Article de méthode

Caractérisation des modulateurs des récepteurs activés par la protéase à l’aide d’un test de mobilisation du calcium à l’aide d’un lecteur de plaques

DOI :

10.3791/66507

⸱

24 mai 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole amélioré pour un test de mobilisation du calcium avec des cellules endothéliales, utilisé pour identifier les ligands des récepteurs activés par la protéase (PAR), a été développé. Le nouveau protocole réduit le temps total de dosage de 90 à 120 minutes et permet d’obtenir des courbes concentration-réponse reproductibles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les changements dans la concentration de calcium dans les cellules sont rapidement surveillés à haut débit à l’aide de colorants intracellulaires, fluorescents, liant le calcium et d’instruments d’imagerie pouvant mesurer les émissions fluorescentes d’un maximum de 1 536 puits simultanément. Cependant, ces instruments sont beaucoup plus coûteux et peuvent être difficiles à entretenir par rapport aux lecteurs de plaques largement disponibles qui scannent les puits individuellement. Il est décrit ici un test de lecteur de plaque optimisé à utiliser avec une lignée cellulaire endothéliale (EA.hy926) pour mesurer l’activation de la signalisation Gαq par le récepteur activé par la protéase (PAR) et la mobilisation ultérieure du calcium à l’aide du colorant de liaison au calcium Fluo-4. Ce test a été utilisé pour caractériser une gamme de ligands PAR, y compris les ligands anti-inflammatoires allostériques ciblant PAR1 « parmoduline » identifiés dans le laboratoire de Dockendorff. Ce protocole évite d’avoir besoin d’un manipulateur de liquide automatisé et permet le criblage à moyen débit de ligands PAR dans des plaques de 96 puits et devrait être applicable à l’étude d’autres récepteurs qui initient la mobilisation du calcium.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les récepteurs activés par la protéase (PAR)1,2,3 sont une sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A qui sont exprimés dans divers types de cellules, y compris les plaquettes et les cellules endothéliales 4,5,6,7. Contrairement à la majorité des RCPG, les PAR ont un mode d’activation intramoléculaire unique. La plupart des RCPG sont activés par des ligands solubles interagissant avec une poche de liaison distincte, mais les PAR sont activés par le clivage protéolytique de l’extrémité N-terminale, ce qui se traduit par un nouveau ligand attaché qui peut interagir avec le domaine de la boucle extracellulaire 2 à la surface d’une cellule 6,8,9. Cette interaction active le récepteur et peut initier plusieurs voies de signalisation, favorisant des effets tels que l’inflammation et l’activation plaquettaire 4,10,11,12. Différentes protéases peuvent activer les PAR par clivage à des sites uniques sur l’extrémité N-terminale, révélant différents ligands attachés (TL) qui stabilisent les conformations des récepteurs, qui initient différentes voies de signalisation 9,13,14,15. Par exemple, chez le membre le mieux étudié de la sous-famille, PAR1, le clivage par la thrombine est utilisé pour soutenir de nombreux processus biologiques, y compris l’activation plaquettaire et le recrutement des leucocytes dans l’endothélium, mais peut entraîner des effets délétères lorsque le récepteur est surexprimé ou suractivé 4,16,17,18,19,20,21 . À l’inverse, le clivage par la protéine C activée (aPC) peut favoriser les effets anti-inflammatoires et le maintien des barrières endothéliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Les PAR peuvent également être activés par des analogues peptidiques des TL de manière intermoléculaire 13,30,31. Ces peptides sont couramment utilisés pour mesurer l’inhibition (modulation) de la PAR à la place des protéases ciblant la PAR, et ils sont utilisés dans ce protocole.

De nombreux troubles sont associés à la signalisation pathologique PAR1, notamment la septicémie22,32, les maladies cardiovasculaires 33,34,35,36,37,38, les maladies rénales 39,40,41,42, la drépanocytose43, la fibrose44, l’ostéoporose et l’arthrose 45,46, neurodégénérescence 47,48,49,50,51 et cancer 52,53,54,55,56,57,58,59 . Les antagonistes de PAR1 sont étudiés depuis les années 1990 en tant qu’agents antiplaquettaires pour les maladies cardiovasculaires, et la liste croissante de maladies associées au récepteur nécessite l’identification de nouveaux ligands à utiliser comme sondes biologiques (composés outils) ou comme traitements potentiels. À l’heure actuelle, il n’existe qu’un seul antagoniste de PAR1 approuvé par la FDA, le vorapaxar, qui est utilisé pour traiter les maladies coronariennes chez les patients à haut risque 34,36,37,60. Un antagoniste alternatif de PAR1, la pepducine PZ-128, a mené à bien une étude de phase II pour prévenir la thrombose chez les patients atteints de cathétérisme cardiaque38. Le groupe Dockendorff s’est concentré sur la chimie médicinale et la pharmacologie d’une classe distincte de petites molécules, les ligands PAR1 connus sous le nom de parmodulines61,62. Contrairement aux antagonistes de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines sont des modulateurs allostériques et biaisés de PAR1 qui bloquent sélectivement la voie Gαq tout en favorisant des effets cytoprotecteurs similaires à ceux de l’aPC. Contrairement aux antagonistes orthostériques puissants de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines publiées sont également réversibles 63,64,65.

Initialement, les parmodulines ont été identifiées par Flaumenhaft et ses collègues pour leur capacité à inhiber l’expression de la P-sélectine ou la sécrétion de granules dans les plaquettes61,66. Cependant, une méthode alternative était nécessaire pour étudier les effets des parmodulines sur les cellules endothéliales. Une méthode courante pour surveiller la signalisation liée aux RCPG consiste à mesurer la mobilisation intracellulaire du Ca2+, un messager secondaire important qui peut être mesuré à l’aide d’un colorant de liaison au calcium intracellulaire approprié67,68. Des preuves substantielles ont été fournies montrant que la mobilisation du calcium induite par PAR1 se fait par l’activation de Gαq69,70. Une fois activé par son ligand attaché (ou un ligand exogène approprié), PAR1 subit un changement de conformation qui provoque le remplacement de la guanosine diphosphate (GDP) liée à la sous-unité Gαq par la guanosine triphosphate (GTP)68. La sous-unité Gαq active ensuite la phospholipase Cβ (PLC-β), qui catalyse l’hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2), formant le 1,4,5-inositol triphosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG). Enfin, l’IP3 se lie aux canaux Ca2+ sensibles à l’IP3 dans la membrane du réticulum endoplasmique, ce qui permet au Ca2+ d’être libéré dans le cytoplasme, où il peut se lier aux colorants fluorescents dépendants du Ca2+, tels que le Fluo-4, qui sont ajoutés aux cellules71. Ce processus se produit en quelques secondes et peut multiplier par 100 la concentration de Ca2+, ce qui entraîne un changement radical de la quantité de colorant lié au calcium et un signal de fluorescence robuste.

