Quantification de la colonne dendritique à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels

Summary

Les épines dendritiques sont des compartiments post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices. Des altérations de la morphologie de la colonne dendritique se produisent au cours du neurodéveloppement, du vieillissement, de l’apprentissage et de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, soulignant l’importance d’une analyse fiable de la colonne dendritique. Ce protocole décrit la quantification de la morphologie de la colonne dendritique avec précision et reproductibilité à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels.

Abstract

Les connexions synaptiques permettent l’échange et le traitement de l’information entre les neurones. Le site post-synaptique des synapses excitatrices est souvent formé sur les épines dendritiques. Les épines dendritiques sont des structures d’un grand intérêt pour la recherche centrée sur la plasticité synaptique, le neurodéveloppement et les troubles neurologiques et psychiatriques. Les épines dendritiques subissent des modifications structurelles au cours de leur vie, avec des propriétés telles que le nombre total d’épines, la taille des épines dendritiques et les sous-types morphologiquement définis qui changent en réponse à différents processus. La délimitation des mécanismes moléculaires régulant ces altérations structurelles des épines dendritiques repose sur des mesures morphologiques. Cela nécessite une analyse précise et reproductible de la colonne vertébrale dendritique pour fournir des preuves expérimentales. La présente étude décrit un protocole détaillé pour la quantification et la classification des épines dendritiques à l’aide de Neurolucida 360 (logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels). Ce protocole permet de déterminer les principales propriétés de l’épine dendritique telles que la densité totale de l’épine, le volume de la tête de l’épine et la classification en sous-types de l’épine, permettant ainsi une analyse efficace des phénotypes structurels de l’épine dendritique.

Introduction

Les épines dendritiques sont des protubérances de dendrites comprenant souvent le site post-synaptique des synapses glutamatergiques ^1,2. Les épines dendritiques présentent un intérêt particulier dans le domaine de la plasticité synaptique. Les épines sont souvent altérées lorsque la force synaptique change, devenant plus grandes et plus fortes lors de la potentialisation synaptique à long terme ou plus petites et plus faibles lors de la dépression synaptique à long terme 3,4,5,6,7. Au-delà de la plasticité synaptique, le profil des épines dendritiques change tout au long de la vie. Au début du développement, il y a une période de formation et de croissance de l’épine dendritique, suivie d’une taille de l’épine dendritique jusqu’à atteindre un état d’équilibre ^8,9,10. Dans le cerveau vieillissant, la perte de colonne vertébrale accompagne le rétrécissement du cerveau et le déclin cognitif¹¹. De plus, de nombreux troubles neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques sont caractérisés par des épines dendritiques aberrantes. Plusieurs régions du cerveau chez les personnes atteintes de schizophrénie ont moins d’épines dendritiques, résultant probablement d’une altération de l’élagage synaptique¹². Les troubles du spectre autistique sont également caractérisés par des pathologies dendritiques de la colonne vertébrale¹³. La perte de la colonne vertébrale dendritique est une caractéristique de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson^14,15. Étant donné le large éventail de sujets de recherche englobant l’étude des propriétés dendritiques de l’épine, les techniques de quantification précise de l’épine sont d’une importance capitale.

La coloration, c’est-à-dire la méthode de Golgi, ou le marquage des neurones par remplissage de colorant ou expression de protéines fluorescentes sont des méthodes courantes pour la visualisation de la colonne vertébrale dendritique 16,17,18. Une fois visualisées, les épines peuvent être analysées avec une variété de logiciels clients gratuits et disponibles dans le commerce. Le résultat souhaité de l’analyse est un facteur important pour déterminer quel logiciel sera le plus utilisé. Fiji est une option logicielle viable pour les questions centrées sur la densité des épines dendritiques. Cependant, cette technique repose en grande partie sur un comptage manuel chronophage qui peut introduire un risque de biais. De nouveaux plugins tels que SpineJ permettent une quantification automatique, ce qui permet en outre une analyse plus précise du cou de la colonne vertébrale¹⁹. L’inconvénient de ces approches est la perte d’une analyse tridimensionnelle pour déterminer le volume de la colonne vertébrale, car SpineJ est limité à des piles d’images bidimensionnelles. De plus, l’obtention d’informations sur les sous-types de la colonne vertébrale devient difficile via ces processus. Les quatre sous-types d’épines prédominants, mince, champignon, trapue et filopodes, connotent tous des fonctions individuelles et sont largement classés selon la morphologie²⁰. Les épines minces sont caractérisées par un cou allongé et une tête définie²¹. Les épines des champignons ont une tête d’épine beaucoup plus grande et prononcée²². Les épines trapues sont courtes et présentent peu de variance entre la tête et le cou²³. Les filopodes sont des épines immatures avec un cou long et mince et aucune tête clairement observable²⁴. Bien que la classification fournisse des informations précieuses, les épines existent sur un continuum de dimensions. La classification en catégories est basée sur des plages de mesures morphologiques^25,26. La mesure manuelle des épines pour la classification complique la charge logistique des chercheurs dans cette approche.

D’autres options logicielles axées spécifiquement sur l’analyse tridimensionnelle de la colonne vertébrale dendritique sont mieux adaptées à l’étude du volume de la colonne vertébrale et des propriétés de sous-type 27,28,29,30,31. Malgré les difficultés que présente l’analyse tridimensionnelle, telles que la faible résolution du plan z et le frottis, ces options logicielles permettent une reconstruction tridimensionnelle fiable des dendrites et des épines dendritiques de manière semi-automatisée guidée par l’utilisateur. La classification automatique des épines identifiées dans leurs sous-types est également une caractéristique présente dans certains de ces logiciels d’analyse de la colonne vertébrale. Cela peut atténuer les préoccupations relatives à la charge de travail potentielle et aux biais expérimentaux. Neurolucida 360 est un logiciel disponible dans le commerce qui permet d’identifier et de classifier les épines dendritiques en trois dimensions, fiables et reproductibles32. Ici, nous présentons un protocole complet pour préparer efficacement les tissus fixés, acquérir des images et, finalement, quantifier et classer les épines dendritiques à l’aide de ce logiciel.

