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Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

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DOI :

10.3791/66522

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14 juin 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Résumé

Les infections virales peuvent provoquer un stress du réticulum endoplasmique (RE) en raison d’une accumulation anormale de protéines, conduisant à une réponse protéique dépliée (UPR). Les virus ont développé des stratégies pour manipuler l’UPR de l’hôte, mais il y a un manque de compréhension détaillée de la modulation de l’UPR et de son importance fonctionnelle pendant l’infection par le VIH-1 dans la littérature. Dans ce contexte, le présent article décrit les protocoles utilisés dans notre laboratoire pour mesurer les niveaux de stress du RE et l’UPR pendant l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T et l’effet de l’UPR sur la réplication virale et l’infectiosité.

La coloration à la thioflavine T (ThT) est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter le stress du RE dans les cellules en détectant les agrégats de protéines. Ici, nous avons illustré le protocole de coloration ThT dans les cellules infectées par le VIH-1 pour détecter et quantifier le stress du RE. De plus, le stress du RE a également été détecté indirectement en mesurant les niveaux de marqueurs UPR tels que BiP, IRE1 phosphorylé, PERK et eIF2α, l’épissage de XBP1, le clivage de ATF6, ATF4, CHOP et GADD34 dans les cellules infectées par le VIH-1, en utilisant l’immunoblot conventionnel et la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (RT-PCR). Nous avons constaté que la fluorescence ThT est en corrélation avec les indicateurs d’activation de l’UPR. Cet article présente également les protocoles permettant d’analyser l’impact du stress RE et de la modulation UPR sur la réplication du VIH-1 par des expériences d’inactivation ainsi que l’utilisation de molécules pharmacologiques. L’effet de l’UPR sur l’expression/réplication du gène VIH-1 et la production de virus a été analysé par des tests rapporteurs de la luciférase et par ELISA de capture de l’antigène p24, respectivement, tandis que l’effet sur l’infectiosité du virion a été analysé par coloration des cellules rapporteures infectées. Collectivement, cet ensemble de méthodes fournit une compréhension complète des voies de réponse protéique dépliée pendant l’infection par le VIH-1, révélant sa dynamique complexe.

Introduction

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) se caractérise par une réduction progressive du nombre de lymphocytes T CD4+, ce qui entraîne une défaillance progressive de la réponse immunitaire. Le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est l’agent causal du sida. Il s’agit d’un virus à ARN simple brin enveloppé, de sens positif, avec deux copies d’ARN par virion et appartenant à la famille des rétroviridae. La production de fortes concentrations de protéines virales dans la cellule hôte exerce une pression excessive sur la machinerie de repliement des protéines de la cellule1. Le RE est le premier compartiment de la voie sécrétoire des cellules eucaryotes. Il est chargé de produire, de modifier et de délivrer des protéines à la voie sécrétoire et aux sites cibles de l’espace extracellulaire. Les protéines subissent de nombreux changements post-traductionnels et se replient dans leur conformation naturelle dans le RE, y compris la glycosylation liée à l’asparagine et la création de liaisons disulfure intra- et intermoléculaires2. Par conséquent, de fortes concentrations de protéines sont présentes dans la lumière du RE et celles-ci sont très sujettes à l’agrégation et au mauvais repliement. Diverses conditions physiologiques, telles que les chocs thermiques, les infections microbiennes ou virales, qui exigent une synthèse accrue des protéines ou une mutation des protéines, entraînent un stress du RE en raison de l’accumulation accrue de protéines dans le RE, perturbant ainsi l’homéostasie de la lumière du RE. Le stress du RE active un réseau de voies de transduction de signal adaptatives hautement conservées, la réponse protéique dépliée (UPR)3. L’UPR est utilisé pour ramener l’état physiologique normal du RE en alignant sa charge protéique dépliée et sa capacité de repliement. Ceci est provoqué par l’augmentation de la taille du RE et des chaperons et foldases moléculaires résidents du RE, ce qui entraîne une augmentation de la capacité de pliage du RE. L’UPR diminue également la charge protéique du RE grâce à l’atténuation globale de la synthèse des protéines au niveau traductionnel et augmente l’élimination des protéines dépliées du RE en régulant à la hausse la dégradation associée au RE (ERAD)4,5.

