eau Morris chez les rats
    1. Menez les expériences de comportement dans un environnement faiblement éclairé et calme. Avant de commencer chaque expérience, placez les rats dans la salle de comportement pour 1 h d’adaptation.
      REMARQUE : Les rats ont subi 4 jours d’entraînement ; Le 5ème jour, l’expérience formelle a commencé.
    2. Assurez-vous que le niveau de l’eau dans la piscine est d’environ 1 cm au-dessus de la plate-forme et que la température de l’eau est maintenue à 23 ± 2 °C.
    3. Assurez-vous que trois expérimentateurs participent à l’opération et portez des vêtements noirs lorsque vous placez ou guidez les rats.
    4. Divisez la flaque d’eau en quatre quadrants. Fixez une plate-forme au milieu du deuxième quadrant. Fixez des morceaux de papier de couleurs et de formes différentes au centre des parois de chaque quadrant.
    5. Ouvrez le logiciel d’analyse.
      1. Cliquez sur Fichier dans le menu supérieur, puis sélectionnez Nouvelle expérience pour créer un nouveau projet. Dans les paramètres de l’arène, choisissez la forme correspondant à l’arène où le rat se déplacera.
      2. À l’aide de la souris, dessinez l’arène à l’écran. Calibrez la caméra et enregistrez les paramètres de l’arène.
    6. Pendant la période d’apprentissage, laissez un autre expérimentateur placer séquentiellement le rat face à la paroi de la piscine dans chaque quadrant. L’ordre de placement est différent chaque jour comme suit :
      1. Le premier jour, placez le rat dans l’ordre suivant : premier quadrant, deuxième quadrant, troisième quadrant, quatrième quadrant.
      2. Le deuxième jour, placez le rat dans l’ordre suivant : deuxième quadrant, premier quadrant, quatrième quadrant, troisième quadrant.
      3. Le troisième jour, placez le rat dans l’ordre suivant : quatrième quadrant, troisième quadrant, deuxième quadrant, premier quadrant ;
      4. Le quatrième jour, placez le rat dans l’ordre suivant : troisième quadrant, premier quadrant, quatrième quadrant, deuxième quadrant.
    7. Si le rat ne parvient pas à trouver la plate-forme dans les 120 s, guidez-le jusqu’à la plate-forme et laissez-le y rester pendant 10 s.
    8. Après avoir terminé l’expérience quotidienne, laissez le troisième expérimentateur essuyer l’eau du corps du rat à l’aide d’une serviette et séchez-le avec un sèche-cheveux. Effectuez cette opération dans une autre pièce pour éviter les interférences sonores.
    9. Dans l’expérience formelle, retirez la plate-forme et placez le rat dans le troisième quadrant. Enregistrez la trajectoire de mouvement du rat dans les 120 s.
    10. Observez et notez (1) le temps passé dans le quadrant où se trouvait la plate-forme, et (2) la latence d’évasion, c’est-à-dire le temps qu’il faut au rat pour atteindre la plate-forme en entrant pour la première fois dans le bassin d’eau.

4. Analyse biochimique sérique

  1. Traitement des échantillons
    REMARQUE : Un jeûne avec de la nourriture, mais pas d’eau, était autorisé la veille de l’échantillonnage.
    1. Anesthésier les rats à l’aide d’une solution de pentobarbital sodique à 2 % (p/v) par injection intrapéritonéale à raison de 0,5 mL/100 g de poids corporel.
    2. Après une anesthésie complète, prélevez leur sang de l’aorte abdominale à l’aide d’un vaisseau de prélèvement sanguin.
    3. Placez le sang entier à température ambiante (RT) pendant 2 h, puis centrifugez-le à 4 °C, 1522,38 x g pendant 20 min pour obtenir du sérum. Aliquote et conservez le sérum à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Dosage de l’acide lactique (LAC)
    REMARQUE : La concentration de LAC a été déterminée à l’aide de la méthode colorimétrique.
    1. Mélangez la solution de réserve enzymatique et la solution de dilution enzymatique dans un rapport de volume de 1:100 pour préparer une solution de travail enzymatique.
    2. Préparez le révélateur de couleur selon les instructions du kit.
    3. Dans un tube vierge, ajoutez 20 μL d’eau distillée.
    4. Dans un tube étalon, ajouter une solution étalon de 3 mmol/L.
    5. Dans un tube de mesure, ajoutez 20 μL de l’échantillon.
    6. Ajouter 1 ml de solution de travail enzymatique et 0,2 ml de révélateur de couleur dans chaque tube. Incuber à 37 °C pendant 10 min, puis ajouter 2 mL de la solution stop.
    7. Transférez 200 μL de la solution réactionnelle sur une plaque ELISA à 96 puits. Mesurez la valeur OD à 530 nm. Calculez la concentration LAC en fonction des valeurs OD.
      REMARQUE : Concentration LAC = (valeur de DO du puits d’échantillon - valeur de DO du puits à blanc)/(valeur de DO du puits standard - valeur de la DO du puits à blanc) x concentration de la solution standard x facteur de rapport de dilution.
  3. Dosage de la corticostérone
    REMARQUE : Les kits ELISA achetés dans le commerce sont utilisés pour mesurer la concentration de cortisone dans le sérum de rat.
    1. Avant l’expérience, diluez les anticorps conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) et à la solution de lavage pour créer une solution de travail. Ajoutez des échantillons étalons avec des concentrations de 0 nmol/L, 5 nmol/L, 15 nmol/L, 30 nmol/L, 60 nmol/L, 120 nmol/L et 240 nmol/L sur la plaque revêtue en volumes de 20 μL.
    2. Ajouter les échantillons de sérum (20 μL) dans les puits respectifs, puis ajouter 200 μL de conjugué enzymatique. Secouez bien la plaque et incubez-la pendant 60 min.
    3. Jetez la solution réactionnelle et lavez la plaque trois fois avec la solution de lavage (400 μL à chaque fois). Après avoir séché la plaque sur du papier absorbant, ajoutez 100 μL de réactif de couleur du substrat dans chaque puits.
    4. Incuber la plaque à RT pendant 15 min, puis ajouter 50 μL de la solution d’arrêt dans chaque puits.
    5. Mesurez les valeurs de DO de chaque puits à 450 nm. Utilisez les valeurs OD des puits étalons pour générer une courbe standard, puis utilisez-la pour calculer les concentrations des puits échantillons.

5. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié. Représenter les données de mesure sous forme de moyenne ± d’écart-type.
  2. Si les données ont suivi une distribution normale et montré l’homogénéité des variances, effectuer un test t indépendant.
  3. Si les données ont suivi une distribution normale mais n’ont pas d’égalité des variances, effectuez un test t approximatif.
  4. Si les données n’ont pas suivi une distribution normale, utilisez des tests non paramétriques pour la comparaison.
  5. Utilisez le test du chi carré de Pearson pour l’analyse des données de dénombrement/dénombrement.
    REMARQUE : Un niveau de signification de α = 0,05 a été choisi, tandis que P < 0,05 est considéré comme statistiquement significatif.
  6. Générez les chiffres à l’aide d’un logiciel approprié.

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Résultats

Par rapport au groupe témoin, les rats du groupe modèle ont montré des diminutions significatives de la force de préhension. Cependant, l’administration d’AFD à des doses faibles, moyennes et élevées a permis d’inverser cet effet de manière dose-dépendante, comme le montre la figure 1. De même, le médicament témoin positif a également démontré sa capacité à inverser les changements de force de préhension (Figure 1).

Dans l’essai en pl...

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Discussion

L’AFD est composé d’Astragalus membranaceus (Huangqi), de Fructus aurantii (Zhiqiao), de Fructus crataegi (Shanzha), de Schisandra chinensis (Wuweizi), d’Angelica sinensis (Danggui) et de Dendrobium officinale (Shihu), qui aurait pour fonction de revigorer la rate et de disperser l’énergie hépatique stagnante dans la médecine traditionnelle chinoise. En outre, toutes ces herbes sont considérées comme possédant un profil de sécurité fa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article. Nous n’avons aucune relation financière ou personnelle avec des organisations ou des individus qui pourraient influencer de manière inappropriée nos recherches.

Remerciements

Tous les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude pour le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NO. 81874428) et du projet de recherche de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Pékin (NO.2023-JYB-JBZD-001).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de test de corticostéroneSociété allemande DRGEIA4164Étape 4.3
Logiciel Curve Expert 1.4 CurveExpertProfessionalVersion 1.4Pour le calcul dans le dosage de la corticostérone
Logiciel Ethovision  ;Noldus Information Technology, Pays-BasVersion 15Logiciel d’analyse et système de suivi vidéo
Dispositif d’essai de force de préhensionBeijing Zhongshi Di Chuang limited companyZS-ZLÉtape 3.1
Kit de test d’acide lactiqueInstitut de recherche en bio-ingénierie Nanjing JianchengA019-2-1Étape 4.2
Méthodemodifiée à plateformes multiplesLaboratoire de neuroimmunologie de l’Université de médecine chinoise de PékinAucunÉtape 2.1
Dispositif de test du labyrinthe d’eau MorrisBeijing Zhongshi Di Chuang limited company ZS-MorrisÉtape 3.3
Dispositif de test en plein champ BeijingZhongshi Di Chuang limited companyZS-KCÉtape 3.2
PrismGraphPad  ;Verson 8Pour générer des chiffres
SPSS 26.0IBMVerson 26.0Analyse statistique  ;
Rats Wistar  ;SiPeiFu (Beijing) Biotechnology Co., Ltdnuméro de licence : SCXK (Jing) 2019-0010

Références

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