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux ont suivi les directives des National Institutes of Health des États-Unis sur l’utilisation des animaux dans la recherche intra-muros et ont été approuvées par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé mentale.

1. Préparation de tranches d’hippocampe fixes

1. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (kétamine : 100 mg/kg ; Xylazine : 8 mg/kg). Validez l’anesthésie par pincement de la queue et fixez la souris sur la plaque de perfusion.
2. À l’aide de grands ciseaux chirurgicaux, retirez la peau et la fourrure de la poitrine, ce qui permet de visualiser plus facilement la cage thoracique sous-jacente.
3. Faites une coupe horizontale sous la largeur de la cage thoracique, en évitant le foie et le diaphragme. À l’aide d’une pince fine, tirez le processus xiphoïde vers le haut et coupez chaque côté latéral de la cage thoracique. Relevez la cage thoracique jusqu’à la région du cou et fixez-la en place à l’aide d’une pince à hémostat.
4. Insérez une aiguille papillon de 21 g dans le ventricule gauche du cœur et commencez à perfuser à température ambiante 1x PBS à environ 5 mL/min. Faites une petite incision dans l’oreillette droite avec de petits ciseaux chirurgicaux. Perfuser avec du PBS jusqu’à ce que la solution sortant de l’oreillette soit claire.
5. Éteignez la pompe de perfusion pour vous assurer qu’aucune bulle ne pénètre dans la tubulure. Placez le tube du PBS dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % froid dans du PBS. Perfuser avec du PFA à un taux de 5 mL/min jusqu’à ce que l’animal soit complètement raide, soit environ 25 mL.
   REMARQUE : Assurez-vous que le PFA est frais (pas plus d’une semaine si le stock est stocké à 4° C) pour une fixation optimale.
6. Retirez la peau de la surface du crâne avec de petits ciseaux chirurgicaux. Faites une incision médio-sagittale avec de petits ciseaux chirurgicaux le long de la fissure centrale du crâne. Faites des coupures latérales rostrales au bulbe olfactif et au-dessus du cervelet.
7. Ouvrez le crâne avec des pinces fines pour exposer le cerveau. À l’aide d’une spatule, retirez doucement le cerveau des bulbes olfactifs et placez-le dans 4 % de PFA dans du PBS pendant la nuit.
   REMARQUE : Pour un protocole plus complet sur la perfusion chez les rongeurs, veuillez consulter Gage et ^al.33.
8. Cryoprotégez le cerveau fixe en remplaçant le PFA à 4% par 15% de saccharose dans le PBS pendant 1 jour. Ensuite, remplacez le saccharose à 15 % par du saccharose à 30 % dans la solution PBS pendant 1 jour jusqu’à ce que le cerveau pénètre dans la solution.
9. Retirez le cerveau de la solution de saccharose et placez-le dans une boîte de Pétri avec PBS. Coupez le cervelet et le bulbe olfactif à l’aide d’une lame de scalpel.
10. Placez une petite quantité de 1 à 2 cm de diamètre de composé à température de coupe optimale (OCT) sur la surface du porte-échantillon. Montez le cerveau coronalement sur le porte-échantillon avec la surface caudale coupée dans l’OCT. Gelez rapidement le cerveau en plaçant le porte-échantillon dans de la glace sèche pulvérisée jusqu’à ce qu’il soit visiblement congelé, environ 5 à 7 min.
11. Assurez-vous que l’angle de la pale du cryostat est réglé entre 0° et 5° pour produire des sections uniformes. Ajustez l’angle de la plaque de rouleau pour un aplatissement optimal des tranches. Veuillez vous référer au manuel de l’équipement pour des instructions spécifiques.
12. Placez le porte-échantillon dans le cryostat avec la surface ventrale du cerveau la plus proche de la pale. Coupez le cerveau en sections dorsales de l’hippocampe de 30 μm, en jetant toutes les tranches rostrales à l’hippocampe.
    REMARQUE : Cette partie du protocole peut être adaptée à n’importe quelle région cérébrale souhaitée de votre choix. Les étapes 1.9 à 1.12 changeraient en fonction de la région d’intérêt.
13. Transférez les tranches dorsales de l’hippocampe dans du PBS. À l’aide d’un pinceau, fixez délicatement les sections de l’hippocampe sur une lame de microscope. Enlevez tout excès de solution à l’aide d’un coton-tige ou de lingettes délicates.
14. Appliquez 100 μL de support de montage rigide sur la lame de microscope en couvrant toutes les tranches de cerveau. Pour éviter les bulles, abaissez lentement la lamelle à l’aide d’une pince sur le support de montage. Si des bulles se forment, tapotez doucement la lamelle avec une pince pour leur permettre de s’échapper. Laissez les lames reposer toute la nuit avant l’imagerie.

2. Imagerie confocale haute résolution

1. Utilisez des oculaires à faible grossissement pour identifier les cellules fluorescentes. Passez à un objectif 63x (NA = 1,4) ou supérieur, en appliquant un milieu d’immersion approprié à l’objectif.
   REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, utilisez un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 63x ou plus.
2. Identifiez les segments dendritiques bien étiquetés avec un chevauchement limité pour l’acquisition d’images. Réglez la puissance et le gain du laser pour vous assurer que les dendrites fluorescentes ne sont pas saturées. De plus, la réduction de la vitesse de balayage peut fournir une meilleure résolution d’image.
3. Acquérez des piles z englobant les segments dendritiques complets pour une analyse future. Les empilements Z de plus de 10 μm sont indésirables en raison du potentiel supplémentaire de chevauchement dendritique dans le plan z.
   REMARQUE : Utilisez la plus petite taille de pas z disponible (0,2-0,7 μm) et 1 taille de sténopé d’unité aérée. La taille plus petite du pas permet d’obtenir plus d’images dans la pile z, ce qui compense la résolution Z limitée de nombreux microscopes.
4. Facultatif : Si disponible, utilisez la fonctionnalité logicielle de déconvolution respective du microscope pour déconvolution des images. Cela permettra d’obtenir des images de plus haute résolution.

