La matrice de rate décellularisée (DSM) a des applications prometteuses dans le domaine de l’ingénierie tissulaire hépatique. Ce protocole décrit la procédure de préparation du DSM chez le rat, qui comprend la récolte de rates de rats, leur décellularisation par perfusion et l’évaluation du DSM résultant pour confirmer ses caractéristiques.
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Article de méthode
Fabrication d’une matrice de rate décellularisée dérivée de rats
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transplantation hépatique est le traitement principal de la maladie hépatique en phase terminale. Cependant, la pénurie et la qualité insuffisante des organes des donneurs nécessitent le développement de thérapies alternatives. Les foies bioartificiels (BAL) utilisant une matrice hépatique décellularisée (DLM) sont apparus comme des solutions prometteuses. Cependant, l’approvisionnement en DLM appropriés reste un défi. L’utilisation d’une matrice de rate décellularisée (DSM) a été explorée comme base pour les BAL, offrant une alternative facilement disponible. Dans cette étude, des rates de rat ont été prélevées et décellularisées à l’aide d’une combinaison de cycles de gel-dégel et de perfusion avec des réactifs de décellularisation. Le protocole a préservé les microstructures et les composants de la matrice extracellulaire (ECM) dans le DSM. Le processus complet de décellularisation a pris environ 11 h, ce qui a permis d’obtenir un ECM intact dans le DSM. L’analyse histologique a confirmé l’élimination des composants cellulaires tout en conservant la structure et la composition de l’ECM. Le protocole présenté fournit une méthode complète pour obtenir le DSM, offrant des applications potentielles en ingénierie tissulaire hépatique et en thérapie cellulaire. Ces résultats contribuent au développement d’approches alternatives pour le traitement de la maladie hépatique en phase terminale.
Introduction
La transplantation hépatique reste le seul traitement définitif de la maladie hépatique en phase terminale 1,2,3. Cependant, la pénurie critique et la baisse de la qualité des organes de donneurs ont accru le besoin de traitements alternatifs4. Dans le domaine de la médecine régénérative, les foies bioartificiels (BAL) utilisant une matrice hépatique décellularisée (DLM) sont apparus comme des solutions prometteuses 5,6,7. Le DLM préserve la structure hépatique d’origine, y compris son réseau microvasculaire complexe et les composants de l’ECM, offrant un échafaudage pour la création de BALs transplantables qui pourraient potentiellement soulager les maladies du foie.
Malgré les promesses, l’adoption de cette technologie se heurte à des défis, notamment en ce qui concerne l’approvisionnement en DLM appropriés. Les DLM d’origine humaine sont rares, tandis que ceux d’origine animale comportent des risques de transmission de maladies et de rejet immunitaire. Dans le cadre d’une approche innovante, notre recherche a exploré l’utilisation d’une matrice de rate décellularisée (DSM) comme base pour les BALs 8,9,10,11. La rate est plus facilement disponible dans diverses situations médicales, telles que l’hypertension portale, la rupture traumatique, le purpura thrombocytopénique idiopathique et le don après une mort cardiaque. Par conséquent, la rate est plus largement disponible que le foie à des fins de recherche. Les patients qui ont subi une splénectomie ne souffrent pas d’affections graves, ce qui confirme encore la dispensabilité de la rate. Le microenvironnement de la rate, en particulier la matrice extracellulaire et les sinusoïdes, est similaire à celui du foie. Cela fait de la rate un organe approprié pour l’adhésion et la prolifération cellulaires dans la recherche sur la transplantation d’hépatocytes. Sur la base de ces résultats, nos recherches antérieures ont démontré que les DSM partagent des microstructures et des composants comparables avec les DLM et peuvent soutenir la survie et la fonction des hépatocytes, y compris la production d’albumine et d’urée. De plus, il a été démontré que les DSM améliorent la différenciation hépatique des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, conduisant à une fonctionnalité améliorée et cohérente.
En utilisant des DSM traités à l’héparine, nous avons mis au point des BALs fonctionnels capables de démontrer une anticoagulation à court terme efficace et une compensation partielle de la fonction hépatique11. Par conséquent, ce DSM tridimensionnel est très prometteur pour l’avancement de l’ingénierie tissulaire hépatique et de la thérapie cellulaire. Dans ce travail, nous présentons les méthodes détaillées de récolte de la rate de rat et de préparation de la MDS qui préservent les microstructures et les composants de la MEC.
