Article de méthode

Z-Scores pour l’évaluation de la réserve ovarienne chez les jeunes patientes subissant une préservation de la fertilité

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DOI :

10.3791/66504

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25 octobre 2024

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1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode d’évaluation de la réserve ovarienne chez les patientes de moins de 25 ans qui nécessitent une préservation de la fertilité par cryoconservation du tissu ovarien. Cette méthode implique : (1) l’évaluation histologique de la réserve ovarienne dans les échantillons corticaux, (2) la comparaison avec un ensemble de données de référence, et (3) le calcul des scores Z.

Résumé

Les femmes naissent avec un pool non renouvelable de follicules ovariens, appelé réserve ovarienne. Cette réserve se compose de follicules primordiaux dans les ovaires et peut être affectée par de nombreux facteurs, tels que des troubles génétiques et endocriniens, des interventions médicales et des perturbateurs endocriniens. La préservation de la fertilité est recommandée lorsque des traitements gonadotoxiques sont nécessaires. Les options préférées des femmes sont la cryoconservation des ovocytes et des embryons. Cependant, chez les patientes très jeunes et sexuellement immatures, la cryoconservation du tissu ovarien est la seule option. Connaître la densité folliculaire des échantillons de tissus cryoconservés est essentiel dans le conseil en fertilité pour les jeunes patients. Ce protocole démontre l’utilisation des Z-scores pour la densité folliculaire corticale comme outil d’évaluation de la qualité du tissu ovarien chez les filles et les jeunes femmes âgées de 25 ans et moins qui subissent une préservation de la fertilité. La densité folliculaire dans les échantillons de patients est comparée aux étalons de référence normalisés selon l’âge, développés par Hassan et al. pour estimer les écarts possibles par rapport à l’étalon. La densité folliculaire est mesurée par quantification histologique. Pour cela, un petit morceau de tissu cortical ovarien (~2 mm x 2 mm x 2 mm) est fixé dans une solution de Bouin ou de formaldéhyde, noyé dans de la paraffine, sectionné à 4 μm d’épaisseur, coloré à l’hématoxyline et à l’éosine, et numérisé à l’aide d’un scanner de lames. Les stades folliculaires présents dans le cortex vont des follicules primordiaux aux follicules primaires. La zone corticale était à 1 mm de l’épithélium de surface sur les coupes histologiques. La densité folliculaire est calculée à l’aide d’une formule modifiée présentée par Schmidt et al., et le score Z est déterminé à l’aide de la moyenne de référence et de l’écart-type. Le score Z indique dans quelle mesure la valeur mesurée s’écarte de la moyenne de référence, déterminant la réserve ovarienne réduite (<-1,7 score Z). Avec cette méthode, les densités folliculaires peuvent être utilisées comme une mesure précieuse de la réserve ovarienne pour les jeunes patientes nécessitant une préservation de la fertilité.

Introduction

L’ovaire est un organe dynamique, actif sur le plan endocrinologique, composé d’un cortex externe et d’une moelle épinière interne. Les follicules sont répartis de manière hétérogène dans les ovaires, qui contiennent l’ovocyte gonadique entouré de cellules de la granulosa stromale1. Tous les follicules sont déjà formés au cours du développement fœtal, culminant vers 20 semaines d’âge gestationnel, suivi d’un déclin exponentiel. À la naissance, 1 à 2 millions de follicules primordiaux restent dans le cortex, et seulement quelques centaines de milliers de follicules survivent jusqu’à la puberté2. Le pool de follicules non en croissance, également appelé réserve ovarienne, influence la fertilité d’une femme, entre autres facteurs. La réserve ovarienne réside dans le cortex et se déplace dans la moelle à mesure que les follicules grandissent et mûrissent. Certains chercheurs reconnaissent que la réserve ovarienne est composée uniquement de follicules primordiaux, tandis que d’autres comprennent tous les follicules unilaminaires (c’est-à-dire primordiaux, intermédiaires et primaires)3,4,5,6. Au cours de la vie d’une femme, seuls 300 à 400 follicules mûrissent et survivent pour finalement subir l’ovulation. La ménopause commence lorsque le nombre de follicules tombe à environ un millier, ce qui se produit généralement vers 50 ans ou 7 ans. Il y a actuellement un débat en cours concernant la présence de cellules souches oogoniennes (CSO) dans les ovaires humains adultes qui peuvent former des ovocytes après une xénotransplantation. Certaines études suggèrent d’isoler des cellules qui expriment un profil génétique de cellules germinales primitives et se différencient en ovocytes 8,9, tandis que d’autres indiquent que les OSC présumés sont des cellules périvasculaires des vaisseaux sanguins 10,11,12.

