Le présent protocole décrit la méthode d’établissement d’un modèle murin de xénogreffe dérivée d’un patient (PDX) à partir de tissu d’ostéosarcome humain.
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Article de méthode
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe dérivé d’un patient avec des tissus d’ostéosarcome humain
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’ostéosarcome est la tumeur osseuse maligne primitive la plus fréquente chez les enfants et les adolescents. Malgré l’élaboration de nouveaux plans de traitement ces dernières années, le pronostic des patients atteints d’ostéosarcome ne s’est pas amélioré de manière significative. Par conséquent, il est crucial d’établir un modèle préclinique robuste avec une haute fidélité. Le modèle de xénogreffe dérivée du patient (PDX) préserve fidèlement les caractéristiques génétiques, épigénétiques et hétérogènes des tumeurs malignes humaines pour chaque patient. Par conséquent, les modèles PDX sont considérés comme des modèles in vivo authentiques pour l’étude de divers cancers dans des études de transformation. Cet article présente un protocole complet pour la création et la maintenance d’un modèle de souris PDX qui reflète avec précision les caractéristiques morphologiques de l’ostéosarcome humain. Il s’agit de transplanter immédiatement du tissu d’ostéosarcome humain fraîchement réséqué chez des souris immunodéprimées, suivi d’un passage successif. Le modèle décrit sert de plate-forme pour l’étude de la croissance, de la résistance aux médicaments, de la rechute et des métastases de l’ostéosarcome. De plus, il aide à sélectionner les traitements cibles et à établir des schémas de traitement personnalisés.
Introduction
L’ostéosarcome est une tumeur maligne osseuse primitive dérivée des cellules du lobe interosseux et est plus fréquent chez les adolescents ainsi que chez les enfants. Elle survient souvent dans l’épiphyse de la diaphyse longue et se caractérise par une tumeur maligne élevée, des métastases précoces et un mauvais pronostic 1,2. Les métastases pulmonaires sont la principale cause de décès chez les patients atteints d’ostéosarcome. Le taux de survie à 5 ans des patients atteints d’ostéosarcome non métastatique est de 65 % à 70 %3. Cependant, au cours des 40 dernières années, le taux de survie à 5 ans (seulement 20 %) des patients atteints d’ostéosarcome métastatique ne s’est pas amélioré de manière significative, et 25 % des patients atteints d’ostéosarcome ont des métastases au moment du diagnostic4. À l’heure actuelle, les médicaments de première intention pour le traitement de l’ostéosarcome ont fait l’objet d’un consensus, mais il existe encore des différences significatives dans le régime de chimiothérapie et la durée du traitement5. Il est important de réaliser des expériences précliniques basées sur des modèles animaux appropriés pour obtenir des schémas de chimiothérapie plus efficaces.
À l’heure actuelle, les modèles couramment utilisés pour les expériences précliniques sur l’ostéosarcome comprennent la culture cellulaire in vitro basée sur des lignées cellulaires et les xénogreffes dérivées de cellules in vivo (CDX), ainsi que les xénogreffes dérivées de patients (PDX)6,7.
Les lignées cellulaires sont pratiques pour la culture et pour une utilisation dans des études in vitro , ou pour la transplantation chez des souris immunodéficientes afin d’établir des modèles CDX8. Cependant, les lignées cellulaires cultivées in vitro peuvent ne pas refléter avec précision l’hétérogénéité des tumeurs malignes et les caractéristiques individuelles des patients en raison de mutations potentielles qui se produisent pour s’adapter à l’environnement de culture in vitro lors de passages répétés. De plus, ils n’ont pas le microenvironnement et le système immunitaire nécessaires à la croissance et au développement tumoral in vivo. Bien que les modèles CDX offrent certains avantages par rapport à la culture cellulaire in vitro , ils peuvent ne pas refléter pleinement les caractéristiques individuelles des patients atteints d’ostéosarcome, bien que les tissus tumoraux obtenus à partir de modèles CDX aient une hétérogénéité intratumorale et une représentation du système immunitaire limitées par rapport aux lignées cellulaires cultivées in vitro9. Par conséquent, l’établissement d’un modèle préclinique avec une haute fidélité est crucial.