En 2018, le groupe Dockendorff a divulgué un test de mobilisation du Ca2+ à moyen débit qui pourrait être utilisé pour identifier les antagonistes de la voie Gαq de PAR172. Le test a utilisé EA.hy92673, une lignée cellulaire endothéliale humaine hybride, qui peut être utilisée pour plusieurs passages sans changement notable de l’expression de PAR1, et qui est établie pour les mesures in vitro des effets cytoprotecteurs.

Le protocole original utilisait des cellules EA.hy926 dans des plaques de 96 puits et chargées avec un colorant Fluo-4/AM, qui a été choisi en raison de sa fluorescence intense à 488 nm et de sa haute perméabilité cellulaire. Une fois le colorant chargé dans les cellules, de longues étapes de lavage ont été effectuées à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé à 8 canaux (les méthodes plus rapides de manipulation des liquides, telles qu’une laveuse à 96 canaux, étaient inaccessibles). La reproductibilité de ce test était supérieure à celle sans les changements de support robotisés minutieux et automatisés. Les antagonistes ont ensuite été incubés avec les cellules, PAR1 a été activé par l’ajout séquentiel d’un agoniste sélectif (16 puits à la fois), et les changements de fluorescence résultant de la mobilisation du calcium et de la liaison du colorant ont été mesurés pour déterminer l’activité.

Bien que ce protocole permette de mesurer la mobilisation du calcium médiée par PAR1, il est limité par le temps nécessaire pour analyser chaque plaque de 96 puits. Les longues durées d’expérience sont problématiques non seulement parce que le nombre de composés pouvant être criblés chaque jour est limité, mais aussi parce que l’efflux de colorant se produit au fil du temps, réduisant la fenêtre de test en augmentant la fluorescence basale. L’utilisation d’un manipulateur de liquide à 8 canaux pour le lavage des plaques, ce qui ajoute plus de 30 minutes à chaque expérience, contribue à la longue durée de l’expérience. Les pourboires requis sont également devenus difficiles à obtenir en raison de problèmes de chaîne d’approvisionnement. Ici, un protocole mis à jour pour le test de mobilisation du calcium médié par PAR, qui ne nécessite pas de manipulateur de liquides, et peut donc être exécuté à un débit plus élevé, est rapporté. Ce protocole devrait également convenir à la mesure de la signalisation avec d’autres RCPG qui conduisent à la mobilisation intracellulaire du calcium. Ce protocole de lecteur de plaques mis à jour est idéal pour les laboratoires universitaires et industriels qui ne disposent pas des ressources nécessaires pour des instruments d’imagerie cellulaire coûteux, mais qui ont besoin de cribler rapidement de nombreux composés. Pour un exemple d’essai de mobilisation du calcium à l’aide d’un imageur à plaque, voir Caers et al.74.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les échanges/ajouts de milieux effectués aux étapes 1 et 2 du protocole suivant sont effectués dans une hotte stérile. Sauf indication contraire, tous les articles en plastique utilisés dans la cagoule stérile doivent être achetés stérilisés et scellés ou stérilisés de manière appropriée via autoclave.

1. Initiation de la lignée cellulaire EA.hy926

  1. Acquisition de cellules EA.hy926.
  2. Stocker le(s) flacon(s) de cellules dans la phase vapeur d’un réservoir d’azote liquide.
  3. Préparez le milieu complet DMEM en réchauffant d’abord le DMEM, le FBS et le stylo/streptocoque (voir la table des matériaux pour plus de détails) dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 à 30 min. Ajouter 50 ml de FBS et 1 ml de pen/streptocoque à 500 ml de DMEM. Mélangez doucement la solution par inversion.
    REMARQUE : Un mélange trop vigoureux provoque des quantités excessives de bulles.
  4. Retirer un flacon de cellules de l’azote liquide et le réchauffer au bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
  5. Stérilisez le flacon de cellules et le flacon de milieu complet DMEM en les vaporisant d’alcool, puis passez au capot stérile.
  6. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférez soigneusement les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Ajouter 1 mL de DMEM dans le flacon à rincer et l’ajouter dans le tube à centrifuger.
  7. Fabriquer une pastille de cellules à l’aide d’une centrifugeuse (150 × g, 5 min, 22 °C). Retirer le fluide du tube de centrifugation par aspiration ; Veillez à ne pas déranger la pastille cellulaire.
  8. Ajoutez 3 ml de milieu complet DMEM dans le tube à centrifuger et décomposez doucement la pastille en mélangeant la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    REMARQUE : Il faut éviter de provoquer des bulles en mélangeant trop vigoureusement car cela pourrait activer ou endommager les cellules.
  9. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette avec des pointes de 20 μL ou 200 μL. Ajouter 10 μL du mélange suspension cellulaire/bleu de trypan dans un hémocytomètre et compter les cellules.
    REMARQUE : L’utilisation de pointes de pipette de 0,1 à 10 μL peut cisailler les cellules. Des embouts de cette taille ne doivent pas être utilisés lors de la manipulation de la suspension cellulaire.
  10. Ajoutez du milieu complet DMEM à la suspension cellulaire pour obtenir une densité de 66 000 cellules/ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ou 25 ml. Pipeter 15 mL de suspension cellulaire dans le(s) flacon(s) de culture T-75. Assurez-vous d’une dispersion égale de la suspension cellulaire en déplaçant le ballon du nord au sud et d’est en ouest.
  11. Incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (généralement après 4 à 6 jours), comme estimé par examen au microscope. À ce stade, utilisez les cellules de l’expérience (en commençant par la section 2) ou ensemencez-les dans de nouveaux flacons pour les étendre afin de préparer des stocks congelés (à une densité de semis recommandée de 1 000 000 de cellules dans 15 mL de milieu complet par fiole T-75).
    REMARQUE : Les cellules peuvent être cultivées dans les flacons de culture pendant jusqu’à 3 semaines sans différence notable de forme, de santé ou de performance dans le test. Le support complet doit être remplacé tous les 3-4 jours.