L’insuffisance ovarienne prématurée (POI) se définit par l’arrêt du cycle menstruel avec une élévation du taux de FSH avant l’âge de 40 ans13. Les causes de l’IOP sont multifactorielles et peuvent survenir de manière idiopathique ; Cependant, il survient souvent à la suite de conditions médicales14. Par exemple, certaines maladies génétiques congénitales sont associées à la POI en raison d’une réserve ovarienne réduite dès la naissance, comme le syndrome de Turner15. Le POI peut également survenir en tant qu’effet secondaire des traitements gonadotoxiques, ce qui est particulièrement problématique chez les très jeunes patientes car il peut entraîner une incapacité à subir une puberté normale et altérer considérablement la réserve ovarienne. En fonction du risque de POI et de l’âge de la patiente, plusieurs options de préservation de la fertilité sont disponibles, telles que la cryoconservation d’ovocytes matures, la cryoconservation d’embryons après fécondation in vitro et la cryoconservation de tissus ovariens (OTC). Pour les patientes prépubères, l’OTC est la seule option réalisable en raison de leur immaturité sexuelle16,17. Aux États-Unis, la préservation de la fertilité par le biais d’un médicament en vente libre a récemment été considérée comme une routine clinique acceptable18. Cependant, l’OTC est encore considéré comme expérimental dans de nombreux pays européens, et une approbation éthique est requise, en particulier pour l’auto-transplantation19,20. Par conséquent, les critères d’inclusion des protocoles en vente libre doivent être soigneusement examinés et une analyse risques-avantages doit être effectuée pour chaque patient. Tous les enfants recevant des thérapies gonadotoxiques ne sont pas éligibles à la préservation de la fertilité. En Suède, il est recommandé de ne retenir que les patients présentant un risque élevé ou très élevé de subir une préservation de la fertilité conformément aux directives sur la préservation de la fertilité de la Société nordique d’hématologie et d’oncologiepédiatriques 21. Ce groupe comprend (1) les enfants prépubères et postpubères nécessitant une greffe de cellules souches ou recevant une radiothérapie avec l’ovaire dans le domaine de l’amplitude ampère, et (2) les enfants postpubères recevant de fortes doses cumulatives de chimiothérapie alkylante. Pour les filles avant la ménarche, les critères d’inclusion pour un risque très élevé d’infertilité comprennent celles traitées par l’un des éléments suivants : dose de rayonnement >10 Gy à l’ovaire, ou thérapie par cellules souches hématopoïétiques allogéniques ou autologues (GCSH). Les critères d’exclusion incluent les personnes qui ont besoin de produits sanguins supplémentaires pour d’autres préparations anticoagulantes avant la chirurgie ou qui ont un nombre de neutrophiles <1. Pour les filles et les femmes après la ménarche, les critères d’inclusion pour un risque élevé ou très élevé d’infertilité comprennent celles traitées par l’un des éléments suivants : dose de rayonnement >10 Gy à l’ovaire, ou GCSH allogénique, cyclophosphamide >9 g/m², ifosfamide >60 g/m², procarbazine ou composés nitrosourée (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Les critères d’exclusion comprennent les personnes présentant un risque accru d’hémorragie, un risque accru d’infection, un risque accru de complications chirurgicales ou un risque accru de problèmes de douleur, tel qu’évalué par le médecin responsable.

Pour les médicaments en vente libre, le tissu ovarien est prélevé lors de chirurgies abdominales par laparotomie ou laparoscopie par ovariectomie unilatérale ou biopsie. La moelle épinière est retirée du tissu ovarien collecté, et le cortex restant est ensuite sectionné en fragments plus petits pour la cryoconservation par congélation à taux contrôlé ou vitrification pour une utilisation ultérieure dans la restauration de la fertilité22. Les échantillons sont ensuite stockés dans de l’azote liquide jusqu’à ce que la patiente se remette de son traitement et souhaite fonder une famille. Selon le type de cancer et en l’absence de contre-indications à la greffe de tissu ovarien, le tissu est ensuite décongelé et auto-greffé pour restaurer la fonction hormonale et ovarienne. L’OTC s’est avéré efficace, avec un taux de grossesse de 50% et plus de 200 naissances vivantes signalées après greffe de tissu ovarien cryoconservé collecté à l’âge adulte 23,24,25. Les naissances vivantes signalées après l’auto-transplantation de tissu ovarien prélevé pendant l’enfance sont rares, et aucune n’a été signalée après l’auto-transplantation de tissu ovarien sans doute prépubère 26,27,28,29,30. La qualité des tissus est une condition préalable à la restauration réussie de la fertilité31. Par conséquent, il est essentiel d’étudier la qualité des échantillons de tissus collectés.

Actuellement, une façon d’estimer la qualité du tissu ovarien est de passer par des coupes histologiques et un comptage manuel des follicules. Cependant, il est difficile d’évaluer la normalité de la densité folliculaire en raison du déclin naturel de la réserve avec l’âge et de la distribution hétérogène des follicules. De plus, la comparaison avec les valeurs de référence est difficile car elles ne sont pas normalisées en fonction de la taille et de l’âge de la biopsie. D’autres options d’évaluation, telles que les taux sériques d’AMH ou la coloration des tissus digérés avec de la calcéine ou du rouge neutre, ne sont pas bien établies ou ont leurs propres limites. Wallace et Kelsey ont précédemment publié un modèle de réserve ovarienne normale au cours de l’âge en recueillant des données sur le nombre de follicules d’ovaires entiers de patientes sans pathologies ovariennesconnues2. De plus, comme les biopsies ne sont pas représentatives de l’ovaire entier, Schmidt et al. ont développé une méthode d’estimation du nombre total de follicules basée sur les biopsies corticales32. À l’aide d’une version modifiée de cette méthode et du modèle de réserve ovarienne normale, un ensemble de données de référence pour la densité folliculaire des femmes âgées de 0 à 25 ans a été établi33.