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Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université Jiaotong de Xi’an et réalisée conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Prélèvement de la rate
- Utilisez des rats Sprague Dawley mâles pesant de 250 à 280 g. Hébergez les rats dans des pièces à température et humidité contrôlées, et fournissez-leur de la nourriture et de l’eau à volonté, sauf pour jeûner avant la chirurgie.
- Injecter par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mL/kg) comme analgésique 1 h avant l’opération. Anesthésier le rat par inhalation d’isoflurane. Utilisez un débit de 1,5 L/min d’isoflurane à 5 % pour l’anesthésie d’induction dans une boîte en plexiglas et maintenez l’anesthésie avec un débit de 0,6 à 0,8 L/min d’isoflurane à 2 % à travers un masque. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils.
- Utilisez un rasoir électrique pour raser la peau sur tout l’abdomen. Fixez le rat en position couchée sur la table d’opération. Injecter 2 ml de solution saline héparinée (1 000 U d’héparine) par la veine dorsale du pénis pour obtenir une anticoagulation systémique. Désinfectez la peau rasée avec une solution de povidone iodée et couvrez-la d’un drap stérile.
- Faites une incision cruciforme à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans l’abdomen, exposez la cavité abdominale en l’étirant avec la pince hémostatique et retournez le foie vers le diaphragme. Extériorisez le tractus gastro-intestinal sur le côté droit de l’abdomen et couvrez-le de gaze humide.
- Séparez et coupez soigneusement le ligament splénogastrique pour exposer le hile splénique.
REMARQUE : La rate, qui se présente sous la forme d’une structure allongée rougeâtre, d’environ 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm, peut être identifiée dans l’abdomen gauche. - Séparez et exposez progressivement l’artère hépatique, l’artère gastroduodénale et l’artère splénique communes en disséquant le long du hile splénique. Lister et couper l’artère gastroduodénale et l’artère hépatique commune tout en dissociant progressivement les tissus environnants.
- Retournez la rate vers le côté droit pour exposer l’aorte abdominale. Effectuez une dissection contondante en douceur et exposez l’aorte abdominale et le tronc cœliaque à l’aide de cotons-tiges. Placez une suture en soie 3-0, d’environ 3 cm de longueur, au-dessus et en dessous des branches du tronc cœliaque, et placez une suture en soie 6-0, d’environ 10 cm de longueur, sur la branche du tronc cœliaque.
- Ligature de l’aorte abdominale au-dessous et au-dessus des branches du tronc cœliaque. Faites une petite incision au niveau de la branche artérielle. Soulevez doucement la suture en soie 6-0, insérez un cathéter veineux de 24 G dans l’artère splénique le long du tronc cœliaque, puis ligaturez-la et fixez-la.
- À l’aide d’un pousse-seringue à un débit de 4 mL/min, perfuser une solution saline normale héparinisée (25 U/mL) à un volume de 50 mL. Dans le même temps, sectionnez la veine porte en tant que canal d’écoulement pour permettre au liquide infusé de s’écouler hors de la rate. L’animal est euthanasié par exsanguination.
- Disséquez soigneusement le tissu environnant de la rate, en évitant d’endommager le pancréas, tout en préservant les principaux vaisseaux accessoires.
- Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite autour de la rate, puis retirez la rate et le pancréas et rincez-les dans une solution saline normale.
REMARQUE : La rate et le pancréas des rats sont étroitement liés, le pancréas s’enroulant autour de l’artère splénique. Si la rate est retirée séparément, il peut être difficile de ligaturer de nombreux petits vaisseaux sanguins. Dans cette procédure, la rate est retirée en même temps que le pancréas. Après décellularisation, la rate et le pancréas deviennent transparents et la microvascularisation est visible, ce qui facilite la préservation de la rate avec des vaisseaux sanguins intacts. - Transférez la rate dans un tube à centrifuger de 50 ml rempli de solution saline normale et conservez-la dans un congélateur à -80 °C.
REMARQUE : La rate et le cathéter veineux insérés dans l’artère splénique seront cryoconservés ensemble pour une connexion pratique pendant les expériences de perfusion.
2. Décellularisation de la rate
- Répétez le cycle de congélation-décongélation 3 fois dans un récipient stérile pour lyser les cellules de la rate.