Les modèles PDX impliquent la transplantation immédiate de tissus cancéreux humains fraîchement réséqués chez des souris immunodéficientes. Cette méthode permet de conserver fidèlement les caractéristiques génétiques, épigénétiques et hétérogènes des tumeurs malignes humaines pour chaque patient, même après des passages successifs chez la souris. De plus, les modèles PDX sont connus pour prédire avec précision les résultats cliniques ultérieurs10, ce qui en fait des outils précieux pour créer des traitements individualisés et faire progresser la recherche en médecine de précision11.
Ce travail décrit la procédure d’établissement d’un modèle PDX chez des souris immunodéficientes par transplantation de tissu d’ostéosarcome humain. Ces modèles servent de plates-formes pour la réalisation d’expériences précliniques sur l’ostéosarcome.
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Protocole
Toutes les études impliquant des tissus humains ont été approuvées par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital Longhua, affilié à l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (Shanghai, Chine) (2013LC52), et le consentement éclairé écrit des patients a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki. Le numéro IACUC pour cette étude animale est de PZSHUTCM221017013. Des souris mâles CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl âgées de quatre semaines ont reçu un double lion Irradiated Rodent Diet GB 14924.3 et de l’eau stérile, et ont été logées dans des cages à souris IVCs avec cinq souris par cage, dans des conditions SPF avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. La table des matériaux comprend des informations détaillées sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Préparation du tissu d’ostéosarcome humain
REMARQUE : Dans cette étude, le tissu d’ostéosarcome humain a été réséqué12 à partir de la lésion fémurienne d’un patient de 15 ans atteint d’ostéosarcome avant la chimiothérapie.
- Conservez immédiatement le tissu d’ostéosarcome fraîchement réséqué dans une solution protectrice des tissus afin de maximiser la préservation de l’activation cellulaire de l’ostéosarcome après un rinçage avec une solution saline physiologique stérile.
REMARQUE : Les tissus d’ostéosarcome fraîchement réséqués doivent être transplantés chez la souris dès que possible. Ils peuvent être conservés dans la solution protectrice des tissus pendant un maximum de 24 heures avant la transplantation. Les tissus de l’ostéosarcome utilisés pour la modélisation doivent provenir de patients qui n’ont pas reçu de chimiothérapie. L’activité des cellules tumorales des patients ayant reçu une chimiothérapie sera faible, ce qui entraînera l’échec de l’établissement du modèle et la perte de haute fidélité. - Transférez les tissus d’ostéosarcome fraîchement réséqués stockés dans la solution protectrice tissulaire au laboratoire dès que possible.
- Préparer des instruments expérimentaux et du matériel pour l’établissement du modèle PDX : scalpels (Figure 1A) ; pince à épiler ophtalmique (figures 1B et C) ; ciseaux ophtalmiques (figure 1D) ; aiguille de suture (figure 1E) ; ligne de suture (figure 1F) ; porte-aiguille droit (figure 1G) ; stylo de marquage (Figure 1H).
REMARQUE : Assurez-vous que tous les instruments chirurgicaux sont stérilisés par autoclave avant utilisation. - Rincer deux fois les tissus de l’ostéosarcome avec une solution saline physiologique stérile pré-refroidie dans une hotte stérile.
- Enlever les zones du tissu de l’ostéosarcome présentant des saignements et une nécrose.
- Coupez le tissu nettoyé de l’ostéosarcome en3 morceaux de 3 mm avec un scalpel dans une boîte de culture contenant une solution saline physiologique stérile pré-refroidie et conservez-le sur de la glace.