Le stress du RE est détecté par trois protéines transmembranaires résidentes du RE : la protéine kinase R (PKR) du réticulum endoplasmique kinase (PERK), le facteur de transcription activateur 6 (ATF6) et l’enzyme de type 1 nécessitant l’inositol (IRE1). Tous ces effecteurs sont maintenus inactifs en se liant à la famille des protéines de choc thermique A (Hsp70) membre 5 (HSPA5), également connue sous le nom de protéine de liaison (BiP)/protéine régulée par le glucose de 78-kDa (GRP78). Lors d’un stress RE et d’une accumulation de protéines dépliées/mal repliées, HSPA5 se dissocie et conduit à l’activation de ces effecteurs, qui activent ensuite une série de cibles en aval qui aident à résoudre le stress RE et, dans des conditions extrêmes, favorisent la mort cellulaire6. Lors de la dissociation de HSPA5, PERK s’autophosphoryle et son activité kinase est activée7. Son activité kinase phosphoryle eIF2α, ce qui conduit à une atténuation translationnelle, abaissant la charge protéique de l’ER8. Cependant, en présence du facteur d’initiation phospho-eucaryote 2α (eIF2α), les cadres de lecture ouverts non traduits sur des ARNm spécifiques deviennent préférentiellement traduits, tels que ATF4, régulant les gènes induits par le stress. ATF4 et la protéine homologue C/EBP (CHOP) sont des facteurs de transcription qui régulent les gènes induits par le stress et régulent les voies d’apoptose et de mort cellulaire 9,10. L’une des cibles d’ATF4 et de CHOP est la protéine d’arrêt de croissance et inductible par des dommages à l’ADN (GADD34), qui, avec la protéine phosphatase 1, déphosphoryle peIF2α et agit comme un régulateur de rétroaction pour l’atténuation translationnelle11. Sous stress RE, ATF6 se dissocie de HSPA5 et son signal de localisation de Golgi est exposé, ce qui entraîne sa translocation vers l’appareil de Golgi. Dans l’appareil de Golgi, ATF6 est clivé par la protéase du site 1 (S1P) et la protéase du site 2 (S2P) pour libérer la forme clivée de l’ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 est ensuite transloqué dans le noyau, où il induit l’expression de gènes impliqués dans le repliement, la maturation et la sécrétion de protéines ainsi que dans la dégradation des protéines12,13. Pendant le stress RE, IRE1 se dissocie de HSPA5, se multimérise et s’auto-phosphoryle14. La phosphorylation d’IRE1 active son domaine RNase, médiant spécifiquement l’épissage de 26 nucléotides à partir de la partie centrale de l’ARNm de la protéine de liaison X-box 1 (XBP1)15,16. Cela génère un nouveau C-terminus conférant une fonction de transactivation, générant la protéine XBP1s fonctionnelle, un puissant facteur de transcription contrôlant plusieurs gènes induits par le stress du RE17,18. L’activité combinée de ces facteurs de transcription active les programmes génétiques visant à restaurer l’homéostasie du RE.

Il existe différentes méthodes pour détecter le stress du RE et l’UPR. Il s’agit notamment des méthodes conventionnelles d’analyse des marqueurs UPR19,20. Diverses méthodes non conventionnelles comprennent la mesure de l’état redox de l’UPR et de la distribution du calcium dans la lumière du RE, ainsi que l’évaluation de la structure du RE. La microscopie électronique peut être utilisée pour voir dans quelle mesure la lumière du RE s’agrandit en réponse au stress du RE dans les cellules et les tissus. Cependant, cette méthode prend du temps et dépend de la disponibilité d’un microscope électronique, qui peut ne pas être disponible pour tous les groupes de recherche. De plus, la mesure du flux de calcium et de l’état redox du RE est difficile en raison de la disponibilité des réactifs. De plus, les résultats de ces expériences sont très sensibles et pourraient être affectés par d’autres facteurs du métabolisme cellulaire.

Une technique puissante et simple pour surveiller les sorties de l’UPR consiste à mesurer l’activation des différentes voies de signalisation de l’UPR et est utilisée depuis des décennies dans divers scénarios de stress. Ces méthodes conventionnelles de mesure de l’activation de l’UPR sont économiques, réalisables et fournissent les informations en moins de temps que d’autres méthodes connues. Il s’agit notamment de l’immunoblot pour mesurer l’expression des marqueurs UPR au niveau des protéines, tels que la phosphorylation de IRE1, PERK et eIF2α et le clivage d’ATF6 en mesurant la forme P50 d’ATF6 et l’expression protéique d’autres marqueurs tels que HSPA5, XBP1 épissé, ATF4, CHOP et GADD34, ainsi que la RT-PCR pour déterminer les niveaux d’ARNm ainsi que l’épissage de l’ARNm XBP1.