3. Quantification de l’épine dendritique

1. Ouvrez Neurolucida 360 (v2022.1.1 ou version ultérieure). Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse de la colonne vertébrale (Fichier > Ouvrir > image). Assurez-vous que le fichier image est visible dans la fenêtre principale et dans l’environnement 3D. Si la fenêtre de l’environnement 3D n’apparaît pas, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’environnement 3D dans la barre d’outils supérieure de la fenêtre principale dans l’onglet Trace (Figure supplémentaire 1)
   REMARQUE : Cette section du protocole peut être adaptée à n’importe quelle image dendritique, pas exclusivement aux dendrites de tissu de souris.
2. Dans l’onglet Modifier l’affichage de l’image de la fenêtre Environnement 3D, assurez-vous que l’image est affichée en tant que volume 3D dans la zone Afficher l’image comme . Dans la zone Paramètres de pile d’images de l’onglet Image , sélectionnez Projection maximale dans le menu déroulant Afficher la surface en tant que . (Figure supplémentaire 2)
3. Identifier un segment dendritique approprié pour le traçage.
   1. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’outil Déplacer le point de pivot dans la barre d’outils supérieure de la fenêtre Environnement 3D . Faites un clic gauche sur la dendrite souhaitée pour définir un nouveau point de pivot. Cela changera l’orientation pour permettre un zoom avant efficace.
   2. Rétablissez l’orientation d’origine en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’icône Réinitialiser l’orientation . Après avoir défini le point de pivot, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’outil Déplacer le point de pivot pour commencer à tracer la dendrite. (Figure supplémentaire 2).
      REMARQUE : La dendrite idéale est celle qui se chevauche peu avec d’autres dendrites dans l’un des plans de coordonnées et qui ne se coupe pas avec une autre dendrite ou qui n’est pas superficielle à une autre en dessous. Les dendrites à faible proximité d’autres dans le plan XY sont également préférables pour éviter l’attribution inappropriée des épines voisines à la dendrite tracée. Il faut également noter que les dendrites d’épaisseurs, d’ordres et de distances différents du soma ont des densités d’épines dendritiques différentes^34,35. Cela doit être pris en compte dans la conception de l’expérience. Les dendrites d’ordre secondaire <1,5 μm d’épaisseur sont des candidates idéales pour le traçage (figure 1).
4. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Arborescence de la fenêtre Environnement 3D . Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Guidé par l’utilisateur pour le mode de traçage et sur Noyaux directionnels comme méthode dans les options de traçage guidé par l’utilisateur.
5. Faites un clic gauche sur la dendrite lorsqu’un noyau circulaire apparaît pour commencer le traçage. Déplacez le curseur le long du segment dendritique. Cela remplira automatiquement les noyaux. Si les noyaux ne se remplissent pas automatiquement, reportez-vous à l’étape 3.51.
   1. Déplacez doucement le curseur d’avant en arrière sur la dendrite jusqu’à ce que les grains se remplissent. Faites un clic gauche pour conserver les noyaux détectés existants. Si les noyaux cessent de se remplir, cliquez avec le bouton gauche de la souris lorsqu’un noyau se remplit plus bas dans la dendrite pour en placer un manuellement. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour terminer le suivi. Assurez-vous que la dendrite tracée mesure au moins 7 μm de longueur (figure supplémentaire 3).
6. Vérifiez la précision du traçage dendritique à l’aide des trois directions de l’environnement 3D, tangage, lacet et roulis, en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en faisant glisser la fenêtre de l’environnement 3D . Identifiez les points où le tracé dendritique se trouve en dehors de l’emplacement approprié sur la dendrite. Il peut y avoir des cas où il semble tracé avec précision de haut en bas, mais dans la dimension z, les points ne sont pas sur la dendrite (Figure 2).
7. Pour corriger les segments dendritiques mal tracés, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Modifier dans le menu Arborescence . Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la dendrite qui vous intéresse, puis cliquez sur Points.
8. Déplacez les points mal placés sur le segment de dendrite en cliquant et en glissant. Supprimez les points superflus en cliquant dessus avec le bouton gauche de la souris et en cliquant sur le bouton Supprimer . Modifiez la taille des points si la dendrite n’est pas correctement remplie. Pour modifier la taille du point, cliquez avec le bouton gauche sur un point et ajustez le curseur d’épaisseur pour modifier la taille (Figure supplémentaire 4).
   REMARQUE : Des dendrites mal remplies peuvent entraîner l’identification de fausses épines qui sont des composants du segment dendritique. À l’inverse, un remplissage excessif des dendrites peut masquer les véritables épines.
9. Répétez les étapes 3.3 à 3.8 pour plusieurs dendrites dans l’image avant de passer à l’identification du dos à l’étape 3.10.
10. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Colonne vertébrale dans la fenêtre Environnement 3D. Définissez les paramètres de détection pour la plage extérieure, la hauteur minimale et le nombre minimum de voxels. En fonction de la préparation, il peut être nécessaire de modifier les valeurs prédéfinies dans le cas d’une justification claire et spécifique des modifications. Les conditions prédéfinies sont la suivante : plage extérieure : 2,5 μm, hauteur minimale : 0,3 μm, nombre minimum de voxels : 10 voxels.
    REMARQUE : Différentes préparations, telles que des cultures cellulaires par rapport à des tissus aigus, ainsi que des points de développement différents, nécessiteront des critères différents qui doivent être tirés de la littérature existante. Il est également essentiel de noter que la modification des paramètres de détection peut modifier considérablement les résultats. Par exemple, une hauteur minimale plus élevée peut exclure les épines courtes. Les paramètres de détection doivent rester cohérents tout au long de l’expérience.
11. Réglez la sensibilité du détecteur sur 70 % et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Détecter tout. Cela peuplera les épines identifiées par cette sensibilité du détecteur sur toutes les dendrites. Si vous souhaitez sélectionner des épines d’une manière spécifique aux dendrites, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur la case Cliquez sur l’image pour détecter tout sur la branche la plus proche, puis cliquez avec le bouton gauche de la souris sur chaque dendrite avec des sensibilités de détecteur différentes.
    REMARQUE : À ce stade, il est normal que toutes les épines dendritiques ne se peuplent pas. De même, les non-épines peuvent mal se peupler. La sensibilité initiale de 70 % est également flexible ; Cela peut changer en fonction de la préparation.
