Cette étude présente deux techniques expérimentales cruciales : la construction d’un modèle de plaie murine pour évaluer la fermeture de la plaie et la préparation de suspensions unicellulaires à partir de peau murine pour préserver la viabilité cellulaire.
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Article de méthode
Modèles de plaies chez la souris et préparation de suspensions de cellules uniques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La prise en charge des lésions cutanées aiguës de pleine épaisseur représente un défi considérable dans la pratique clinique. La complexité de la cicatrisation des plaies, impliquant des populations cellulaires diverses et le microenvironnement complexe de la plaie, complique l’évaluation des effets du traitement et de leurs interactions à l’aide d’approches expérimentales traditionnelles. La technologie de séquençage du transcriptome unicellulaire a révolutionné la compréhension des fonctions et des mécanismes cellulaires pendant la cicatrisation des plaies. Cependant, la variabilité des méthodologies de création de modèles de plaies chez la souris introduit des facteurs de confusion qui peuvent avoir un impact sur les résultats expérimentaux. De plus, le processus de dissociation des tissus cutanés de souris présente des obstacles techniques importants, soulignant le besoin critique de suspensions unicellulaires de haute qualité pour un séquençage précis du transcriptome. Par conséquent, cette étude vise à optimiser la construction de modèles de plaies chez la souris afin d’évaluer avec précision les changements dans la fermeture de la plaie tout en éliminant les variables qui pourraient influencer le résultat du séquençage ultérieur. De plus, la préparation de suspensions unicellulaires a été effectuée à l’aide de protocoles de préparation d’enzymes et de protocoles de kits de test afin d’optimiser le coût et l’efficacité.
Introduction
La souris est un modèle animal largement reconnu dans la recherche pour sa séquence génétique hautement homologue à celle de l’homme, sa reproduction rapide, son rapport coût-efficacité et sa taille gérable1. Cependant, il existe des différences dans la structure de la peau entre les souris et les humains. Les souris ont une couche de membrane cutanée distincte qui contribue à la contraction de la peau, jouant un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies chez cette espèce. En revanche, la cicatrisation des plaies humaines implique principalement la réépithélialisation et la formation de tissu de granulation1.
Malgré ces différences interespèces dans la structure de la peau, le modèle murin reste le choix privilégié dans la recherche sur la réparation des plaies et conserve une importance significative par rapport à d’autres modèles animaux2,3. Lorsque vous utilisez de la peau de souris pour imiter les processus de cicatrisation des plaies humaines, il est essentiel d’examiner attentivement divers facteurs d’influence. Ces facteurs comprennent le choix des sites appropriés pour les interventions chirurgicales, la prise en compte du cycle des follicules pileux de souris et la compréhension des effets de la contraction de la membrane cutanée4,5. La mise en œuvre de mesures correspondantes est essentielle pour optimiser les conditions expérimentales et améliorer la précision des résultats d’observation.
Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) séquence les cellules à un niveau beaucoup plus raffiné que le séquençage de l’ARN conventionnel et a une exigence beaucoup plus élevée pour la qualité de l’échantillon avec des différences intragroupe minimes. De multiples expériences ont été menées pour affiner un modèle de défaut cutané aigu de pleine épaisseur chez la souris stable. Ces expériences ont utilisé une combinaison de méthodes établies dans la littérature et d’approches innovantes pour évaluer la cicatrisation des plaies de manière exhaustive 2,5. Pour développer le modèle de cicatrisation des plaies, l’excision cutanée de souris sur toute l’épaisseur a été utilisée pour reproduire le processus physiologique de réparation et de régénération des plaies. Son objectif était d’évaluer les altérations potentielles induites par divers traitements à l’aide du scRNA-seq. La dissociation du tissu cutané des souris pose des défis, notamment une faible viabilité cellulaire et des taux d’agrégation élevés, lors de la préparation de suspensions unicellulaires 6. Ces difficultés peuvent entraîner des problèmes tels que l’encrassement des instruments et la capture anormale des cellules, ce qui peut compromettre la qualité des données. Compte tenu du coût considérable du séquençage unicellulaire, la réalisation de plusieurs expériences préliminaires est cruciale pour garantir la stabilité et la fiabilité de la suspension unicellulaire. Cette étude a évalué l’efficacité de la dissociation enzymatique mixte et de la méthode de dissociation du kit tissulaire afin d’identifier l’approche optimale pour la dissociation tissulaire 6,7. Cette étude établit une base solide pour d’autres investigations approfondies.
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Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique du septième centre médical de l’hôpital général chinois de l’APL, en Chine. Des souris mâles C57/BL6 âgées de 6 semaines ont été utilisées.