Cet article décrit la stratégie d’évaluation de la normalité de la densité folliculaire basée sur de petits échantillons ovariens par (1) la quantification directe des follicules à l’aide de l’histologie et (2) la comparaison des résultats avec des références standard normalisées selon l’âge via les scores Z. L’utilisation des scores Z décrit la relation entre la densité folliculaire d’une biopie ovarienne et la moyenne d’un groupe de référence normalisé selon l’âge et la taille. Cela sera d’une grande valeur pour les médecins lorsqu’ils conseillent leurs patients pour l’auto-transplantation et un traitement ultérieur après la préservation de la fertilité.

Protocole

Toutes les procédures menées ont été approuvées par l’Autorité suédoise d’examen éthique (patients Sveafertil, Dnr : 2019-03802) et par le Comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Helsinki (patients HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Des informations écrites et orales sur l’étude ont été fournies par les infirmières de recherche, et le consentement éclairé a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki. Pour les patients de moins de 18 ans, le consentement éclairé a été obtenu des tuteurs légaux. Tous les échantillons ont été pseudonymisés et traités conformément au règlement général européen sur la protection des données (RGPD). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement et traitement du tissu ovarien

REMARQUE : Identifiez tous les patients éligibles à la préservation de la fertilité lorsqu’il existe une indication d’un risque élevé ou très élevé d’infertilité conformément aux directives locales (par exemple, directives spécifiques nordiques, européennes ou internationales). En Europe, recruter des patients mineurs uniquement dans le cadre de programmes de recherche sur la préservation de la fertilité. Déterminez le risque d’infertilité en utilisant les directives de votre pays pour la préservation de la fertilité.

  1. Effectuez l’intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Administrer par voie intraveineuse du propofol (2 mg/kg), du sufentanil (0,5 microgramme/kg) et du bromure de rocuronium (0,6 mg/kg) pour l’induction de l’anesthésie.
    1. Intuber et ventiler le patient avec un volume courant de 6 à 8 mL/kg et une pression expiratoire positive de 6 à 8 cm de H2O. Administrer du sévoflurane de 1 % à 2 % par la sonde endotrachéale pour maintenir l’anesthésie par inhalation.
    2. Maintenir le bloc neuromusculaire avec du bromure de rocuronium (0,15 mg/kg) pendant l’intervention chirurgicale pour procurer une relaxation musculaire adéquate et permettre la laparoscopie à des pressions d’insufflation intra-abdominales plus basses.
    3. Utilisez l’indice bispectral pour guider la profondeur de l’anesthésique afin de faciliter un réveil rapide avec une dose d’anesthésique réduite. Antagoniser le bloc neuromusculaire résiduel avec le sugammadex (2-4 mg/kg).
  2. À l’aide d’une technique à trois ports, insérez un trocart de 10 mm dans la cavité péritonéale au niveau de l’ombilic pour introduire une lentille optique avec une caméra fixée, et deux trocarts de 5 mm dans les régions iliaques gauche et droite (2 cm au-dessus et 2 cm médial de l’épine iliaque antéro-supérieure respective) sous vision directe pour l’instrumentation chirurgicale et le prélèvement tissulaire. Inspectez les organes pelviens, y compris les deux ovaires, pour confirmer la normalité.
    1. Identifiez l’ovaire le plus facile d’accès, puis saisissez-le. Coupez un volume d’environ un tiers de l’ovaire (ou tel qu’indiqué dans votre permis éthique), puis utilisez la diathermie, si nécessaire, pour sécuriser l’hémostase.
      REMARQUE : Effectuez la biopsie uniquement s’il n’y a pas de contre-indications, telles que des facteurs de risque d’hémorragie per- ou postopératoire excessive ou un risque accru d’infection. Précisez clairement et suivez les critères d’inclusion et d’exclusion du pays. L’ovaire entier peut être prélevé si le risque d’infertilité est très élevé et/ou si le risque de couper une partie seulement est considéré comme trop élevé (par exemple, en raison d’un saignement). Évitez d’utiliser la diathermie avant de prélever l’échantillon, car elle peut endommager les tissus.
  3. Pendant votre séjour au bloc opératoire, placez le tissu dans un tube contenant 5 ml de 1 tampon phosphate salin (PBS) de Dulbecco avec du CaCl2, du MgCl2, 1 g/L de D-glucose, 36 mg/L de pyruvate, soit réchauffé à 37 °C si l’échantillon est immédiatement traité en laboratoire (dans les 30 minutes), soit maintenu à 4 °C pendant les transports plus longs (jusqu’à 24 h).
    REMARQUE : Les solutions de transport comprennent une gamme de solutions de transport/perfusion d’organes disponibles dans le commerce, ainsi que des tampons simples tels que PBS et MEM34.
  4. Coupez un petit morceau de tissu ovarien (2 mm x 2 mm x 2 mm) de la surface de l’ovaire. Cette pièce contient le cortex, qui est la partie externe de l’ovaire où se trouvent les follicules ovariens35.
    ATTENTION : Manipulez des tissus humains tels que l’ovaire en utilisant les pratiques et procédures de biosécurité de niveau 2.
    REMARQUE : Une unité spécialisée en médecine de la reproduction cryoconserve cliniquement le reste du tissu ovarien pour une utilisation future potentielle dans la restauration de la fertilité des patientes.
  5. Placez le mouchoir dans une solution de Bouin de 350 μL à température ambiante pendant 2 h ou dans 350 μL de formaldéhyde à 4 °C pendant la nuit, en veillant à ce que le tissu soit complètement immergé. Après l’incubation, lavez trois fois le tissu avec de l’éthanol à 70 %.
    1. Pour la solution de Bouin, lavez jusqu’à ce que la couleur jaune disparaisse. Incorporez le tissu dans la cire de paraffine36. Découpez un minimum de 30 coupes de tissu en série d’une épaisseur de 4 μm et placez-les sur des lames de verre.
      ATTENTION : Manipulez la solution de Bouin et le formaldéhyde à l’intérieur d’une cagoule chimique et avec un équipement de protection approprié.
      REMARQUE : Le formaldéhyde peut entraîner des artefacts liés au rétrécissement dans les tissus. La solution de Bouin est donc le choix privilégié pour la préservation de l’histologie. Cependant, la solution de Bouin comporte des risques supplémentaires, conduisant plusieurs institutions à préférer l’utilisation du formaldéhyde37.