12. Examinez les épines sélectionnées par la sensibilité de ce détecteur en cliquant et en faisant glisser la dendrite dans les trois directions. Si la majorité des épines détectées ne sont pas complètement remplies, passez à l’étape 3.12.1. Si les épines détectées sont trop remplies, passez à l’étape 3.12.2. Si les épines détectées semblent être correctement remplies, passez à l’étape 3.13.
    1. Augmentez la sensibilité du détecteur de 5 à 10 % et cliquez à nouveau sur Détecter tout . Cela remplacera toutes les épines précédemment détectées par de nouvelles à une sensibilité plus élevée. Répétez l’opération au besoin jusqu’à ce que les épines détectées soient correctement remplies.
    2. Diminuez la sensibilité du détecteur de 5 à 10 % et cliquez à nouveau sur Détecter tout . Cela remplacera toutes les épines précédemment détectées par de nouvelles à plus faible sensibilité. Répétez l’opération au besoin jusqu’à ce que les épines détectées soient correctement remplies.
13. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Conserver les épines existantes dans l’onglet Colonne vertébrale de l’environnement 3D. Si l’option Cliquer sur l’image pour détecter tout sur la branche la plus proche a été sélectionnée, désélectionnez-la.
    REMARQUE : En cochant la case Conserver les épines existantes , vous vous assurez que l’identification manuelle des épines dendritiques nouvellement identifiées n’écrasera pas les épines précédemment identifiées. Assurez-vous que cette case est sélectionnée avant de continuer afin de ne pas écraser le travail précédent.
14. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Déplacer le point de pivot et cliquez avec le bouton gauche sur la dendrite, ce qui nécessite une détection supplémentaire de la colonne vertébrale pour définir le point de pivot.
    1. Désélectionnez Déplacer le point de pivot. Identifiez une épine dendritique non remplie. Augmentez la sensibilité du détecteur de 10 à 20 % au-delà de la détection précédente et faites un clic gauche sur la colonne vertébrale. Si la colonne vertébrale détectée est sous-remplie ou trop remplie, passez à l’étape 3.14.3 ou 3.14.4. Si la colonne vertébrale n’est pas renseignée, le message Impossible de détecter une colonne vertébrale à l’emplacement sélectionné s’affiche. Dans ce cas, passez à l’étape 3.14.2.
    2. Augmentez progressivement la sensibilité du détecteur , éventuellement au-dessus de 100 %, jusqu’à ce que la colonne vertébrale ait été détectée et correctement remplie. Si la colonne vertébrale est détectée mais insuffisamment remplie, passez à l’étape 3.14.3. Si la colonne vertébrale est trop remplie, passez à l’étape 3.14.4 (Figure 3).
    3. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Modifier et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le dos sous-rempli. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Supprimer. Désélectionnez l’onglet Modifier . Augmentez la sensibilité de 5 à 10 % et faites un clic gauche sur la colonne vertébrale. Répétez cette étape si la colonne vertébrale est toujours sous-remplie.
    4. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Modifier et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le dos trop rempli. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Supprimer. Désélectionnez l’onglet Modifier . Diminuez la sensibilité de 5 à 10 % et cliquez sur la colonne vertébrale. Répétez cette étape si la colonne vertébrale est encore trop remplie.
15. Répétez les étapes 3.14 à 3.14.4 jusqu’à ce que toutes les épines identifiées par identification visuelle aient été détectées. Vérifiez que la dendrite ne contient pas d’épines appartenant à des dendrites voisines, de fausses épines correspondant à aucun signal véritable ou des segments potentiels de dendrite étiquetés à tort comme une épine. Supprimez ces fausses épines à l’aide de la fonction Supprimer .
16. Examinez les épines identifiées sur la dendrite. Dans certains cas, plusieurs épines peuvent apparaître comme une seule épine de conglomérat. Si une colonne vertébrale semble en englober deux, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Modifier . Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le dos et cliquez sur Masquer la sélection. Après avoir confirmé une colonne vertébrale de conglomérat, dans l’onglet Modifier , cliquez avec le bouton gauche sur Afficher la sélection et sélectionnez Diviser. Si plus de deux épines se trouvent dans un conglomérat, il peut être nécessaire de répéter cette étape (figure 4).
    REMARQUE : Si le dos du conglomérat ne se divise pas après l’étape 3.16, retirez le dos . Sélectionnez ensuite la colonne vertébrale la plus intense du conglomérat à une sensibilité plus faible. Une fois que la colonne vertébrale la plus intense est remplie, augmentez la sensibilité pour sélectionner l’autre colonne vertébrale non remplie. Alternativement, la suppression de l’épine du conglomérat puis l’augmentation de la sensibilité peuvent permettre une séparation correcte.
17. Une fois toutes les épines visuellement identifiables détectées et remplies de manière appropriée, dans l’onglet Épine , cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Classifier tout pour classer les épines en quatre sous-types : fine, champignon, trapue et filopodie (Figure 5).
    REMARQUE  : Les paramètres de classification du dos peuvent être modifiés dans la fenêtre Paramètres de la boîte Classification dans l’onglet Dos . Comme pour les réglages du détecteur, une justification claire de la modification des paramètres existants est fortement encouragée. Les valeurs prédéfinies sont le rapport tête-cou : 1,1, le rapport longueur/tête : 2,5, la taille de la tête du champignon : 0,35 μm, la longueur du filopodium - 3 μm.
18. Dans la barre d’outils supérieure de la fenêtre Environnement 3D, sélectionnez Enregistrer et afficher dans Neurolucida Explorer. Neurolucida Explorer est l’endroit où les données sont collectées à partir des tracés. L’œuvre sera sauvegardée sous forme de fichier .dat contenant tous les tracés et les dos.
19. Dans la fenêtre de l’Explorateur, dans l’onglet Affichage , cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Sélectionner tout pour mettre en surbrillance toutes les dendrites et les épines.
20. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’onglet Analyser dans la barre d’outils supérieure. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le menu déroulant Structure . Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Analyse de la structure ramifiée.
21. En fonction des variables d’intérêt, n’importe laquelle des analyses peut être sélectionnée. Les deux questions les plus utiles pour les questions centrées sur la densité de la colonne vertébrale et le volume moyen de la colonne vertébrale sont Chaque arbre > chaque dendrite et Détails des épines > de la colonne vertébrale. Sélectionnez OK et les données apparaîtront dans deux fenêtres distinctes.
22. Copiez les données dans une feuille de calcul pour une compilation et une analyse plus approfondies.
    REMARQUE : L’arbre individuel sera séparé par une dendrite, mais le volume de la colonne vertébrale ne le sera pas. À l’aide de la fonction de tri dans la feuille de calcul, les détails du dos peuvent être filtrés par caractéristiques.