2. Ajout de cellules EA.hy926 aux plaques de 96 puits

REMARQUE : Les cellules d’un flacon de culture T-75 confluent peuvent être utilisées pour préparer deux ou trois plaques d’essai ou, éventuellement, être élargies en jusqu’à 15 fioles T-75 fraîches. Au moins cinq plaques d’essai peuvent être dépistées à l’aide du protocole des sections 4 et 5 au cours d’une journée de travail normale. Les instructions suivantes décrivent la préparation et l’analyse d’une plaque d’essai, mais des plaques supplémentaires peuvent être préparées en répétant les étapes 2.2, 2.7, 2.12 et 3.2 pour préparer le nombre souhaité de plaques d’essai. Le plus souvent, quatre plaques d’essai sont préparées par jour pour mesurer les réponses de concentration avec jusqu’à 16 composés, ce qui nécessite deux fioles T-75 avec des cellules confluentes.

  1. Milieu complet DMEM chaud dans un bain-marie à 37 °C pendant 15-30 min. Stérilisez le flacon de milieu complet DMEM en le vaporisant d’alcool, puis déplacez-le vers le capot stérile.
  2. Ajouter 100 μL d’une solution de gélatine stérilisée à 0,4 % dans tous les puits d’une plaque à paroi noire à 96 puits à fond transparent avec un couvercle. Incuber la plaque avec la solution de gélatine dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 min.
  3. Confirmez à l’aide d’un microscope inversé que les cellules d’un flacon de culture T-75 sont confluentes à 80-100 %. Retirer le milieu complet DMEM de la fiole T-75 par aspiration.
  4. Lavez les cellules dans le ballon avec 10 mL de PBS et déplacez doucement le ballon du nord vers le sud et d’est vers l’ouest. Retirer le PBS de la fiole par aspiration.
  5. Ajouter 5 mL de solution de dissociation cellulaire dans le ballon et incuber le ballon dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant ~12 min. Tapotez le ballon après 6 minutes pour faciliter la dissociation.
    REMARQUE : L’incubation de cellules pendant plus de 15 minutes avec l’agent de dissociation cellulaire référencé provoque l’agglutination des cellules, ce qui rend plus difficile l’obtention d’un numération cellulaire précise et peut interférer avec le dosage.
  6. Ajouter 5 mL du milieu complet DMEM préchauffé dans la fiole et mélanger délicatement à la solution de dissociation cellulaire/suspension cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajouter la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml. Fabriquer une pastille de cellules à l’aide d’une centrifugeuse (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Pendant la formation de la pastille, prélever la solution de gélatine de la plaque à 96 puits par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un vide. Retirez le couvercle de la plaque à partir du moment où la gélatine est retirée jusqu’à ce que la solution soit prête à être plaquée.
    REMARQUE : Une pipette multicanaux ou un collecteur stérile connecté à un vide peut être utilisé en option.
  8. Prélever le milieu du tube de centrifugation par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un vide ou d’une pipette sérologique ; Veillez à ne pas déranger la pastille cellulaire.
  9. Ajouter le milieu complet DMEM frais dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ou 10 ml. Brisez doucement la pastille cellulaire en mélangeant le milieu complet DMEM avec une pipette de 1 000 μL ou une pipette sérologique de 5 mL.
    REMARQUE : Huit millilitres de DMEM sont généralement utilisés, mais des volumes plus élevés peuvent être ajoutés pour faciliter le comptage des cellules.
  10. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette avec des pointes de 20 μL ou 200 μL. Ajouter 10 μL du mélange suspension cellulaire/bleu de trypan dans un hémocytomètre et compter les cellules.
  11. Ajoutez un milieu complet DMEM à la suspension cellulaire pour obtenir une densité de 600 000 cellules/ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ou 25 ml. Cela donnera une densité finale de 60 000 cellules/puits dans une plaque de 96 puits (déterminée comme étant la densité optimale par l’expérimentation).
    REMARQUE : Une culture cellulaire normale réussie produira entre 12 000 000 et 15 000 000 de cellules, qui peuvent ensemencer deux à trois plaques de 96 puits.
  12. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube de centrifugation et ajoutez-la dans un réservoir de pipette multicanaux de 50 ml. En mélangeant la suspension dans le réservoir toutes les 30 s en balançant doucement le réservoir d’un côté à l’autre, ajoutez 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Replacez le couvercle transparent de la plaque et secouez doucement la plaque en la faisant glisser sur la surface du capot stérile du nord au sud et d’est en ouest pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 16 à 24 h.
    REMARQUE : Une suspension cellulaire supplémentaire peut être utilisée pour préparer des plaques supplémentaires, ou les étapes 1.10-1.11 peuvent être répétées pour continuer la lignée cellulaire.