2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

  1. Peser 5 g de poudre d’éosine Y dans un flacon en verre autoclavé de 100 ml. Ajouter 800 ml d’éthanol à 95 % et 200 ml d’eau désionisée pour obtenir une solution mère d’éosine à 0,5 %. Préparez une solution de travail à 0,25 % d’éosine en diluant 200 ml de la solution mère d’éosine à 0,5 % avec 160 ml d’éthanol à 100 %, 1 ml d’acide acétique et 40 ml d’eau désionisée.
    REMARQUE : La poudre peut ne pas se dissoudre complètement. Filtrer la solution avant utilisation pour réduire les précipités.
  2. Placez les diapositives sur des grilles. Plongez le support avec les glissières dans les récipients correspondants dans l’ordre suivant : 15 min dans du xylène, 5 min dans 100% d’éthanol, tremper 10 fois dans de l’éthanol 70%, tremper 10 fois dans de l’éthanol à 50%, puis tremper 10 fois dans de l’eau déminéralisée.
    1. Immergez le support avec les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 3 min, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau distillée du robinet pendant 30 s pour éliminer l’excès de tache d’hématoxyline.
    2. Placez le support avec les lames dans un récipient avec une solution de différenciation (1 ml de HCl à 37 % ajouté à 100 ml d’éthanol à 70 %) pendant 1 min, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau du robinet distillée pendant 30 s.
      REMARQUE : Assurez-vous que les sections de tissu sont immergées dans le liquide. Ajoutez plus de réactif dans le récipient si nécessaire. Changez le xylène toutes les 5 utilisations lorsque vous colorez de grandes quantités. Préparez de l’éthanol à 50 % en diluant 70 % d’éthanol (p. ex., ajoutez 35 ml d’éthanol à 70 % à 15 ml de DPBS pour obtenir 50 ml d’éthanol à 50 %).
      ATTENTION : Manipulez le xylène à l’intérieur d’une cagoule et avec un équipement de protection approprié.
  3. Placez le support avec les lames dans l’eau du robinet de Scott (également connue sous le nom de solution bleuissante) pendant 30 à 60 s, puis transférez le support avec les lames dans un récipient avec de l’eau du robinet distillée pendant 30 s. Plongez le support avec les lames dans la solution de travail eosin pendant 1 min.
    1. Déshydratez les lames en les plaçant dans les réactifs suivants : 100 % d’éthanol pendant 30 s, un second récipient avec 100 % d’éthanol pendant 30 s, puis trempez-les deux fois dans du xylène. Après avoir retiré la grille de la solution de xylène, laissez-la sécher dans un récipient en verre pour éviter que le xylène ne coule à l’intérieur de la hotte.
    2. Montez la glissière avec 2 gouttes de solution de montage. Placez soigneusement les glissières du couvercle pour éviter les bulles et laissez sécher la solution de montage.
      ATTENTION : Manipulez le xylène à l’intérieur d’une cagoule et avec un équipement de protection approprié.
  4. Numérisez les diapositives en les numérisant à l’aide de scanners de diapositives si possible. Si cette option n’est pas disponible, utilisez un microscope inversé ordinaire à un grossissement de 20-40x pour compter directement les follicules. Assurez-vous de prendre une image de l’ensemble de la biopsie pour faciliter la mesure de la zone dans un logiciel d’analyse d’images.