2. Etablissement de modèles PDX par transplantation de tissu d’ostéosarcome dans la région du flanc de la souris
- Administrer l’analgésie préopératoire du méloxicam (5 mg/kg/24 h) par injection sous-cutanée chez la souris et placer les souris nues sur des champs chirurgicaux stériles. Fournir un soutien thermique tout au long de la procédure.
- Induire une anesthésie chez la souris en l’exposant à 3 % d’isoflurane et à 97 % d’oxygène. Une fois que les souris sont complètement anesthésiées, transférez-les dans le cône nasal et maintenez l’anesthésie avec 1,5 % d’isoflurane et 98,5 % d’oxygène.
- Pincez les orteils pour vous assurer que les souris sont complètement anesthésiées et attendez plus longtemps s’il y a encore des spasmes ou des réactions convulsives.
REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement stérile dans une cagoule stérile. Évitez la sécheresse des souris pendant l’anesthésie en appliquant une pommade ophtalmique sur leurs yeux. - Fixez la souris en position de décubitus latéral (Figure 2A). Désinfectez un côté de la région du flanc de la souris pour la transplantation de tissu d’ostéosarcome 3 fois avec des tours alternés de boules de coton désinfectant à base de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.
REMARQUE : La désinfection chirurgicale est effectuée selon un schéma circulaire, en commençant par le centre et en spirale vers l’extérieur. - Marquez le site de l’incision chirurgicale sur la peau à l’aide d’un marqueur.
- Faites une incision de 5 mm de la peau aux tissus sous-cutanés à l’aide d’un scalpel (Figure 2B).
- Soulevez la partie supérieure de la peau de la marge d’incision à l’aide d’une pince à épiler ophtalmique à l’aide de la main gauche, puis effectuez une dissection contondante vers le haut sous le derme des souris à l’aide d’un porte-aiguille droit à l’aide de la main droite (figure 2C).
- Tenez la partie supérieure de la peau de l’incision à l’aide de la pince ophtalmique à l’aide de la main gauche, et placez le tissu de l’ostéosarcome sous la peau à environ 5 mm au-dessus du bord de l’incision à l’aide d’une pince à épiler ophtalmique à l’aide de la main droite pour transplanter le tissu de l’ostéosarcome (figure 2C).
REMARQUE : Assurez-vous que le tissu de l’ostéosarcome est transplanté juste en dessous du derme de la peau. La dissection émoussée est réalisée à l’aide d’une pince à dissection droite et émoussée, telle qu’un porte-aiguille droit, pour éviter de pénétrer dans la cavité thoracique de la souris tout en trouvant la couche dermique de la peau de la souris. - Suturez l’incision à l’aide d’une suture résorbable avec 2-3 points de suture pour une incision de 5 mm (Figure 2D).
- Remettez les souris dans des cages propres et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles se remettent complètement de l’anesthésie.
REMARQUE : Le PDX établi par la transplantation du tissu de l’ostéosarcome humain est désigné par le passage 0 (P0), le PDX établi par la transplantation du tissu PDX au niveau P0 est désigné par le passage 1 (P1), suivi de P2 et P3.
3. Collecte de tissus tumoraux PDX
- Mesurez le volume tumoral une fois par semaine. Lorsque la taille de la tumeur atteint 1500mm3, euthanasier les souris en utilisant la méthode de la luxation cervicale après inhalation de CO2 . Les critères d’évaluation humains comprennent l’ulcération tumorale ou les problèmes de mobilité des membres avant.
REMARQUE : Mesurez le diamètre long (a) et le diamètre court (b) de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse. Calculez le volume tumoral (V) à l’aide de la formule : V = 1/2 × a × b2. - Positionnez la souris latéralement pour exposer la tumeur et désinfectez la peau au site de la tumeur avec une boule de coton imbibée d’alcool.
- Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour séparer toute la tumeur. Pesez la masse tumorale à l’aide d’une balance électronique.