3. Préparation du test de mobilisation du calcium

  1. Préparez les réactifs de dosage.
    1. Préparez une solution de probénécide (250 mM, aqueuse) en ajoutant 36 mg de probénécide dans un tube de microcentrifugation et en la dissolvant dans 0,6 M de NaOH (500 μL). Vortex la solution.
      REMARQUE : Le probénécide améliore la rétention du colorant dans la cellule en inhibant les transporteurs d’ions organiques 75,76,77.
    2. Pour fabriquer un tampon de dosage HBSS-HEPES, ajoutez HEPES (1,19 g) dans une bouteille de 500 mL de HBSS sans Ca/Mg/rouge de phénol (pour obtenir une solution de 10 mM de HEPES). Compléter le tampon avec du MgCl2 (1 M solution aqueuse, 500 μL) et du CaCl2 (1 M solution aqueuse, 500 μL). Mélangez la solution et conservez-la au réfrigérateur à 5 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée.
      1. Pour chaque plaque à 96 puits, ajouter 50 mL du tampon de dosage HBSS-HEPES dans un tube à centrifuger de 50 mL, compléter avec 500 μL de solution de probénécide et bien mélanger. Réchauffez le tampon à température ambiante avant de l’utiliser.
    3. Préparez une solution de Pluronic F-127 à 10 % dans du DMSO en ajoutant du Pluronic F-127 (20 mg) dans un tube de microcentrifugation ou un flacon HPLC et en le dissolvant avec 200 μL de DMSO.
      REMARQUE : Cette solution peut être conservée à température ambiante et est suffisante pour environ 30 plaques. Pluronic F-127 se dissout très lentement à température ambiante et doit être chauffé doucement pour faciliter la dissolution.
    4. Préparez le tampon de chargement du colorant en ajoutant d’abord 24 μL de DMSO dans un flacon de Fluo-4/AM (50 μg) pour dissoudre le colorant. Dans un tube à centrifuger de 15 ml enveloppé d’une feuille d’aluminium, ajouter 6 ml de tampon de dosage HBSS-HEPES et compléter avec 6 μL de Pluronic F-127 à 10 % et 6 μL de solution Fluo-4/AM. Agitez brièvement la solution et laissez-la reposer à température ambiante, à l’abri de la lumière, pendant 10 min.
      REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment de Fluo-4, gardez le colorant à l’abri de la lumière en enroulant une feuille d’aluminium autour du tube de centrifugation contenant la solution de colorant et le couvercle de la plaque de test.
  2. Préparer les plaques d’essai.
    1. Retirez la plaque de dosage de l’incubateur et confirmez la confluence à l’aide d’un microscope inversé. Retirez manuellement le support DMEM complet en le plongeant dans un évier et en épongeant le dessus de la plaque avec une serviette en papier.
      REMARQUE : Le fluide est suffisamment retiré en tenant la plaque horizontalement et en la frappant, puis en tournant la plaque à 180° et en répétant.
    2. Ajouter le tampon de dosage HBSS-HEPES et la solution de probénécide dans un réservoir de solvant pour pipette multicanaux de 50 ml.
      REMARQUE : Cette solution sera utilisée pour les étapes de lavage ultérieures et doit être mise de côté et recouverte de papier d’aluminium jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    3. Ajouter 100 μL du tampon de dosage HBSS-HEPES et de la solution de probénécide dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux et laisser les cellules reposer en présence de probénécide pendant 5 min. Retirez le tampon de dosage HBSS-HEPES en le glissant dans l’évier de la même manière qu’à l’étape 3.2.1.
    4. Ajouter le tampon de chargement du colorant dans un réservoir de solvant de pipette multicanaux séparé de 50 ml. Ajouter 50 μL de tampon de chargement de colorant dans chaque puits de la plaque d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque pendant 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Pendant que la plaque est dans l’incubateur, préparez les solutions agonistes/antagonistes.
      1. Les solutions antagonistes sont stockées sous forme de solutions de 31,6 mM dans le DMSO. Dans un tube PCR, diluer 2 μL de la solution mère avec 38 μL de BSA à 0,1 %/eau pour obtenir une solution de 1,58 mM. 2 μL de cette solution donneront une concentration finale de 31,6 μM dans la plaque de dosage. Diluer 4 μL de la solution d’antagoniste de 1,58 mM avec 36 μL de DMSO à 5 %/eau (sans ajout de BSA), et préparer les concentrations restantes par dilutions en série.
      2. Préparer une solution de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 dans un tampon de dosage HBSS-HEPES, ce qui donnera une concentration finale de 6,5 μM lorsque 6 μL sont ajoutés à chaque puits de la plaque de dosage. Par exemple, dissoudre une aliquote de 2 mg de TFLLRN-NH2 avec 5,244 mL de tampon de dosage HBSS-HEPES pour obtenir une solution mère de 0,5 mM. Mélanger 1,083 mL de cette solution avec 3,917 mL de tampon de dosage HBSS-HEPES pour obtenir une solution de 108,3 μM.
        REMARQUE : Les solutions TFLLRN-NH2 doivent être conservées dans un congélateur à -20 °C lorsqu’elles ne sont pas utilisées.
    6. Retirez la plaque de l’incubateur et assurez-vous de l’absorption du colorant à l’aide d’un microscope à fluorescence à un réglage approprié (généralement pour les protéines fluorescentes vertes, voir la figure 1 pour un exemple de Fluo-4 chargé avec succès dans les cellules). Retirez le tampon de chargement du colorant en agitant la plaque de la même manière qu’à l’étape 3.2.1.
    7. Lavez les cellules 2 fois avec 50 μL de tampon de dosage HBSS-HEPES et de solution de probénécide (à partir de l’étape 3.2.3) dans chaque puits (retirer en jetant le milieu dans l’évier).
    8. Ajoutez 92 μL de tampon de dosage HBSS-HEPES dans chaque puits et observez à nouveau les cellules avec un microscope à fluorescence pour vous assurer que l’excès de colorant a été complètement éliminé et que les cellules restent adhérentes.
    9. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 2 μL de solutions antagonistes et de véhicule aux puits appropriés (voir le tableau 1 pour une carte représentative des plaques).

4. Réalisation du test de mobilisation du calcium

  1. Réglez le lecteur de plaques comme suit : température : 37 °C ; longueur d’onde d’excitation : 485 nm ; longueur d’onde d’émission : 525 nm ; Hauteur de mesure : 7,8 mm (optimisée) ; nombre de clignotements : 100 ; Nombre de répétitions : 20.
  2. Incuber la plaque pendant 15 min dans le lecteur de plaques à 37 °C. Mesurez la fluorescence de fond dans les colonnes 1 et 2 (cinq balayages par puits).
  3. Éjectez la plaque du lecteur de plaques et ajoutez rapidement 6 μL de solution agoniste dans chaque puits des colonnes 1 et 2 à partir d’une bandelette PCR à 8 tubes à l’aide d’une pipette multicanaux.
    REMARQUE : Pour cette étape, nous utilisons une pipette électronique à 8 canaux avec des pointes de pipette de 0,1 à 10 μL.
  4. Mesurez le changement de fluorescence lorsque la mobilisation du calcium se produit dans les cellules. Effectuez 20 balayages de chaque puits selon les paramètres ci-dessus.
    REMARQUE : Le balayage de chaque puits en deux colonnes 20x chacune prend environ 5 min (c’est-à-dire ~15 s entre les balayages de chaque puits).
  5. Répétez les étapes 4.2 à 4.4 pour les colonnes 3 à 12 par incréments de deux colonnes.

5. Analyse des données

  1. Exportez les données du test sous forme de feuilles de calcul distinctes pour chaque groupe à deux colonnes.
  2. Trouvez la moyenne des lectures de fluorescence basale à l’aide de la fonction AVG (premier balayage : dernier balayage). Faites cela pour chaque puits dans les deux colonnes.
  3. Trouvez la fluorescence maximale après l’ajout d’agoniste en utilisant la fonction MAX (premier balayage : dernier balayage).
  4. Calculez la variation de fluorescence en soustrayant la fluorescence basale de la fluorescence maximale.
  5. Soustrayez la variation de fluorescence calculée pour le témoin négatif (ajout du véhicule sans agoniste) de chaque puits de la même colonne.
  6. Déterminez la variation relative (normalisée) de la fluorescence en divisant la variation de la fluorescence dans chaque puits par la variation de la fluorescence dans le véhicule (0,1 % DMSO/eau) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 puits.
  7. Copiez les valeurs non contrôlées, sous forme de pourcentages, dans un logiciel de statistiques et de graphiques. Si vous utilisez le logiciel référencé, choisissez l’option de table XY, avec les nombres choisis comme axe X et répliquez les valeurs dans des sous-colonnes côte à côte comme axe Y.
  8. Utilisez le programme pour tracer des courbes concentration-réponse (CRC) à partir des données. Si vous utilisez le logiciel référencé, choisissez l’option log(inhibiteur) vs. réponse - Pente variable (quatre paramètres).