1. Modèle de cicatrisation des plaies chez la souris
- Groupement d’animaux
- Attribuez au hasard des souris à des groupes expérimentaux et témoins (6 chacun). Abriter les souris dans un établissement d’élevage exempt d’agents pathogènes spécifiques, avec une température maintenue à 23-25 °C, un taux d’humidité de 50 à 60 % et un cycle lumière-obscurité de 12 heures.
- Fournir aux souris un accès illimité à de la nourriture standard et à de l’eau du robinet autoclave.
- Préparation préopératoire
- Retenez doucement la souris à l’aide d’une contention ou en la tenant solidement en position couchée. Chargez la seringue avec du pentobarbital sodique à 1 % rétabli à température ambiante, administrée à une dose de 0,1 mL/20 g de poids corporel.
REMARQUE : La solution de pentobarbital sodique à 1 % doit être conservée dans un environnement sombre à 4 °C. - Nettoyez l'abdomen de la souris avec des cotons-tiges imbibés d'alcool. Insérez la seringue légèrement inclinée dans l’abdomen. Aspirer avant l’injection pour éviter une administration par inadvertance dans la vessie ou les intestins. Attendez 10 min.
- Une fois que la souris cesse de se contracter et ne répond plus aux stimuli, appliquez de la vaseline blanche sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Utilisez un rasoir pour tailler la fourrure dorsale plus longue.
- Appliquez la crème dépilatoire sur le dos, attendez 2 minutes et essuyez doucement avec de la gaze humide pour éviter d'endommager la peau de la souris. Assurez-vous que la crème dépilatoire n’est pas laissée en place pendant une période prolongée.
- Désinfectez délicatement la peau environnante avec trois tampons alternés de bétadine et d’alcool à 70 %.
- Poinçon de biopsie cutanée en autoclave, ciseaux, pinces et autres instruments pour la stérilisation. Maintenez un espace de travail stérile. Effectuez une intervention chirurgicale ultérieure sur un chiffon chirurgical frais.
- Retenez doucement la souris à l’aide d’une contention ou en la tenant solidement en position couchée. Chargez la seringue avec du pentobarbital sodique à 1 % rétabli à température ambiante, administrée à une dose de 0,1 mL/20 g de poids corporel.
- Excision cutanée pleine épaisseur
REMARQUE : Le modèle d’attelle de plaie a été utilisé pour évaluer l’efficacité du traitement de la cicatrisation des plaies.- À l'aide d'un marqueur permanent, marquez la partie centrale supérieure de la région dorsale de la souris avec un cercle de 8 mm de diamètre.
- Soulevez la peau dorsale à l’aide d’une pince propre et faites la première incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins. Après la première coupe, tenez la zone de peau partiellement retirée à l’aide d’une pince et découpez soigneusement les cercles marqués.
- Utilisez un anneau en acier inoxydable conçu sur mesure (diamètre intérieur 15 mm, diamètre extérieur 18 mm). Suturez l’anneau métallique à la périphérie du site d’incision avec 5-0 sutures non résorbables, empêchant la contraction de la peau du site d’incision (Figure 1A). Utilisez de l’acier inoxydable comme matériau de l’anneau pour éviter la rouille et la déformation.
- Administrer une seule injection sous-cutanée de 0,1 mL de chlorhydrate de buprénorphine dilution à 10 % près de la plaie pour traiter la douleur post-chirurgicale.
- Réintroduisez la souris pour nettoyer les cages individuelles. Placez la souris en position couchée. Ne laissez pas la souris sans surveillance avant qu’elle n’ait repris conscience.
- Observez et photographiez la plaie de la souris tous les 2 jours pour mesurer la taille de la plaie après l’anesthésie comme décrit à l’étape 1.2.
- Marquage du tampon de la plaie pour obtenir du tissu de biopsie
- Préparez-vous à l’expérience comme décrit aux étapes 1.1 et 1.2.
- Créez des tampons personnalisés de marquage d’enroulement de souris avec un diamètre de cercle de 8 mm et une longueur de côté carré de 10 mm (Figure 1B).
- Positionnez la souris en position couchée et désinfectez la peau dorsale avec des cotons-tiges imbibés d’alcool. Trempez le tampon dans l’encre. Faites une marque sur la partie centrale supérieure du dos de la souris avec le tampon.
- Excise soigneusement toute la couche cutanée du dos le long de la marque circulaire à l’aide de ciseaux chirurgicaux, en exposant complètement la couche musculaire. Laissez la plaie ouverte sans pansement pour éviter d'interférer avec l'état de la plaie. Maintenez la stérilité de la plaie en plaçant la souris dans un environnement propre et désinfecté et en permettant à la plaie de former naturellement une croûte.