4. Examen pathologique des tissus tumoraux cliniques primaires et PDX
- Fixez les tissus tumoraux13 dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de solution de formol tamponnée neutre à 10% pendant 24 h. Rincez abondamment les tissus tumoraux à l’eau courante pour éliminer le fixateur.
- Déshydrater et intégrer les tissus tumoraux dans la paraffine14.
- Coupez les tissus tumoraux et effectuez l’examen histologique de routine15.
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Résultats
Ce protocole décrit la procédure détaillée d’établissement d’un modèle murin PDX, en préservant les caractéristiques morphologiques de l’ostéosarcome humain après transplantation immédiate de tissu d’ostéosarcome humain fraîchement réséqué et passages successifs chez la souris. Ici, un modèle murin PDX a été établi avec succès en utilisant du tissu d’ostéosarcome humain.
La figure 3A montre une souris représentative de PDX à P0, deux mois après la transplantation ...
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Discussion
Les modèles PDX peuvent simuler les caractéristiques des cancers humains et conserver plus de similitudes avec la tumeur primaire, y compris les altérations génétiques et génomiques, l’histologie, l’hétérogénéité et le profil d’expression génique 16,17,18,19. Par conséquent, ils préservent les phénotypes moléculaires et les génotypes des patients atteints de ca...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Ce travail est soutenu par des subventions de (1) la National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408) ; (2) Projet de construction du centre de recherche prioritaire de Shanghai (2022ZZ01009) ; (3) Programme national de R&D clé de la Chine (2020YFE0201600) ; (4) Centre d’innovation collaborative de Shanghai pour la transformation industrielle de la préparation à la MTC hospitalière et (5) Projets de recherche dans le cadre du budget de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (2021LK047).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution neutre à 10 % de formol | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Fixer les tissus |
| Autoclave | Japon Hiryama Company | HVE-50 | Instruments chirurgicaux de stérilisation |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | Animal |
| Caliper | Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Mesurer le volume tumoral |
| Plat (60mm) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Placement de l’échantillon pendant |
| transplantation Boules de coton désinfectantes | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Désinfecter la peau des souris |
| Gants stériles jetables | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Opération stérile |
| Double lion Régime alimentaire irradié pour rongeurs | Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. | GB 14924.3 | Alimentation animale |
| Balance électronique | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Peser le poids de la tumeur |
| Eosin | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Coloration à l’hématoxyline eosine |
| Hématoxyline | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | Coloration à l’hématoxyline à l’éosine |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthésie chez la souris ; |
| IVCs souris cage | Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. | HH-MMB-2 | Stylo de marquage barrière pour animaux |
| Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Marquer l’incision chirurgicale | |
| Microscope optique | Olympus Japonais Olympus Company | BH20 | Scanner des tranches de tissus |
| Pommade ophtalmique | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | Eviter les yeux secs des souris pendant l’anesthésie |
| Ciseaux ophtalmiques | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Couper la peau |
| Pince à épiler ophtalmique | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Retenir les tissus d’ostéosarcome pendant la transplantation |
| Paraffine | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | du tissu d’ostéosarcome enterré |
| Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. | RM2235 | Section de tissu d’ostéosarcome | |
| solution saline physiologique | Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Rinçage et stockage temporaire de tissus d’ostéosarcome |
| Scalpels | Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Séparation du tissu de l’ostéosarcome et réalisation d’incisions chirurgicales |
| Cagoule | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Table d’opération chirurgicale |
| champs chirurgicaux stériles | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Fournir une zone de chirurgie stérile |
| Porte-aiguille droit | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Suture la plaie |
| Ligne de suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Suturer la plaie |
| Aiguille de suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Suturer la plaie |
| Solution protectrice des tissus | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD | BC-CFM-03 | Maintenir l’activité des cellules tissulaires |
| Tube (50 mL) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Installer une solution de fixation au formol |
Références
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Réimpressions et autorisations