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but de ce test est généralement de produire des courbes concentration-réponse (CRC) pour trois à quatre nouvelles parmodulines. Sur chaque plaque d’essai, un CRC supplémentaire pour un composé connu, tel que NRD-21, est souvent généré qui sert de contrôle de qualité pour l’expérience en raison de son IC50 connu. Pour générer des CRC, il faut prévoir une carte de plaque telle que celle illustrée dans le tableau 1 . Si l’on souhaite plutôt des réponses de concentration ponctuelles, des composés à des concentrations finales de 10 μM (ou à d’autres concentrations préférées) doivent être ajoutés à au moins trois puits.

Lors de l’exécution du test, il devrait y avoir une augmentation rapide de la fluorescence (l’augmentation devrait commencer dans les 3-4 premiers balayages) affichée par le lecteur de plaques (voir la figure 2A pour un exemple de sortie par rapport à la sortie échouée de la figure 2B). Il est important de noter que l’agoniste doit être ajouté rapidement (dans les 15 s) pour que le lecteur de plaques puisse capturer avec précision l’augmentation de la fluorescence. Dans une expérience de travail, le signal de fluorescence pour le puits du véhicule doit rester plat, tandis que le signal de fluorescence dans les puits de contrôle positif (véhicule + 6,5 μM TFLLRN-NH2) doit commencer à augmenter après trois ou quatre balayages. Une fois la valeur maximale atteinte (après ~10 balayages), le signal de fluorescence devrait commencer à diminuer lentement. Dans les expériences avec des antagonistes très efficaces, les puits avec les concentrations les plus élevées d’antagonistes devraient avoir un signal qui reste relativement plat, similaire au contrôle négatif. Il devrait également y avoir peu de différence entre le signal des puits témoins positifs et ceux avec de faibles concentrations de l’antagoniste (Figure 2C). Si les concentrations les plus faibles d’antagoniste inhibent toujours la mobilisation du calcium, les concentrations dépistées doivent être ajustées pour inclure des concentrations plus faibles. Les CRC générés doivent avoir au moins un point de données ~100% pour montrer pleinement la nature sigmoïdale de la courbe.

Le signe le plus courant qu’une expérience n’a pas fonctionné est si le puits de contrôle positif (véhicule + 6,5 μM TFLLRN-NH2) ne montre pas une forte augmentation de la fluorescence (Figure 2B). Cela peut se produire pour diverses raisons : le nombre de cellules peut être faible (si la confluence n’a pas été confirmée), la solution agoniste peut être compromise ou des quantités insuffisantes de colorant peuvent avoir été absorbées par les cellules. Il est également possible de ne pas ajouter par erreur d’agoniste à certains puits.

Avec une méthode programmée, les données sont affichées sous la forme de six feuilles de calcul distinctes, chacune contenant des données pour deux colonnes. Les cinq balayages de la fluorescence basale sont dans leur propre rangée, les 20 balayages pris après l’ajout de l’agoniste dans la rangée immédiatement en dessous (voir la figure 3 pour une sortie représentative). Pour un exemple de calcul, une colonne d’une expérience utilisant NRD-21 sera utilisée. Dans le fichier exporté (Figure 3), la fluorescence basale de chaque puits est transmise dans les colonnes C à G, et les données postérieures à l’ajout de l’agoniste (les 20 balayages suivants) sont transmises aux colonnes C à V de la ligne suivante. Les rangées 14 à 17 du fichier contiennent le contrôle positif de deux colonnes distinctes. La moyenne de la rangée basale de l’un des puits de contrôle positif a été calculée à l’aide de la commande « =AVERAGE(C16 :G16) », ce qui a donné une valeur de 1 039,8. Cette commande a été répétée pour les mesures basales supplémentaires dans chaque puits. Le maximum des balayages expérimentaux a été calculé à l’aide de la commande « =MAX(C16 :V16) », ce qui a donné une valeur de 2 629. Encore une fois, l’ordre a été répété pour tous les puits. La fluorescence basale de chaque puits a ensuite été soustraite de la valeur maximale. Dans cette expérience, les données ont été normalisées en soustrayant la variation de la fluorescence dans le contrôle négatif de chaque puits (qui était de 142,6 dans la colonne d’exemple). Ces valeurs ont ensuite été divisées par la valeur calculée de manière similaire du témoin positif. Dans cette colonne, la valeur maximale était de 2 629, la mesure basale moyenne était de 1 039,8 et la valeur soustraite pour le blanc était de 142,6. La valeur de contrôle positif ajustée est donc de 1 446,6 (calculée à partir de l’équation). Cette équation est répétée pour chaque puits de la colonne, et les valeurs calculées sont divisées par 1 446,6 pour obtenir leur variation relative de fluorescence. Les ratios ont ensuite été convertis en pourcentages et copiés dans le logiciel analytique. Ce processus a été répété pour les 11 autres colonnes.

Pour traiter les données à l’aide du logiciel référencé, une table XY doit être sélectionnée avec la possibilité d’avoir trois mesures répétées dans des colonnes côte à côte. Les valeurs logarithmiques de chaque concentration doivent être saisies dans les valeurs x, et les pourcentages calculés doivent être ajoutés aux valeurs y. Une analyse de régression non linéaire doit être effectuée sur les données, ce qui entraîne la production de quatre courbes concentration-réponse. Le programme produit également des valeurs IC50 , des statistiques d’erreur quantifiées et des statistiques sur la qualité de l’ajustement.