Cet article décrit un ensemble validé et fiable de protocoles pour surveiller le stress du RE et l’activation de l’UPR dans les cellules infectées par le VIH-1 et pour déterminer la pertinence fonctionnelle de l’UPR dans la réplication et l’infectivité du VIH-1. Les protocoles utilisent des réactifs facilement disponibles et économiques et fournissent des informations convaincantes sur les résultats de l’UPR. Le stress du RE est le résultat de l’accumulation de protéines dépliées/mal repliées, qui ont tendance à former des agrégats de protéines21. Nous décrivons ici une méthode pour détecter ces agrégats de protéines dans les cellules infectées par le VIH-1. La coloration à la thioflavine T est une méthode relativement nouvelle utilisée pour détecter et quantifier ces agrégats de protéines22. Beriault et Werstuck ont décrit cette technique pour détecter et quantifier les agrégats de protéines et, par conséquent, les niveaux de stress du RE dans les cellules vivantes. Il a été démontré que la petite molécule fluorescente thioflavine T (ThT) se lie sélectivement aux agrégats de protéines, en particulier aux fibrilles amyloïdes.

Dans cet article, nous décrivons l’utilisation de ThT pour détecter et quantifier le stress du RE dans les cellules infectées par le VIH-1 et le corrélons à la méthode conventionnelle de surveillance de l’UPR en mesurant l’activation de différentes voies de signalisation de l’UPR.

Étant donné qu’il y a également un manque d’informations complètes concernant le rôle de l’UPR pendant l’infection par le VIH-1, nous fournissons un ensemble de protocoles pour comprendre le rôle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion. Ces protocoles comprennent l’inhibition des marqueurs UPR par les lentivirus ainsi que le traitement avec des inducteurs de stress pharmacologiques du RE. Cet article montre également les types de lecture qui peuvent être utilisés pour mesurer l’expression du gène VIH-1, la production virale ainsi que l’infectivité des virions produits, tels que le test de luciférase basé sur la répétition terminale longue (LTR), le test d’immuno-absorption enzymatique p24 (ELISA) et le test de coloration rapporteur β-gal, respectivement.

En utilisant la majorité de ces protocoles, nous avons récemment rapporté l’implication fonctionnelle de l’infection par le VIH-1 sur l’UPR dans les cellules T23, et les résultats de cet article suggèrent la fiabilité des méthodes décrites ici. Ainsi, cet article fournit un ensemble de méthodes pour obtenir des informations complètes sur l’interaction du VIH-1 avec le stress du RE et l’activation de l’UPR.

Protocole

REMARQUE : Les lignées cellulaires utilisées ici sont HEK-293T et Jurkat J6 (une lignée cellulaire CD4+T), qui ont été obtenues à partir du Cell Repository, NCCS, Pune, Inde ; TZM-bl, une lignée cellulaire dérivée de HeLa qui a intégré des copies des gènes de la β-galactosidase et de la luciférase sous le promoteur de la longue répétition terminale (LTR) du VIH-124 et CEM-GFP (une autre lignée cellulaire rapporteuse de CD4+ T)25 a été obtenue du NIH AIDS Repository, aux États-Unis.