Results

L’utilisation efficace de cette méthode d’analyse commence par la sélection des segments dendritiques pour le traçage. Comme décrit à la figure 1, les dendrites idéales pour le traçage ne sont pas à proximité d’autres dendrites. Les dendrites fonctionnant en parallèle peuvent entraîner une identification incorrecte des épines d’une dendrite voisine. Les dendrites qui se croisent directement ou qui sont perpendiculaires dans un plan z différent ajoutent également une difficulté significative au traçage dendritique précis. Il est également important de noter les différences d’épaisseur des dendrites. Comme indiqué précédemment, il existe des différences clés dans la densité de la colonne vertébrale avec des dendrites d’épaisseur variable³⁶. Il peut également y avoir des différences dans la même dendrite avec une distance accrue par rapport au point de branche³⁷. Le traçage de dendrites du même ordre et de la même épaisseur, idéalement avec des origines de points de branche similaires, peut contrôler l’hétérogénéité existante de la densité des épines dendritiques. L’identification du point de dérivation dans certaines préparations peut s’avérer irréalisable, mais l’épaisseur de la dendrite doit toujours être un facteur contrôlable dans le traçage des dendrites. Le traçage précis des segments dendritiques est essentiel pour obtenir des résultats précis de cette analyse. Il est nécessaire de s’assurer que tous les points de la dendrite tracée se trouvent vraiment à l’intérieur de la dendrite. L’observation de la dendrite tridimensionnelle dans différentes directions peut aider à ce processus. Comme le montre la figure 2A, B, la vue de haut en bas montre ce qui semble être une dendrite correctement tracée. En vue latérale ; Cependant, de nombreux points ne sont pas situés sur la dendrite elle-même. Ces problèmes ne sont pas présents dans la vue latérale de la figure 2C. Il est également essentiel de s’assurer que les dendrites sont correctement remplies pendant le traçage. Une dendrite sous-remplie peut faire en sorte que des morceaux de dendrites soient identifiés de manière inappropriée comme des épines. Une dendrite trop remplie peut empêcher l’identification des véritables épines en raison du seuil de hauteur minimale. Cette évaluation manuelle du traçage guidé par l’utilisateur est essentielle pour permettre une analyse précise de la colonne vertébrale dendritique.

L’identification des épines dendritiques nécessite également une approche guidée par l’utilisateur. L’utilisation de la fonction « Détecter tout » pour régler le seuil de sensibilité uniforme du détecteur est inadéquate pour de nombreuses raisons. L’utilisation de la fonction « Détecter tout » est utile pour identifier les épines les plus évidentes, mais le remplissage de ces épines doit être vérifié pour vérifier. Les épines identifiées avec l’initiale « Détecter tout » peuvent être sous-remplies. Pour corriger cela, la colonne vertébrale identifiée doit être supprimée individuellement, puis réidentifiée manuellement à une sensibilité de détecteur plus élevée (Figure 3A-C). Cela permet de s’assurer que la colonne vertébrale est correctement remplie. Il existe une hétérogénéité substantielle dans la sensibilité requise du détecteur pour les épines qui doivent être prises en compte manuellement. L’augmentation de la sensibilité du détecteur pour détecter toutes les épines peut entraîner des épines trop remplies, qui nécessitent également une correction manuelle (figure 3D). Un autre problème lié à la sensibilité inappropriée du détecteur est la création inappropriée d’une épine de conglomérat, une épine dendritique remplie qui englobe plusieurs épines. Deux épines très proches l’une de l’autre peuvent être fusionnées de manière inappropriée en une seule épine de conglomérat (Figure 4A,B). Le logiciel de détection de la colonne vertébrale dispose d’une fonction « Split », qui peut être utilisée pour séparer les épines qui ont été fusionnées par surremplissage. La fonction « Split » permet aux épines individuelles d’être facilement générées à partir de l’épine du conglomérat (Figure 4C). Le traçage précis des dendrites et le remplissage de la colonne vertébrale dendritique permettent une classification précise en sous-types de la colonne vertébrale. La classification de la colonne vertébrale repose sur la morphologie des épines remplies et la distance par rapport aux dendrites, de sorte que chaque étape du processus joue un rôle dans la classification morphologique (Figure 5).