- Administrer une seule injection sous-cutanée de 0,1 mL de chlorhydrate de buprénorphine dilution à 10 % près de la plaie pour traiter la douleur post-chirurgicale.
- Réintroduisez la souris pour nettoyer les cages individuelles. Placez la souris en position couchée. Ne laissez pas la souris sans surveillance avant qu’elle n’ait repris conscience.
- Observez et photographiez la plaie de la souris tous les 2 jours pour mesurer la taille de la plaie après l’anesthésie, comme décrit à l’étape 1.2.
- Effectuer l’administration du traitement comme décrit au point 1.4
- Administration du traitement
- 4 h après que la souris a repris conscience, effectuez l’anesthésie décrite aux étapes 1.2.2-1.2.3.
- Injectez par voie sous-cutanée le traitement souhaité, ici 100 μg d’exosome dérivé de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hucMSC-Exo) dissous dans 200 μL de PBS autour du site d’incision pour le groupe de traitement.
- Injecter par voie sous-cutanée 200 μL de PBS autour du site d’incision pour le groupe témoin.
- Répétez les étapes 1.5.2 et 1.5.3 tous les deux jours pendant 14 jours maximum. Inspectez le site d’injection pour détecter tout gonflement, rougeur ou signe d’infection.
2. Préparation pour le séquençage de l’ARN unicellulaire
- Prélèvement et préparation des tissus
- Effectuez l’anesthésie comme décrit aux étapes 1.2.2-1.2.3.
- Soulevez la peau dorsale à l’aide d’une pince propre et retirez les croûtes. Coupez environ 2 cm2 de peau près de la plaie, en coupant le tissu adipeux et les gros vaisseaux sanguins.
- Transférez la biopsie cutanée à l’aide d’une pince stérile dans un puits d’une plaque à 6 puits remplie de 4 ml de PBS pré-réfrigérés.
- Lavez avec du PBS en transférant séquentiellement la biopsie dans de nouveaux puits (plaque à 6 puits) remplis de 4 ml de PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sang visible.
- Coupez la peau avec un scalpel en morceaux d’environ 2 mm, en la lavant davantage dans du DPBS contenant 0,04 % de BSA et en enlevant tous les débris.
- Dissociation enzymatique (Figure 2)
- Combinez 1 mL de collagénase I (10 mg/mL), 1 mL de collagénase IV (5 mg/mL), 1 mL de collagénase D + Dispase II (15 mg/mL), 1 mL de DNase I (5 mg/mL) et 6 mL de DPBS dans un tube conique stérile pour préparer la solution de digestion. Mélangez soigneusement les composants pour assurer l’homogénéité.
- Placez le tube conique dans un bain-marie réglé à 37 °C pendant 10 min pour préchauffer la solution de digestion.
- Ajouter 2,5 mL de solution de digestion dans le tissu et digérer à 37 °C pendant 70 min, en retournant l’éprouvette toutes les 10 min pour bien mélanger.
- Pré-mouiller une crépine de 70 μm avec tampon de lavage (0,2 % BSA dans le PBS). Transférez le mélange réactionnel, y compris les cellules dissociées et les fragments de tissu résiduels, à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL de diamètre large sur la crépine.
- Filtrez ce mélange à travers la crépine à cellules pré-mouillées de 70 μm dans un tube à centrifuger de 15 mL.
- Centrifuger le mélange réactionnel avec du tissu digéré à 300 x g, à température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et conserver la pastille (cellules) pour l’étape suivante de dissociation.
- Lyse des globules rouges
- Diluer la solution de lyse des globules rouges (10x) dans un rapport de 1:10 avec de l’eau distillée deux fois. Diluez les cellules avec 1x solution de lyse des globules rouges dans un rapport de 1:10 dans un tube conique.
- Agitez le mélange pendant 5 s, incubez à température ambiante pendant 2 min, puis centrifugez à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un volume égal de DPBS et stockez-les sur de la glace.
- filtration
- Récupérez la suspension cellulaire et filtrez-la à travers une crépine de 40 μm dans un nouveau tube conique.
- Rincer le tube 2 fois avec 4,5 mL de RPMI (10 % FCS) pour assurer la collecte des cellules restantes.
- Procéder à la centrifugation de la suspension cellulaire à 300 x g à température ambiante pendant 5 min.
- Jetez le surnageant, agitez doucement la pastille et remettez en suspension les cellules avec des pointes à large calibre dans 50 μL de BSA PBS à 0,04 %. Maintenez les cellules sur la glace tout au long de ce processus.