figure-results-1
Figure 1 : Fluo-4/AM chargé dans les cellules EA.hy926. Fluo-4 chargé sélectivement dans les cellules EA.hy926, après les étapes d’incubation et de lavage du colorant. Toute la fluorescence se fait à l’intérieur des cellules, sans fuite de colorant. Image obtenue à l’aide du réglage GTP sur un imageur à cellule EVOS et d’un grossissement de 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Sortie potentielle du test. (A) Sortie représentative du lecteur de plaque d’un test en fonctionnement. La rangée A est le témoin négatif et n’a pas de changement de fluorescence. La rangée B est le témoin positif et montre une augmentation rapide de la fluorescence. Les rangées C-H sont les puits expérimentaux, avec les concentrations les plus élevées de parmoduline plus basses dans la plaque. (B) Exemple de résultat d’une expérience qui a échoué. Aucune augmentation de la fluorescence n’est observée dans la rangée B, qui est le témoin positif. (C) Changement de fluorescence au fil du temps induit par l’agoniste de PAR1 TFLLRN-NH2. Le balayage de deux colonnes d’une plaque à 96 puits à l’aide des paramètres fournis prend ~5 min. sur le lecteur de plaques PerkinElmer EnSpire (c’est-à-dire ~15 s entre les balayages de chaque puits). Différentes solutions NRD-21 sont indiquées : « Agonist » est de 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Exemple de sortie Excel pour un test fonctionnel. La fluorescence basale est émise en rangées paires à partir de la rangée 10, et le résultat des 10 premiers balayages après l’ajout d’agonistes est affiché dans les rangées impaires suivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Manipulation robotisée des liquides par rapport au « flicking ». Le pré-revêtement des plaques d’essai avec de la gélatine et l’échange manuel de milieux en feuilletant la plaque et en la séchant par transfert produisent des courbes concentration-réponse avec une variabilité plus faible. (A) Courbes concentration-réponse des parmodulines ML161 et NRD-21 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manipulation automatisée des liquides). (B) Courbes concentration-réponse des parmodulines ML161 et NRD-21 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (plaques revêtues de gélatine, agitées). Les données sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Etudes de température. La réalisation du test à 37 °C génère des données plus reproductibles qu’à température ambiante. (A) Courbes concentration-réponse de ML161 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (température ambiante). (B) Courbes concentration-réponse de ML161 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Les données sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Études de densité cellulaire. La densité cellulaire optimale est de 60 000 cellules/puits lors de l’ensemencement de 16 à 24 heures avant le début d’un essai. (A) Courbes concentration-réponse de TFLLRN-NH2 à différentes densités cellulaires, n = 3. (B) Courbe concentration-réponse de TFLLRN-NH2 à la densité cellulaire optimale de 60 000 cellules/puits. Les données sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 7 : Volume d’analyse. L’utilisation d’un volume d’essai de 100 μL génère des courbes concentration-réponse plus reproductibles que les essais utilisant un volume final de 200 μL. (A) Courbes de concentration-réponse de ML161 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 200 μL). (B) Courbes concentration-réponse de ML161 et 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume final de 100 μL). Les données sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-8
Figure 8 : Génération des facteurs Z' pour déterminer la capacité du test à détecter un composé de choc. Réponses de mobilisation calcique avec 6,5 μM TFLLRN-NH2 (colonne B) plus des antagonistes PAR1 facultatifs 10 μM NRD-21 (colonne C) ou 0,316 μM vorapaxar (colonne D). (A) Le dosage est terminé 16 h après l’ensemencement cellulaire. (B) L’essai a été effectué 24 h après l’ensemencement cellulaire. (C) Tableau des facteurs Z' calculés à l’aide de l’équation suivante : figure-results-9, où σp est l’écart-type du témoin positif, σn est l’écart-type du témoin négatif ou de l’échantillon, μp est la moyenne du témoin positif et μn est la moyenne du témoin négatif ou de l’échantillon. Chaque valeur est calculée en désignant le véhicule + 6,5 μM TFLLRN-NH2 comme témoin positif et en comparant à la condition indiquée comme témoin négatif (véhicule) ou échantillon (NRD-21 et vorapaxar). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-10
Figure 9 : Mobilisation du calcium à partir d’un agoniste du PAR2. Changement de fluorescence au fil du temps induit par 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Les données sont des moyens ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Exemple de carte de plaque à 96 puits pour le criblage composé. Chaque concentration est mesurée en trois exemplaires. La rangée A contient des témoins négatifs (aucun antagoniste, aucun agoniste) et la rangée B contient des témoins positifs (aucun antagoniste, agoniste). Les colonnes 1 à 3 contiennent six concentrations d’un demi-log de la parmoduline NRD-21 qui peuvent être utilisées en option pour le contrôle de la qualité. PM-A, PM-B, PM-C sont des parmodulines sans nom. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Comparaison entre le protocole précédemment publié et le nouveau protocole optimisé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alors que le protocole72 précédemment rapporté était généralement fiable et nous a permis d’identifier une nouvelle parmoduline de plomb, NRD-21,62 un protocole plus efficace était souhaité. Le test a été encore compromis pendant la pénurie d’approvisionnement causée par la pandémie de COVID-19. Il est devenu difficile d’obtenir des embouts pour le manipulateur automatisé de liquides, et tenter de laver, de stériliser et de réutiliser les embouts a produit des CRC avec des variations significatives. Cela a facilité une série d’expériences urgentes conçues pour rationaliser un test amélioré de mobilisation du calcium piloté par PAR.

L’identification d’une alternative valable à l’utilisation du manipulateur de liquide automatisé pour les étapes de lavage était la principale priorité de cette étude. Lors du développement précédent des tests, l’utilisation du manipulateur de liquide robotisé a permis de réduire les erreurs causées par les échanges manuels de supports. Cependant, cela a ajouté beaucoup de temps à l’essai, car les échanges de médias avec le manipulateur de liquide à 8 canaux ont augmenté le temps total de chaque plaque d’essai de 30 à 45 minutes. Bien qu’une méthode d’échange de milieu par effleurement ait été testée auparavant, ces expériences ont été réalisées sans recouvrir les plaques de dosage de gélatine avant l’ensemencement cellulaire. En prétraitant les plaques avec de la gélatine, les cellules ont été assurées de rester en place quelle que soit la force utilisée pour retirer manuellement le support. Les CRC générées dans un essai à l’aide de plaques recouvertes de gélatine et déviées avaient de meilleurs scores de qualité de l’ajustement et des barres d’erreur plus petites à plusieurs points de données que les courbes où le manipulateur de liquide automatisé était utilisé (Figure 4). Les valeurs d’erreur quadratique moyenne (EQM) pour la plaque utilisant le manipulateur de liquide automatisé étaient de 9,687 pour la courbe ML161 et de 10,690 pour la courbe NRD-21, tandis que les valeurs RMSE pour la plaque utilisant de la gélatine et un échange manuel de support étaient de 7,658 pour la courbe ML161 et de 6,408 pour la courbe NRD-21. Des valeurs RMSE plus faibles indiquent une courbe qui s’adapte mieux aux données données. Ce changement réduit également considérablement le temps total de test. Alternativement, un laveur de plaques automatisé multicanal peut être utilisé.