3. Comptage des follicules

  1. Si les diapositives ont été numérisées, ouvrez les fichiers à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., le logiciel libre QuPath38). S’il n’est pas numérisé, effectuez l’analyse directement à l’aide d’un microscope inversé et de son logiciel respectif.
    1. Faites glisser le fichier dans la fenêtre principale de QuPath. Définissez le type d’image sur Brightfield H&E (voir Figure 1A). Définissez à 1 mm de l’épithélium de surface (une seule couche de cellules cuboïdes tapissant la surface) à l’aide de la barre d’échelle. Cliquez sur l’outil ellipse et annotez les follicules (voir Figure 1B).
    2. Comptez le nombre de follicules dans cette zone de 1 mm, du stade primordial au stade primaire. Identifiez le stade de chaque follicule (primordial - une couche de cellules de la granulosa aplatie entourant l’ovocyte ; stade intermédiaire - un mélange de cellules de la granulosa aplatie et cuboïde ; primaire - une couche complète de cellules de la granulosa cuboïde entourant l’ovocyte).
    3. Entrez l’ID de l’échantillon, l’âge, le nombre de follicules pour chaque lame, l’épaisseur de la section et lanième section comptée dans la feuille nommée Follicule en mm3 sur le fichier Excel du calculateur de score Z du follicule (voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A).
      REMARQUE : En raison du diamètre des follicules (plus petits follicules >35 μm), le même follicule peut apparaître en sections consécutives. Faites preuve d’une prudence accrue lorsque vous comptez des sections dont la distance entre les sections est inférieure au diamètre du follicule. De préférence, comptez les follicules de toutes les 10e sections (par exemple, section #10, #20, #30). L’épithélium de surface peut se détacher pendant le traitement des tissus et ne peut être que partiellement présent dans les lames. Ne comptez que les follicules avec un cytoplasme visible. Pour le contrôle de la qualité, demandez à deux personnes de compter indépendamment les follicules et de déterminer dans quelle mesure leurs comptes s’alignent. Calculez la concordance inter-observateurs à l’aide d’une fonction de corrélation simple entre le nombre de follicules de chaque observateur pour le même échantillon.
  2. Identifiez les 10 % des follicules les plus grands dans chaque section comptée à l’aide d’un globe oculaire. Mesurez le diamètre moyen de ces ovocytes en cliquant sur l’outil de ligne , en traçant deux lignes perpendiculaires à travers la membrane de l’ovocyte et en sélectionnant Mesurer, puis Afficher les mesures d’annotation (voir Figure 1C).
    1. Enregistrez les mesures sous la colonne Longueur μm (voir Figure 1D). Entrez le diamètre moyen de tous les ovocytes dans le champ Diamètre moyen de l’ovocyte (μm) pour chaque lame dans le fichier Excel du calculateur de score z du follicule (follicule en mm3, voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A).
  3. Placez l’image au centre de l’écran dans QuPath, puis cliquez sur l’icône ImageJ . Sélectionnez Envoyer l’instantané à ImageJ (voir Figure 3A). Dans ImageJ, délimitez 1 mm de la bordure à l’aide de l’outil pinceau . Cliquez sur l’image, puis sur Type, et sélectionnez 8 bits (voir Figure 3B).
    1. Cliquez sur l’outil Ligne , tracez une ligne sur la barre d’échelle en bas à gauche de l’écran (voir Figure 3C). Cliquez sur Analyser, puis sur Définir l’échelle, saisissez la longueur indiquée dans la barre d’échelle dans le champ Distance connue, puis cliquez sur OK (voir Figure 3C). Cliquez sur Image, puis sur Ajuster, Luminosité/Contraste, puis sélectionnez Auto (voir Figure 3D).
    2. Cliquez sur Image, puis sur Ajuster, Seuil, puis sélectionnez Auto (voir Figure 3E). Cliquez sur l’outil baguette , sélectionnez la zone, puis appuyez sur Ctrl + M (voir Figure 3F). Entrez la valeur de l’aire dans le fichier Excel du calculateur de score Z du follicule (follicule en mm3, voir le fichier supplémentaire 1 et la figure 2A).