En raison de la nécessité d’une sélection et d’un seuillage manuels, il est crucial de suivre une norme uniforme pour toutes les analyses. Cela est particulièrement pertinent si plusieurs utilisateurs contribuent à l’analyse des données. Pour s’assurer que tous les chercheurs qui effectuent des analyses suivent la même norme, les chercheurs doivent comparer les données des mêmes dendrites tracées. Cela peut réduire le risque de biais de l’expérimentateur en s’assurant que chaque chercheur identifie les épines sur la base de critères communs et uniformes de manière aveugle. Il est également possible qu’un seul chercheur biaise entre les jours ou même le même jour en raison de la fatigue. Cela doit être surveillé tout au long du processus d’analyse des données. Pour garantir davantage la validité de l’analyse, la comparaison des résultats initiaux avec ceux publiés dans la littérature permet de s’assurer que le protocole est effectivement suivi. Il est essentiel de noter que cette comparaison ne sera efficace que si la préparation et les paramètres sont partagés. Des différences dans la coloration, l’acquisition de signaux fluorescents, l’ordre et l’épaisseur des dendrites ou la région du cerveau peuvent contribuer à des résultats différents ^8,36. Dans le cas de résultats publiés manquants, le recours à plusieurs chercheurs pour valider l’identification de la colonne vertébrale permet d’accroître la confiance dans la fiabilité et la reproductibilité de l’analyse. Un dossier d’analyse supplémentaire a été inclus dans ce manuscrit. Ce dossier contient des fichiers d’images d’échantillons de segments dendritiques, de dendrites tracées, de dendrites tracées avec des épines identifiées et classifiées, et des données produites (tableau supplémentaire 1, fichier supplémentaire 1, fichier supplémentaire 2, fichier supplémentaire 3 et fichier supplémentaire 4). Les nouveaux utilisateurs peuvent s’entraîner sur cet ensemble de données pour mettre en pratique les procédures décrites dans ce document. Les résultats générés par les utilisateurs dans 10 % de l’ensemble de données de l’échantillon fourni sont jugés acceptables pour reproduire la norme d’analyse. En raison des critères potentiellement subjectifs d’une colonne vertébrale entièrement remplie et de la nécessité d’un examen manuel des épines détectées automatiquement, la variance entre et au sein des chercheurs fait partie intégrante de l’analyse. Si les résultats générés dépassent ce seuil ; Cependant, une comparaison côte à côte doit être effectuée pour déterminer les cas de différents volumes d’épines ainsi que les épines mal incluses ou exclues. L’échantillon de jeu de données peut ensuite être réanalysé jusqu’à ce que le seuil acceptable soit atteint.