REMARQUE : Le cycle de gel-dégel est une méthode physique utilisée pour la décellularisation des échafaudages. Le tissu de la rate est placé dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit pour la congélation, puis retiré de l’environnement à basse température et placé dans un bain-marie à température ambiante ou à 37 °C pour la décongélation. Ce processus de congélation et de décongélation est répété 3 à 6 fois, ce qui perturbe les membranes cellulaires et conduit à la lyse cellulaire. - Mettre en place un système de perfusion à l’intérieur d’une paillasse propre composé d’une pompe péristaltique, d’un réservoir de 2 L, d’un tube en silicone d’un diamètre intérieur de 2,4 mm et d’un piège à bulles (figure 1).
- Remplissez le système de perfusion avec de l’eau déminéralisée (ddH2O) et maintenez-le en marche pendant 10 min.
- Transférez soigneusement la rate prélevée dans le récipient rempli de ddH2O.
- Connectez le tube en silicone au cathéter veineux qui a été inséré dans l’artère splénique.
- Commencer la perfusion avec lejdH2O à raison de 2 mL/min pendant 30 min.
- Poursuivre la perfusion avec lejdH2O à raison de 4 mL/min pendant 30 min.
- Perfuser avec une solution SDS à 0,1 % (p/v) pendant 4 h.
- Perfuser avec une solution Triton X-100 à 1 % (v/v) pendant 2 h.
- Perfuser avec du PBS à raison de 4 mL/min pendant 4 h pour laver le DSM.
REMARQUE : Utilisation de la pompe péristaltique pour la perfusion unidirectionnelle de tous les liquides. - Une fois la perfusion terminée, ligaturez et transectez les branches vasculaires entre le pancréas et la rate, puis retirez le pancréas. Conservez le DSM dans un tube à centrifuger propre et scellé de 50 mL imbibé de PBS contenant 10 % de pénicilline-streptomycine à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé pour de futures expériences.
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Résultats
Ce protocole utilisait une combinaison de cycles répétés de congélation-décongélation et de perfusion avec des réactifs de décellularisation pour la décellularisation de la rate du rat. La décellularisation complète de la rate a été réalisée en environ 11 h (Figure 2A). Tout au long du processus de décellularisation, la couleur de la rate est progressivement passée d’un rouge foncé à un rouge clair tacheté, puis à un blanc translucide (Figure 2B). La morphologie...
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Discussion
Les BAL représentent une approche efficace pour le traitement de la maladie hépatique en phase terminale, en particulier dans les cas où la transplantation hépatique est entravée par la pénurie actuelle d’organes de donneurs6. Une option prometteuse pour la création de BALs est l’utilisation de DLM, qui préserve la MEC naturelle et la structure vasculaire du foie natif. Cependant, la rareté de la DLM humaine et les risques potentiels d’infection et d’immunogénicité associés à la DLM animale posent...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82000624), le programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du Shaanxi (2022JQ-899 et 2021JM-268), le programme de soutien à la capacité d’innovation de la province du Shaanxi (2023KJXX-030), le projet conjoint du plan de R&D de l’université de la province du Shaanxi (2021GXLH-Z-047), la fondation institutionnelle du premier hôpital affilié de l’Université Jiaotong de Xi’an (2021HL-42 et 2021HL-21).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Machine d’anesthésie | Harvard Appareil | table | d’anesthésie animale |
| Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | Diamètre des pores : 5 &mu ; m | prévenir les bulles d’air | |
| Buprénorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co., Ltd | un analgésique | |
| Pince hémostatique | Shanghai Medical Instruments ; Co., Ltd | J31020 | outil chirurgical |
| Saline héparinée | SPH No.1 Biochimique & Pharmaceutical Co., LTD ; | prévenir la formation de thrombose ; | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthésique :pour l’induction et le maintien de l’anesthésie | |
| Pénicilline-Streptomycine ; | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotiques in vitro pour prévenir la contamination microbienne |
| Pompe péristaltique | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Saline tamponnée au phosphate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 solution saline tampon d’acide phosphorique | |
| Tube en silicone | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4&fois ; Suture en soie de 0,8 mm | |
| Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 et 3-0 | ligaturation des vaisseaux sanguins | |
| Dodécylsulfate de sodium | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | détergent ionique, dissout les membranes cellulaires et nucléaires |
| Pompe à seringue | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | perfusion intraveineuse |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | détergent non ionique, perturbe les interactions lipides-lipides, lipides-protéines et ADN-protéines |
| Cathéter veineux | B. Braun Company | 24G | insérant l’artère de la rate |
Références
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Réimpressions et autorisations