4. Calculs de la densité folliculaire, du volume cortical et du score Z

  1. Utilisez le fichier Excel de la calculatrice de score Z du follicule fourni pour effectuer automatiquement les calculs décrits ci-dessous. Les résultats apparaîtront dans la feuille « Z-score (follicule par mm³) » dans le calculateur Excel (voir le fichier supplémentaire 1), à condition que les détails indiqués au point 3 soient saisis dans la feuille « follicules en mm³ ».
  2. Pour calculer les densités folliculaires dans ces sections, utilisez la formule modifiée présentée par Schmidt et al.32. Tout d’abord, appliquez le facteur de correction α pour tenir compte du double comptage du même follicule. La formule modifiée est la suivante :
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    REMARQUE : Dans cette formule, t est l’épaisseur de la section, d est le diamètre de l’ovocyte et q est le quotient du diamètre du follicule divisé par l’épaisseur de la section.
  3. Extrapolez le nombre total de follicules (n follicules) dans le cortex à partir du nombre de follicules dans la section en utilisant la formule suivante33 :
    figure-protocol-3
    REMARQUE : Cette formule tient également compte de toutes les sections non calculées. Ici, γ représente le nombre de sections qui ne sont pas calculées (par exemple, γ = 10 si chaque 10e section est comptée), α est le facteur de correction calculé en 4.1, N est le nombre de sections comptées et n i est le nombre total de follicules dans les sections comptées.
    1. Extrapolez tout le volume cortical (V) à partir des aires comptées à l’aide de la formule suivante33 :
      figure-protocol-4
      REMARQUE : Ici, Ai est l’aire de la section et ti est l’épaisseur du tissu. Veuillez vérifier l’étape 4.2 pour les γ et N.
    2. Utilisez la formule33 suivante pour calculer la densité folliculaire :
      figure-protocol-5
  4. Déterminez s’il y a une réserve ovarienne réduite (<-1,7 Z-score) en calculant le Z-score à l’aide de la formule33 :
    figure-protocol-6
    REMARQUE : Le score Z est calculé automatiquement dans la feuille « Score Z (follicule par mm³) » de la calculatrice Excel (voir le fichier supplémentaire 1) sur la base des informations fournies à la section 3 (Comptage des follicules) (Figure 2B). Dans cette formule, Z représente le score Z, x est la densité folliculaire calculée (follicules/cm3) de l’échantillon d’étude (étape 4.4), M est la densité folliculaire moyenne du groupe d’âge respectif et SD est l’écart-type du groupe d’âge respectif. Des valeurs de référence pour les femmes âgées de 0 à 25 ans ont été établies dans Hassan et al.33. Les moyennes et les écarts-types des densités folliculaires des groupes d’âge respectifs se trouvent dans le fichier Excel du calculateur de score Z folliculaire (fichier supplémentaire 1) et sont utilisés pour le calcul du score Z.

Résultats

Les follicules ovariens sont quantifiés après une section, une coloration et un balayage réussis des lames. Les différents stades et la santé des follicules sont distingués et analysés plus en détail. La figure 4A montre une coupe transversale colorée à l’HE d’un ovaire fixé par Bouin provenant d’un adulte, avec des exemples de tissu cortical et médullaire. La figure 4B montre une image représentative de l’ovaire d’un enfant avec un exemple d’épithélium de surface. La réserve ovarienne (c’est-à-dire le pool de follicules non en croissance) et les petits follicules en croissance résident dans le cortex. À l’aide d’un microscope virtuel, les follicules sont agrandis et classifiés pour assurer l’inclusion de la réserve ovarienne uniquement. La figure 5 représente les stades des follicules trouvés et comptés dans les tissus corticaux ovariens de Bouin (figure 5A) et fixés au formaldéhyde (figure 5B) : (1) follicules primordiaux (environ 40 μm de diamètre), (2) intermédiaires et (3) primaires. Les follicules 4 à 6 sont des exemples de follicules à exclure du comptage en raison d’une incapacité à leur attribuer correctement un stade de maturation. La figure 6 présente des images représentatives des tissus corticaux ovariens avec l’absence ou un faible nombre de follicules (figure 6A) et des tissus ovariens avec un nombre moyen à élevé de follicules (figure 6B). La figure 7 présente des images représentatives de coupes de tissus à exclure en raison de la présence uniquement du tissu médullaire (figure 7A) ou de la mauvaise qualité des tissus (figure 7B). La figure 2 montre des captures d’écran du fichier Excel de la calculatrice de score Z des follicules. Les nombres calculés et les scores Z associés sont automatiquement calculés à partir des données saisies. Un score Z <1,7 indique une réserve ovarienne réduite en fonction de l’aire sous la courbe AUC-ROC (Curve Under the Curve-Receiver Operating Characteristic) des patientes atteintes du syndrome de Turner16.