Figure 1 : Sélection des dendrites pour l’analyse de la colonne dendritique. (A) Affichage en volume 3D d’images confocales de la pile z prises à partir de dendrites proximales CA1 dans la lignée de souris transgéniques THY1-YFP. Notez l’hétérogénéité de l’ordre des dendrites avec des dendrites primaires plus épaisses dans les ovales bleus et des dendrites secondaires et tertiaires plus fines dans les ovales roses. (B) Les candidats idéaux pour le traçage des dendrites sont indiqués par des ovales verts. Notez l’épaisseur et les intersections limitées, les chevauchements et la proximité d’autres dendrites. L’ovale rouge indique les segments dendritiques à éviter pour le traçage dendritique en raison des intersections élevées, des chevauchements et de la proximité d’autres dendrites. Les dendrites primaires plus épaisses ne sont pas non plus adaptées au traçage. Barre d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Traçage précis des segments dendritiques. (A) Affichage en volume 3D d’images confocales de la pile z prélevées à partir de dendrites proximales CA1 dans la lignée de souris transgéniques THY1-YFP à tracer via la méthode du noyau directionnel guidé par l’utilisateur. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Exemple de traçage de dendrites médiocre. La dendrite semble être correctement tracée dans la vue de haut en bas. La vue latérale montre que la dendrite est mal remplie avec des points s’écartant de la dendrite. (C) Exemple d’un traçage de dendrites approprié. La vue de haut en bas semble similaire à la vue B, mais la vue latérale diffère considérablement. La dendrite en C est correctement tracée, comme l’indique le fait qu’elle est entièrement remplie, sans aucune déviation de la dendrite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Remplissage précis des épines dendritiques à l’aide d’une sélection manuelle. (A) Affichage en volume 3D d’images confocales de la pile z prises à partir de dendrites proximales CA1 dans la lignée de souris transgéniques THY1-YFP d’une épine en attente de détection manuelle. Barre d’échelle = 0,5 μm. (B) Exemple d’une épine dendritique sous-remplie. Il y a un signal fluorescent important encore visible en raison d’un remplissage incomplet. (C) Exemple d’une épine dendritique correctement remplie. La présence d’une « couronne » de signal à peine visible autour de l’extérieur de la garniture est la norme pour remplir avec précision les épines dendritiques. (D) Exemple d’une épine dendritique surchargée. La sensibilité du détecteur est trop élevée, ce qui entraîne une colonne vertébrale trop remplie. Le remplissage a dépassé les limites de la fluorescence et a une couronne presque imperceptible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Division des épines dendritiques du conglomérat. (A) Affichage en volume 3D d’images confocales de la pile z prises à partir de dendrites proximales CA1 dans la lignée de souris transgéniques THY1-YFP avec deux épines à proximité. Barre d’échelle = 0,15 μm. (B) Un exemple de deux épines indépendantes mal remplies comme une seule épine dendritique de conglomérat. (C) Suite à l’utilisation de la fonction « Split », l’épine du conglomérat est divisée en deux épines dendritiques distinctes correctement remplies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Identification et classification de l’épine dendritique en sous-types. (A) Affichage en volume 3D d’images confocales de l’empilement z prises à partir de dendrites proximales CA1 dans la lignée de souris transgéniques THY1-YFP d’un segment dendritique tracé isolé pour la quantification et la classification de l’épine dendritique. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Segment dendritique tracé avec toutes les épines dendritiques identifiées et examinées pour s’assurer que le remplissage et la division sont appropriés. Le logiciel attribue arbitrairement des couleurs aux épines identifiées dans cette étape. (C) Classification de toutes les épines dendritiques identifiées en sous-types à l’aide de paramètres définis dans le logiciel. Bleu = champignon, jaune = mince et vert = trapu. Les filopodes ne sont pas présents en raison de l’âge de ce tissu. (D) Images représentatives d’épines champignons, minces et trapues non remplies (en haut) et remplies (en bas). Barre d’échelle = 0,3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Accès à l’environnement 3D. Pile Z d’images confocales visualisées dans l’interface du logiciel. La navigation dans l’environnement 3D à partir de l’onglet Trace de la visionneuse principale a été mise en évidence en jaune. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Paramètres d’image et paramètres d’orientation pour l’environnement 3D. Visionneuse d’environnement 3D pour les images confocales z-stack. Les paramètres de l’onglet Modifier l’affichage de l’image en surbrillance indiqués par des flèches jaunes sont définis sur Afficher l’image sous forme de volume 3D et Afficher la surface sous forme de projection maximale. Le déplacement du point de pivot et la réinitialisation de l’orientation sont identifiés par des flèches jaunes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Tracé des segments de dendrite. (A) Volume 3D d’images confocales z-stack pour le traçage des dendrites. Lorsque l’onglet Arborescence, les noyaux guidés par l’utilisateur et les noyaux directionnels sont tous sélectionnés, le traçage commence en plaçant le noyau initial sur la dendrite avec un clic gauche. (B) Propagation des grains directionnels le long de la dendrite suite au mouvement du curseur. (C) Un clic gauche plus bas sur la dendrite remplit les noyaux directionnels. (D) Exemple de noyaux directionnels ne remplissant pas la dendrite. Au lieu de cela, un noyau solitaire est présent plus bas dans le segment. (E) Un clic gauche sur le noyau solitaire remplit la dendrite entre les deux points. Un clic droit met fin au traçage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Ajustement des points dans les dendrites tracées. (A) Segment de dendrite tracé en attente d’ajustement du point. L’édition dendrite nécessite la sélection de l’onglet « Arbre » et de l’onglet « Modifier ». Les deux sont surlignés en jaune. Dendrite a été sélectionné pour l’édition avec un clic gauche. (B) La sélection de l’onglet des points, surligné en jaune, permet de sélectionner des points individuels sur le segment de dendrite. Le point vert a une épaisseur de 1,2 μm. (C) Point ajusté pour remplir la dendrite avec plus de précision. La nouvelle valeur d’épaisseur du point vert est de 0,6 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Résultats de l’analyse d’images d’échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Exemples de tracés d’images avec dendrites et spines.dat Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Exemples de tracés avec dendrites.dat Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Exemple d’image de dendrite file.czi Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Exemple d’image de dendrite file.jpx Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole détaille les étapes spécifiques de la préparation des échantillons, de l’imagerie et du processus de quantification et de classification des épines dendritiques à l’aide d’un logiciel de reconstruction tridimensionnelle. Ce logiciel est un outil puissant capable de produire des données structurelles robustes qui contribuent à un large éventail d’enquêtes. Tout au long du processus, il y a quelques étapes critiques qui rendent ce protocole moins lourd méthodologique et améliorent la production globale des données. La méthode de marquage des épines dendritiques est l’une des premières choses que les chercheurs devraient considérer avant de se lancer dans ce protocole. Des problèmes de quantification de la colonne vertébrale peuvent provenir de méthodes d’étiquetage insuffisantes. La coloration de certaines protéines exprimées à de faibles niveaux dans les épines peut entraîner des signaux trop faibles pour le logiciel. Il convient également de noter que le biais peut être introduit en traçant les dendrites fluorescentes les plus brillantes. Bien qu’il ne soit pas clair si différentes dendrites fluorescentes ont des propriétés physiologiques différentes, il reste une limite du protocole à prendre en compte. De plus, dans certaines lignées transgéniques, telles que la lignée THY1-YFP-H, la fluorescence des épines dendritiques n’apparaît qu’autour de P21. Cela rend cette ligne inappropriée pour les enquêtes sur les points temporels du développement plus jeunes. L’examen de la méthode utilisée pour marquer les épines pour la piste d’investigation n’est pas un aspect trivial, car sans une fluorescence suffisante, le logiciel a diminué la facilité d’utilisation. De même, le matériel d’acquisition d’images doit être pris en compte. Il y a certains types de fichiers qui s’avèrent moins compatibles avec le logiciel d’analyse que d’autres. Plus précisément, les fichiers ND2 ont été identifiés comme des types de fichiers problématiques pour l’utilisation efficace du logiciel. Les fournisseurs de logiciels recommandent la conversion vers des types de fichiers tels que JPEG2000 en cas de problème.

La préparation des tissus et l’acquisition d’images sont également des étapes importantes pour une quantification de haute qualité de la colonne vertébrale. La fixation, le tranchage et le montage appropriés des tissus garantissent un échantillon durable avec un minimum d’artefacts pouvant interférer avec l’analyse des données. L’imagerie du tissu ne consiste pas non plus simplement à prendre des images de la pile z de la tranche entière du cerveau. Pendant l’imagerie, l’intention doit toujours être d’acquérir des piles contenant des dendrites pour la quantification de la colonne vertébrale. L’accent doit être mis sur l’acquisition de piles z incorporant des dendrites qui seront faciles à tracer. Une pile z plus épaisse entraîne généralement plus de dendrites d’arrière-plan. Il est donc plus difficile de tracer efficacement les dendrites avec le logiciel. Prendre plus de temps pendant l’imagerie pour trouver de meilleurs candidats pour le traçage permettra de gagner plus de temps lors de l’analyse de quantification de la colonne vertébrale. De plus, assurez-vous que les images de la pile z incorporent l’intégralité des dendrites à tracer. Si les dendrites ne sont que partiellement visibles dans la pile z, le traçage des dendrites et l’identification du dos s’avéreront difficiles et imprécis en raison d’un rendu 3D incomplet.