La méthode d’addition d’agonistes a été un facteur supplémentaire qui a été étudié. Cela a été fait pour déterminer si l’agoniste pouvait être ajouté simultanément à tous les puits de plaque, suivi d’un balayage de la plaque entière à la fois ; Cela éliminerait la nécessité pour les chercheurs de rester près du lecteur de plaques pendant toute la durée du test sensible au temps pour de nombreux ajouts d’agonistes distincts, ce qui pourrait augmenter considérablement le débit. Malheureusement, l’ajout d’agoniste à tous les puits et le balayage de la plaque entière ont été problématiques, car la réponse est trop rapide pour mesurer de manière fiable la concentration maximale transitoire de calcium dans chaque puits, ce qui donne des CRC très variables. La réduction du nombre de colonnes balayées de 12 à 6 a légèrement amélioré les résultats, mais les meilleurs résultats ont été générés en scannant seulement deux colonnes (16 puits) à la fois. On pourrait émettre l’hypothèse que la réduction de la température du test de 37 °C à la température ambiante pourrait ralentir suffisamment le changement de concentration en calcium pour permettre des mesures fiables. Bien que plusieurs protocoles de mobilisation du calcium avec différents colorants ou lignées cellulaires aient été validés à température ambiante78,79, dans ce test spécifique, des résultats améliorés sont observés à 37 °C. Les courbes concentration-réponse des antagonistes mesurées à température ambiante (~23 °C) n’étaient pas aussi uniformes qu’à 37 °C (figure 5A par rapport à la figure 5B). En raison de ces résultats, il a été déterminé que le balayage de deux colonnes à la fois à 37 °C est optimal.

Une autre variable qui a été examinée pour réduire le temps d’essai était le temps d’incubation de l’antagoniste. Dans le protocole précédent, les antagonistes ont été incubés pendant 40 minutes avant l’ajout d’agonistes, mais il a été déterminé ici que 15 minutes sont suffisantes pour que les parmodulines interagissent avec PAR1. Cela a été testé en ajoutant des solutions de parmoduline à plusieurs colonnes en même temps, puis en ajoutant un agoniste à différents points temporels (l’agoniste a été ajouté à t = 15 min, 30 min et 45 min). L’activité des parmodulines a été conservée, mais pas améliorée, en incubant les antagonistes plus longtemps. À la suite de cette découverte, dans le nouveau protocole, des solutions antagonistes sont ajoutées à l’ensemble de la plaque en une seule fois, et des solutions agonistes sont ajoutées aux premières colonnes après une incubation de 15 min. Ce changement réduit encore la durée totale de l’expérience de 30 min. Il convient de noter que les antagonistes à cinétique de liaison lente, tels que le vorapaxar, peuvent nécessiter des temps d’incubation plus longs80,81.

Bien que la réduction du temps d’analyse et l’élimination de la dépendance à l’égard du manipulateur de liquide aient été les principaux facteurs nécessitant une mise à jour du protocole d’analyse, une autre méthode de culture cellulaire a également été testée. Auparavant, les plaques étaient ensemencées avec des cellules directement à partir de stocks congelés et laissées croître dans les plaques pendant 40 à 48 heures après l’ensemencement. Cependant, le temps prolongé entre l’ensemencement des plaques et la réalisation des tests a limité le nombre d’expériences pouvant être réalisées chaque semaine. L’utilisation de cellules cultivées dans des flacons de culture réduit considérablement ce temps. Les cellules ont été cultivées dans des flacons T-75 traités pour culture tissulaire et ont été retirées de la surface du ballon à l’aide d’un agent de dissociation cellulaire non enzymatique. Cela peut être important pour éviter d’endommager certains récepteurs de surface cellulaire, en particulier PAR2, avec la trypsine. Une fois ajoutées à la plaque de test, les cellules ont besoin de suffisamment de temps pour se déposer et coller à la gélatine. Étant donné que la méthode de retrait du support par effleurement peut également déplacer les cellules, il faut suffisamment de temps pour permettre aux cellules de s’incruster dans la gélatine. Une expérience permettant aux cellules de se stabiliser pendant deux heures a provoqué une perte importante de cellules, entraînant un test inutilisable (données non présentées). Les temps de décantation entre 2 h et 12 h limitent le nombre de plaques pouvant être analysées en une seule journée, de sorte qu’une incubation plus longue pendant la nuit est préférable. Il a été constaté que l’incubation des cellules nouvellement cultivées entre 16 h et 24 h permettait aux cellules d’adhérer complètement à la gélatine, et des données reproductibles peuvent être obtenues.

Le passage de cellules congelées à des cellules cultivées en flacon de culture a également modifié la densité optimale d’ensemencement cellulaire. Comme on pouvait s’y attendre, l’ensemencement des puits à la densité de 25 000 cellules/puits qui était standard dans le protocole précédent n’a pas permis aux cellules d’atteindre la confluence avec un temps d’incubation plus court. Des CRC agonistes ont été générés avec huit densités cellulaires distinctes pour déterminer les conditions optimales (Figure 6). Auparavant, TFLLRN-NH2 était utilisé comme agoniste de PAR1 à 5 μM, car cela permettait un antagonisme raisonnable avec des parmodulines de solubilité plus faible. Il n’y a pas de différence significative dans le bruit de fond ou le signal maximal lors de l’ensemencement avec 45 000-65 000 cellules/puits, mais il y a une diminution de la variabilité avec 5 μM TFLLRN-NH2 lors de l’ajout de 60 000 cellules/puits. Il est intéressant de noter qu’il n’y a pas d’augmentation significative de la fluorescence maximale avec un nombre plus élevé de cellules, de sorte que 60 000 cellules/puits ont été choisies comme densité optimale en raison de la variabilité réduite. Les CRC agonistes ont également produit une EC50 de 6,5 μM pour TFLLRN-NH2, de sorte que celle-ci a été choisie comme nouvelle concentration standard d’agonistes.

Un autre facteur analysé était les volumes utilisés dans le dosage. Dans le protocole précédent, 2 μL d’agoniste étaient ajoutés à chaque puits pour donner un volume d’analyse final de 200 μL. On a émis l’hypothèse que l’ajout de volumes plus élevés de solution agoniste, mais en maintenant la concentration finale constante, pourrait aider au mélange, provoquant un signal plus rapide et plus fiable. Pour tester cette hypothèse, on a comparé l’addition de 2 μL, 6 μL et 10 μL TFLLRN-NH2 dans 100 μL ou 200 μL d’HEPES-HBSS dans une plaque d’essai contenant différentes concentrations de NRD-21. Les CRC de NRD-21 de chaque condition ont été générés afin de déterminer quelle combinaison de volume d’agoniste et de volume d’essai final a donné les données les plus cohérentes. Bien que les ajouts de 2 μL et de 6 μL aient donné lieu à des CCR générés avec peu de variabilité, il n’en va pas de même pour les courbes produites par l’ajout de 10 μL TFLLRN-NH2 (données non présentées) ; les augmentations de fluorescence n’étaient pas constantes dans ces puits, que ce soit en magnitude ou en moment, ce qui produit des CRC qui devraient être identiques, mais qui sont au contraire radicalement différents. Bien que les ajouts de 2 μL et 6 μL aient produit des résultats similaires, le changement de fluorescence s’est produit beaucoup plus rapidement avec l’ajout de 6 μL de TFLLRN-NH2, ce qui a permis de réduire de moitié le nombre total de balayages dans chaque puits, passant de 40 à 20 balayages. Il a également été déterminé que l’utilisation d’un volume final de 100 μL produit des CRC plus uniformes par rapport à ceux générés avec un volume final de 200 μL (figure 7).