- Élimination des cellules mortes
- Mélangez le tampon de stock du kit d’élimination des cellules mortes 20x avec de l’eau sans nucléases dans un rapport de 1:20 pour obtenir un tampon de liaison 1x.
- Centrifuger l’échantillon à 300 x g, retirer le surnageant et ajouter 10 μL de microbilles d’élimination des cellules mortes pour 60 mg d’échantillon de peau.
- Incuber 15 min à température ambiante. Ajouter une mémoire tampon jusqu’à ce qu’elle atteigne 500 μL. Chargez l’échantillon dans la colonne préparée du kit et fixez-le au dissociateur.
- Exécutez le programme de dissociation pour séparer les cellules vivantes. Une fois le programme terminé, filtrez la suspension à travers un filtre de 30 μm et diluez-la avec du D-PBS.
de volume égal REMARQUE : Si la vitesse d’égouttement ralentit sensiblement, remplacez rapidement la colonne pour éviter que les impuretés ne bloquent les pores et n’affectent la récupération cellulaire. - Effectuez la coloration à l’orange d’âcridine/iodure de propidium (AO/PI) et le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez les critères d’acceptation suivants : viabilité cellulaire ≥ 85 %, taux d’agrégation cellulaire < 20 % et absence de globules rouges ou de fragments cellulaires visibles.
- Procédure de dissociation pour le kit de dissociation multi-tissus (Alternative)
- Mélangez 2,5 ml de RPMI 1640, 100 μL d’enzyme D, 50 μL d’enzyme R et 12,5 μL d’enzyme A1 dans un tube MACS C doux (composants du kit de dissociation multitissulaire).
- Transférez le tissu dans le tube MACS C doux contenant le mélange d’enzymes et fermez-le hermétiquement.
- Placez le tube à 37 °C dans un bain-marie pendant 90 min avec une inversion douce toutes les 10 min pour assurer une exposition adéquate des tissus à la solution de dissociation.
- Jetez la solution de dissociation et lavez les mouchoirs avec du DPBS.
- Faire passer les suspensions unicellulaires à travers des crépines de cellules de 70 μm et 40 μm de manière séquentielle et centrifuger à 4 °C pendant 10 min à 300 x g.
- Lyser les globules rouges à l’aide du réactif de lyse des globules rouges en suivant la même procédure que à l’étape 2.3.
- Éliminez les cellules mortes à l’aide du kit d’élimination des cellules mortes en suivant la même procédure qu’à l’étape 2.58.
- Effectuez la coloration AO/PI et le comptage des cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez les critères d’acceptation suivants : viabilité cellulaire ≥ 85 %, taux d’agrégation cellulaire < 20 % et absence de globules rouges ou de fragments cellulaires visibles.
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Résultats
Plusieurs variantes de la procédure ont été explorées. Les protocoles d'empreintes ont été privilégiés car ils interfèrent peu avec le processus de cicatrisation et préservent l'intégrité de la plaie en évitant des perturbations telles que les grattages ou les points de suture. Ceci permet d'éviter d'introduire du bruit au niveau cellulaire unique lors du séquençage ultérieur. Le fait de placer des plaies de chaque côté d'une souris a entraîné des différences notables de surface lésionnelle en raison de l'élasticité intr...
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Discussion
Plusieurs étapes cruciales ont été essentielles au succès du protocole. Ces étapes comprenaient une préparation précise de la zone de la plaie par un rasage et un nettoyage minutieux, la création de plaies standardisées de taille et de profondeur spécifiques, et des soins post-plaies diligents pour surveiller les infections et administrer les traitements appropriés. La normalisation de ces procédures a permis d’assurer l’uniformité dans toutes les conditions expérimentales, améliorant ainsi la fiabilité et la reproductib...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (#82373494).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 75 % Alcolchol | Liuhe | JIUJING500ML | |
| souris C57/BL6J | Charles River Laboratories | ||
| Collagenase D + Dispase II | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase I | Roche | 5349907103 | |
| Collagenase IV | Roche | 5267439001 | |
| cotons-tiges | Haishi | MIANQIAN | |
| Kit d’élimination des cellules mortes | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche 10104159001 | ||
| gentleMAC Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Fil de nylon médical | Jinlong | HM507 | |
| Kit de dissociation multi-tissus 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| poinçon aiguille de biopsie | Integra Miltex | ||
| solution de lyse des globules rouges | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Jinglu | JIANDAO | |
| Pétrolatum blanc | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
Références
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- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
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- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
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Réimpressions et autorisations