Le processus de traçage des dendrites et d’obtention d’un profil précis des épines dendritiques identifiées peut être un processus ardu. Il y a une certaine nuance. Lors du traçage de dendrites, la fonction guidée par l’utilisateur peut parfois ne pas fonctionner comme prévu. Parfois, les noyaux directionnels ne se renseignent pas sur un certain segment ou commencent à s’alimenter sur un segment indésirable. Une façon de contourner ce problème est de commencer par une largeur de processus typique plus petite. Cela rend la dendrite plus détectable dans le logiciel, ce qui facilite le traçage. Si le noyau directionnel ne parvient pas à se remplir entièrement, un clic gauche sur la dendrite en placera une manuellement. Il arrivera à un très petit point et ne remplira pas la dendrite, mais cela peut être corrigé avec l’ajustement de l’épaisseur comme décrit à l’étape 3.8 du protocole. Bien que les dendrites puissent être tracées manuellement si le logiciel s’avère inadéquat, le traçage manuel des épines n’est pas une capacité du logiciel. Il y aura des cas où une colonne vertébrale claire semblera être visible, mais quelle que soit la sensibilité du détecteur, le logiciel ne parviendra pas à la détecter. Une chose à vérifier est si la colonne vertébrale suspectée est hors de portée. S’il est à portée mais n’est toujours pas identifié par le logiciel, alors cette colonne vertébrale sera exclue de l’analyse. Bien que cela puisse rarement se produire, il s’agit d’une limitation à prendre en compte. Comme pour toute analyse nécessitant un seuillage et une composante de classification manuelle, il est possible d’introduire un biais. Ce problème peut être encore aggravé lorsque l’on compare des données générées par plusieurs utilisateurs. La nature semi-automatisée de cette analyse vise à minimiser l’introduction de ce biais, mais il n’est pas entièrement éliminé. Dans notre laboratoire, un écart de 10 % entre les chercheurs sur un ensemble de données standard était raisonnable avec suffisamment de pratique et de formation. Bien que des efforts aient été déployés pour minimiser les biais, il est toujours important de tenir compte des biais interchercheurs lors de l’évaluation des données générées par ce protocole.

Compte tenu des inconvénients mineurs du logiciel, le résultat de l’analyse de la colonne dendritique à l’aide de cette technique est très robuste. Comme décrit précédemment, il existe une myriade de paramètres qui peuvent être extrapolés à partir d’un traçage précis des segments dendritiques et de l’identification de la colonne vertébrale. La possibilité d’obtenir des informations sur les sous-types de colonne vertébrale fournit des informations précieuses à un niveau plus profond que les mesures de base. Ces données sont importantes en raison de l’interconnectivité entre la structure et la fonction. Chaque sous-type de colonne vertébrale connote une fonction. Les épines minces sont le sous-type prédominant subissant un renouvellement abondant²¹. Les épines minces ont également le potentiel de se transformer en épines de champignon³⁸. Cela est cohérent avec le fait que les épines de champignon sont fortement associées à l’apprentissage et à la mémoire^38,39. On pense également que les épines trapues sont une composante de l’apprentissage, potentiellement sous forme de restes d’épines de champignon⁴⁰. Les filopodies, bien qu’elles ne soient pas répandues dans de nombreux tissus adultes, sont des précurseurs de la colonne vertébrale qui présentent un intérêt clé pour le développement^41,42. La microscopie électronique 3D reste la référence pour la classification la plus précise des sous-types de colonne vertébrale. Bien qu’utile, cette technique est limitée par un tri et une classification manuels ardus, sujets aux erreurs humaines. La conception semi-automatisée de cette analyse réduit les cas où un biais subjectif pourrait être introduit. Bien qu’il puisse y avoir des inconvénients en termes de résolution absolue et d’intensité de fluorescence requises pour effectuer des classifications parfaites dans ce protocole, il offre toujours une alternative méthodologiquement moins exigeante à la microscopie électronique 3D et à la classification manuelle. De plus, l’analyse complète des dendrites de plusieurs branches dendritiques à partir d’un échantillon plus large de régions cérébrales est possible en utilisant l’analyse décrite dans ce travail. Ce n’est pas le cas de la microscopie électronique. Grâce à l’utilisation de ce protocole, il est possible d’aborder des questions centrées sur la structure dans plusieurs disciplines, y compris, mais sans s’y limiter, la plasticité synaptique, le développement et les troubles neurologiques et psychiatriques, de manière fiable et reproductible.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Huile d’immersion	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	Pour la préparation de tranches
Pince fine	FST	11150-10
Pince Hemostat	FST	13020-12
Grands ciseaux chirurgicaux	FST	14002-16
LSM 880 Microscope confocal	Zeiss	LSM 880
Couvercle de microscope en verre	Fisherbrand	12-541-035
Mini-pompe péristaltique II	Appareil de Harvard	70-2027	Pour perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Logiciel d’analyse de la colonne vertébrale
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Logiciel d’analyse de la colonne
vertébrale OCT Compound	Sakura Finetek	4583	Pour le sectionnement du cryostat
Paraformaldéhyde (37 %)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Huile DIC	Zeiss	440762-9904-000
Lame de scalpel	FST	10022-00
Petits ciseaux chirurgicaux	FST	14060-09
Spatule  ;	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Montage Medium	Vector Laboratories	H-1400-10