Pour déterminer si le nouveau protocole convient à des tests à haut débit, les facteurs Z' pour le test ont été calculés (Figure 8). Le facteur Z est une méthode statistique qui mesure la qualité d’un test de dépistage et détermine si un test permet de différencier de manière fiable les composés actifs et inactifs82. Les facteurs Z' ont été calculés pour des dosages effectués entre 16 et 24 h après l’ensemencement des plaques, et à différents passages cellulaires. Dans tous les cas, tant pour les modes agoniste seul que pour les modes agoniste plus antagoniste, les facteurs Z' calculés étaient supérieurs à 0,5, ce qui indique un excellent test82. Les facteurs Z calculés étaient également similaires à ceux calculés pour l’essai précédent, ce qui indique que les modifications apportées au protocole pour produire un essai plus rapide n’ont pas eu d’impact négatif sur la qualité.

Le protocole de mobilisation du calcium induite par PAR a été mis à jour grâce à des expériences générant des valeurs IC50 à partir de CRC, mais le test peut également être utilisé pour mesurer l’efficacité des antagonistes de PAR1 à des concentrations uniques. Le test peut également être utilisé pour mesurer l’activité des ligands PAR2 ; par exemple, l’agoniste PAR2 SLIGKV-NH2 peut remplacer TFLLRN-NH2 dans le protocole mis à jour (Figure 9) ; le protocole précédent était également utilisé avec les agonistes et les antagonistes de PAR283. Bien qu’il n’ait pas été explicitement testé ici, ce protocole devrait également être applicable aux cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), qui ont été utilisées avec le protocole précédent, et potentiellement à d’autres lignées cellulaires adhérentes. Une limitation à l’utilisation d’un lecteur de plaques de balayage avec des protocoles tels que celui-ci est qu’ils ne sont pas adaptés à l’étude de réponses rapides (inférieures à la seconde), du moins pas en parallèle comme c’est possible avec un imageur de plaques.

En conclusion, nous présentons ici un protocole plus rapide et plus simple pour le test de mobilisation du calcium endothélial piloté par PAR à l’aide d’un lecteur de plaques. En éliminant la nécessité d’un manipulateur de liquide automatisé, en réduisant le temps d’incubation des antagonistes et en diminuant le nombre de balayages pour chaque puits, la durée totale de l’essai a été réduite d’au moins 90 à 120 minutes et les coûts d’analyse ont été réduits (pour une comparaison entre les protocoles précédemment signalés et actuels, voir le tableau 2). Cela permettra non seulement de cribler plus de composés chaque jour, mais aussi d’éliminer le risque d’une fenêtre de dosage réduite due à l’efflux de colorants, ce qui pourrait conduire à des résultats peu fiables. Le test nouvellement optimisé permet un criblage plus rapide dans les cellules endothéliales des ligands PAR1 ou PAR2, ou potentiellement d’autres ligands GPCR qui activent la mobilisation intracellulaire du calcium, dans des laboratoires limités à l’utilisation de lecteurs de plaques.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. est l’inventeur de brevets impliquant des parmodulines et est le fondateur et l’actionnaire de Function Therapeutics, Inc., qui développe des parmodulines à des fins cliniques.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Irene Hernandez, Trudy Holyst, le Dr Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) et le Dr Leggy Arnold (Université du Wisconsin-Milwaukee) pour avoir fourni de l’espace et un soutien indirect à ce projet, ainsi que le Dr John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pour ses conseils pertinents. Nous remercions le National Heart, Lung, and Blood Institute (R15HL127636), le Département de la Défense des États-Unis (W81XWH22101) et la National Science Foundation (2223225) pour leur subvention.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
culture cellulaire forts
Adherent EA.hy926 cellulesATCCCRL-2922
CellStripper réactif de dissociation cellulaireCorning25-056-CILa trypsine peut être utilisée en option, mais doit absolument être évitée avec les dosages PAR2.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovin Serum (FBS)Avantor97068-091
Gélatine de peau porcineMilliporeSigmaG2500À utiliser pour faire une solution aqueuse à 0,4 % (p/v) avec de l’eau déminéralisée. Autoclave avant utilisation pour stériliser.
Stylo/streptocoque (100X)Corning30-002-CI
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0,4 % p/v)Corning25-900-CI
Calcium Agent de mobilisation
-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Albumine sérique bovine (BSA)Avantor97061-420
Chlorure de calcium dihydratéThermo42352-0250
DiméthylsulfoxydeThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Solution saline équilibrée de Hank’s (sans Ca/Mg/rouge de phénol)Corning21-022-CV
Chlorure de magnésium hexahydratéMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Hydroxyde de sodiumVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (sel TFA)Préparé par Trudy Holyst au Versiti Blood Institut de recherche
Materials
96 bien traité en culture, à paroi noire, plaque d’essai à fond transparentCorning3603avec couvercles transparents
Tube à centrifuger, 15 mLAvantor89039-664
Tube à centrifuger, 50 mLAvantor89039-656
Fiole de culture, T-75Corning353136Réservoir
de réactif jetable, 50 mLCorningRES-V-50-S
Lecteur de plaques EnspirePerkin ElmerTube de
microcentrifugation abandonné, 1,5 mLPipette Pasteur Avantor20170-038
, 9"Fisher13-678-6Bdoit être stérilisé Bandelette
tube PCR avec plat séparé bandes de capuchonAvantor76318-802
pipette, 20 & micro ; LBiotix63300042stériles, pointes filtrées
Pointes de pipette, 200 & micro ; LBiotix63300044stériles, pointes filtrées
Pointes de pipette, 1250 & micro ; LBiotix63300047stériles, pointes filtrées
PrismGraphPadvolume 6 pipette sérologique usagée
, 5 mLTradewinds Direct  ; 07-5005
Pipette sérologique, 10 mLTradewinds Direct  ; 07-5010
Pipette sérologique, 25 mLTradewinds Direct  ; Référence 07-5025
4 de Pointes de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Essai sur lecteur de plaquescellules endoth lialesmodulateurs de PAR1colorant Fluo 4criblage haut d bitsignalisation Gqplaque 96 puitsmesure de la fluorescence

Articles connexes