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Figure 1 : captures d’écran de l’utilisation du logiciel QuPath (A) Affichage du processus d’ouverture d’un fichier image dans QuPath et définition du type d’image. (B) Annoter les follicules à l’aide de l’outil ellipse du logiciel. (C, D) Mesure du diamètre moyen des ovocytes dans les images annotées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Captures d’écran du fichier Excel de la calculatrice de score Z du follicule. (A) La feuille « Follicules en mm³ » montre les champs où les données seront saisies (cellules vertes) pour l’ID de l’échantillon, l’âge, la Nème section, le nombre final de follicules, la surface, le diamètre moyen de l’ovocyte, l’épaisseur de la section et chaque N section comptée. La densité folliculaire (follicules/mm³) est calculée automatiquement lorsque toutes les données nécessaires sont saisies ; Il reste vide si des données sont incomplètes. (B) La feuille « Z-score (Follicules par mm³) » relie les données d’ID, d’âge et de follicule/mm³ de la feuille « Follicules en mm³ » et calcule automatiquement le Z-score pour l’échantillon. Les valeurs de référence correspondantes apparaissent dans le tableau de droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Captures d’écran de l’utilisation du logiciel ImageJ. (A) Transfert d’une image de QuPath vers ImageJ. (B) Définition du type d’image dans ImageJ. (C) Établir l’échelle de mesure. (D, E) Réglage automatique de la luminosité/contraste et du seuil de l’image. (F) Mesure de la zone à l’intérieur de l’image ajustée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Images représentatives du tissu ovarien. (A) Image d’un ovaire d’un adulte subissant une chirurgie de changement de sexe. Le cortex, qui a une densité plus élevée de cellules somatiques et contient la réserve ovarienne, est visible avec le tissu médullaire, qui se caractérise par une densité plus faible et des cellules somatiques plus grandes et contient souvent plus de vaisseaux. (B) Une image d’un ovaire d’un enfant subissant une préservation de la fertilité. Le cortex est déterminé en mesurant 1 mm de l’épithélium de surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Images représentatives de follicules dans l’ovaire fixés avec différentes solutions. (A) Follicules fixés avec la solution de Bouin et (B) avec du formaldéhyde à 4% à différents stades : (1) follicule au stade primordial, (2) follicule au stade intermédiaire, (3) follicule au stade primaire. Les follicules (4) à (6) sont exclus en raison de l’absence de cytoplasme visible. Les artefacts courants dans la fixation du formaldéhyde comprennent la séparation de la membrane basale du tissu (indiquée par des flèches vertes) et des cellules de la granulosa pycnotique (indiquée par des points jaunes). Les barres d’échelle représentent 50 μm. Cette figure est adaptée de Björvang et al.39. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Images représentatives de biopsies corticales d’un ovaire d’enfant. (A) Une biopsie montrant un nombre de follicules nul à faible et (B) une biopsie montrant un nombre de follicules moyen à élevé. Les follicules sont marqués d’un astérisque (*). La ligne pointillée bleue indique 1 mm de l’épithélium de surface, tandis que la ligne noire marque l’épithélium de surface. Les barres d’échelle représentent 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Image représentative des coupes de tissus à exclure. (A) Un morceau d’ovaire où la moelle, plutôt que le cortex, a été prélevée. Cette section est caractérisée comme moelle en raison de l’absence d’épithélium de surface et de la faible densité de cellules. (B) Une coupe de tissu de mauvaise qualité, identifiée par des abrasions dans le tissu. Les barres d’échelle représentent 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Calculateur de score Z du follicule. Ce fichier facilite le calcul des Z-scores folliculaires. Il faut saisir des données (ID de l’échantillon, âge, nombre de follicules par lame, épaisseur de la section,N ème section comptée et surface) dans la feuille « Follicules en mm³ ». Le Z-score est ensuite automatiquement calculé et résumé dans la feuille « Z-Score (follicules par mm³) ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les femmes naissent avec un nombre limité d’ovocytes, qui ne peuvent pas être reconstitués. La réserve ovarienne est un déterminant clé du potentiel reproductif d’une femme. Cet article décrit une méthode de quantification histologique de la densité folliculaire et sa comparaison avec des étalons de référence à l’aide des scores Z des densités de follicules corticaux ovariens chez les patientes jeunes et les femmes jusqu’à 25 ans.

Dans ce protocole, le tissu ovarien est prélevé chez des filles et des femmes à haut ou très haut risque d’infertilité subissant une ordonnance pour la préservation de la fertilité, ou sur des patientes subissant une chirurgie de changement de sexe. Un petit morceau de tissu ovarien est utilisé pour évaluer le matériel cryoconservé. Étant donné que la réserve ovarienne varie avec l’âge, la conversion des densités folliculaires en scores Z permet une comparaison avec les valeurs de référence normalisées selon l’âge, de la naissance à la maturité sexuelle (Hassan et al.33). L’utilisation des scores Z fournit une méthode normalisée selon l’âge et indépendante de la cohorte pour estimer la normalité d’un échantillon de réserve ovarienne. Une moyenne du groupe de référence basée sur l’âge est établie, qui est ensuite utilisée pour le calcul du score Z d’un échantillon individuel. Cette approche permet d’évaluer la normalité indépendamment de la répartition par âge au sein de la population étudiée. L’évaluation normalisée selon l’âge de la réserve ovarienne permet de combiner les données de patientes ayant des antécédents génétiques similaires ou des expositions à la chimiothérapie dans différentes populations d’étude, facilitant ainsi les méta-analyses à grande échelle.

Cette méthode a des limites. Le nombre de follicules dans les tissus ovariens des patientes sans pathologie ovarienne connue est limité. Les normes de référence établies sont basées sur un petit nombre d’échantillons, en particulier si l’on considère les différents groupes d’âge, et ne s’appliquent qu’aux femmes jusqu’à 25 ans sous OTC. Par conséquent, cet outil ne s’applique pas aux femmes de plus de 25 ans. De plus, il est possible qu’un petit morceau de tissu cortical ne contienne pas de follicules, même chez les femmes en âge de procréer, en raison de la répartition inégale des follicules dans tout le cortex32. De plus, l’orientation du tissu pendant le processus d’encastrement peut obscurcir l’identification correcte du cortex. Les biopsies sont souvent très petites et la méthode de collecte des biopsies n’est pas normalisée, ce qui permet de recevoir du tissu ovarien principalement médullaire, ce qui le rendrait impropre à l’évaluation du score Z.

De plus, les études n’ont pas encore confirmé l’utilisation de la biopsie ovarienne pour diagnostiquer la fertilitérestante 40. Il est important de noter que cette méthode ne prend en compte que la densité des follicules, et non la santé des follicules. L’utilisation de tissu fixé au formaldéhyde, connu pour provoquer des artefacts tissulaires (comme le montre la figure 5B), complique la détermination de la morphologie anormale résultant d’une atrésie folliculaire ou de la procédure de fixation. Ce problème pourrait être résolu à l’avenir à l’aide de techniques d’imagerie à haute résolution sans marquage, telles que la microscopie de phase quantitative41 ou les fixateurs alternatifs37. De plus, l’ensemble du processus, de la collecte de la biopsie au comptage manuel des follicules, est invasif, long et laborieux, ce qui rend l’évaluation de la densité folliculaire par histologie peu pratique pour certains groupes de patients.

De plus, on ne sait toujours pas quels follicules sont destinés à la maturation et comment la chimiothérapie affecte la taille et la fonctionnalité de la réserve ovarienne. D’autres études utilisant cette méthode à plus grande échelle et sur une période plus longue sont nécessaires avant d’établir une corrélation avec le succès de la transplantation de tissu ovarien.

Néanmoins, cette méthode a une valeur significative à la fois dans la recherche en biologie ovarienne et dans le conseil clinique en matière de fertilité. L’utilisation des scores Z améliore l’interprétation de la réserve ovarienne d’un individu en la comparant à un étalon de référence. Cela facilite un examen complet de la taille et de la normalité de la réserve ovarienne dans différents groupes de patientes et populations étudiées. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour évaluer les associations entre la réserve ovarienne et diverses expositions, telles que les produits chimiques environnementaux ou les traitements gonadotoxiques39. Plusieurs cliniques obtiennent régulièrement de petites biopsies pour une évaluation histologique lors de la préparation des tissus pour la cryoconservation. Dans de tels cas, cette méthode pourrait s’avérer utile pour déterminer la normalité de la réserve ovarienne avant la cryoconservation. En résumé, les densités de follicules peuvent être utilisées pour estimer la taille de la réserve ovarienne au niveau de la population39, ce qui fait de cette méthode un outil précieux pour les études épidémiologiques ainsi que pour les conseils en matière de fertilité.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier les professionnels de la santé qui nous ont aidés dans le recrutement des participants et la collecte de tissus, ainsi que toutes les patientes qui ont fait don de leurs tissus ovariens. Nous remercions également le Fonds de lutte contre le cancer infantile (PR2020-0096) et le Karolinska Institutet, qui finance le doctorat KID, dont le financement a rendu ce travail possible. Nous tenons également à remercier le service d’analyse morphologique et phénotypique pour la préparation des lames histologiques. Nous remercions Nicola Byers pour la révision linguistique de ce manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x Saline tamponnée au phosphate Dulbecco’sThermo Fisher14190144
1x Saline tamponnée au phosphate avec CaCl2, MgCl2, 1 g/L de D-glucose, 36 mg/L de pyruvate  ;Thermo Fisher14287-080
37 % Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich1.09057.1000
70 % éthanolHistolabs01370.01L
95 % éthanolFisher scientific10572143
Éthanol absoluHistolabs01399.01L
La solution de BouinSigma-AldrichHT10132-1L
Eosine Y Acide libreSigma-AldrichE4009-5G  ;
FormaldéhydeThermo Fisher28908
Solution d’hématoxyline selon DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome  ;
Solution de montage Pertex  ;Histolabs00840-05
PropofolBaxter Holding B.V.N01AX10code ATC fourni à la place du numéro de catalogue
QuPath
bromure de rocuroniumnbsp ;B. Braun Melsungen AG  ;M03AC09code ATC fourni à la place du numéro de catalogue Scott’s
robinet substitut concentréSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluraneBaxter Medical AB  ;N01AB08code ATC fourni à la place du numéro de catalogue
.
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03le code ATC fourni à la place du numéro de catalogue
SugammadexBaxter Holding B.V.V03AB35code ATC fourni à la place du numéro de catalogue
SuperFrost plus blanc  ;Histolabs  ; 06400  ;
SuperFrost Plus Lames de microscope blanchesHistolabs  ; 06400  ;
XyleneSaveen Werner131769.1611
https://qupath.github.io/

Références

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