1. Préparation et stockage des stocks du virus VIH-1

  1. Préparation du stock de virus VIH-1
    REMARQUE : Il est conseillé de suivre les directives internationales relatives à la biosécurité telles qu’elles sont disponibles dans le manuel de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) ou des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dans toutes les expériences impliquant le VIH-1. La manipulation du virus et toute expérience avec le virus vivant ne doivent être effectuées que dans une enceinte de biosécurité appropriée située dans un laboratoire de confinement d’au moins niveau BSL2. La production de particules infectieuses du VIH-1 à l’aide d’un kit de transfection de mammifères à base de phosphate de calcium est décrite dans cette partie du protocole.
    1. Semez les cellules HEK-293T dans des boîtes de 90 mm avec 10 ml de DMEM (10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) dans une enceinte de biosécurité de classe II de type A2 et conservez-les pendant environ 12 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C de sorte que la confluence des cellules soit entre 50 % et 60 %.
    2. Le lendemain, préparez le mélange de transfection : Préparez la solution A contenant 25 μg d’ADN plasmidique pNL4.3 (un clone moléculaire du VIH-1) dans un tampon stérile, 86,8 μL de 2 M de CaCl2 et le reste de l’eau stérile pour obtenir le volume final de 700 μL pour chaque plaque. Préparez la solution B contenant 700 μL de solution saline tamponnée à HEPES (HBS) pour 1 plaque. Ensuite, ajustez le calcul pour le nombre total de plaques.
    3. Ajoutez maintenant la solution B à la solution A de manière goutte à goutte tout en vortex continuellement la solution A. Le volume total du mélange de transfection passe maintenant à 1,4 mL pour une plaque.
      REMARQUE : L’addition précise goutte à goutte de la solution B à la solution A tandis que le vortex continu conduit à la formation de complexes de transfection parfaits.
    4. Incuber ce mélange à température ambiante (RT) pendant environ 20 min. Ensuite, ajoutez lentement le mélange goutte à goutte à chaque assiette contenant 9 ml de DMEM complet et transférez les plaques dans l’incubateur de CO2 . Après 8 à 10 h, remplacez le support existant par 10 mL de DMEM complet.
    5. Après 24 heures après le changement de milieu, prélever le surnageant (qui contient les particules virales) de toutes les plaques dans des tubes coniques. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à basse vitesse (Table des matériaux) pour éliminer les débris cellulaires.
    6. Transférez le surnageant dans des tubes d’ultracentrifugeuse polyallomères et placez-les dans le rotor pivotant d’une ultracentrifugeuse (Table des matériaux). Vérifiez l’équilibre du poids des supports de tube et ajustez-le avec un milieu stérile si nécessaire.
    7. Ultracentrifugeuse à 1,41,000 x g pendant 2,5 h à 4 °C. Après cela, retirez soigneusement les tubes et décantez lentement le surnageant à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
    8. À la pastille (qui est maintenant le virus concentré) dans chaque tube, ajoutez 1 ml de milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incomplet et effectuez un pipetage vigoureux pour déloger la pastille.
      REMARQUE : La pastille après l’ultracentrifugeuse est presque invisible à l’œil nu. Il faut donc veiller à ajouter du RPMI 1640 au milieu du tube afin que la pastille soit correctement délogée.
    9. Ensuite, ajoutez 25 μL de 1 M HEPES pH 7,4 à 1 mL de suspension virale. Aliquote 50 μL de la suspension dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et les stocker immédiatement dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme.
  2. Quantification de la concentration virale et de l’infectiosité du virion
    REMARQUE : Pour calculer l’infectiosité du virus, il est essentiel de quantifier d’abord sa concentration, ce qui est fait par ELISA de capture d’antigène p24 (selon les instructions du fabricant et n’est donc pas décrit ici ; voir le tableau des matériaux). Ce processus donne la concentration du virus en nanogrammes par microlitre (ng/μL) de stock, qui est ensuite utilisé pour identifier le nombre de virions infectieux dans le stock grâce à l’expérience suivante dans des cellules rapporteures TZM-bl26.
    1. Compter et ensemencer 0,1 x 10cellules de 6 TZM-bl dans une plaque de 24 puits à l’aide de 500 μL de DMEM complet pour chaque puits et le conserver dans un incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 12 h.
    2. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à 50 % ou 60 % avant de commencer l’infection pour la quantification du virus. Remplacer le milieu existant par 250 μL de DMEM complet frais dans chaque puits.
      REMARQUE : Gardez bien une commande positive pour exclure toute défaillance expérimentale.
    3. Calculez la quantité de virus de stock nécessaire pour les infections de 1 ng, 0,1 ng et 0,01 ng en double. Ajoutez la quantité appropriée de virus dans les puits et maintenez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 4 h.
    4. Lavez les cellules deux fois avec 500 μL de DMEM incomplet, puis ajoutez 500 μL de DMEM complet.
    5. Procéder à la procédure de coloration à β-gal après 36 h de changement de support.
      1. Jetez le milieu existant et lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Fixez les cellules en ajoutant 500 μL de la solution de fixation (0,25 % de glutaraldéhyde dans le PBS) dans chaque puits et incubez à RT à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité pendant 5 à 7 min.
      2. Préparez la solution de coloration comme indiqué dans le tableau 1. Gardez-le à l’abri de la lumière car X-gal est sensible à la lumière.
      3. Lavez les cellules une fois avec 1 ml de PBS. Recouvrir les cellules de 500 μL de solution de coloration fraîchement préparée et incuber à 37 °C dans l’obscurité pendant 2 à 18 h.
      4. Pour arrêter la réaction par la suite, rincez les cellules avec 500 μL de diméthylsulfoxyde à 3 % (DMSO) dans du PBS deux fois, puis conservez les cellules dans 500 μL de PBS frais.
      5. Comptez les cellules infectées bleues (comme illustré à la figure 1A) au microscope avec un grossissement de 10x pour 5 champs aléatoires. Prenez un décompte moyen des 5 champs et multipliez-le par le facteur de champ et le facteur de dilution. Cela permet de quantifier les particules de virion infectieuses dans le stock de virus.
        REMARQUE : Pour une plaque de 24 puits, le facteur de champ est de 75.
ComposantsPréparationVolume requis
PBSPréparez 1x PBS à partir d’un stock de 10x PBS14 ml
Cyanure de potassium ferri-ferroDissoudre 0,82 g de ferricyanure de potassium et 1,06 g de ferrocyanure de potassium dans 25 ml de 1x PBS0,75 mL
Chlorure de magnésium1 M dans 1 mL de 1x PBS15 μL
Gal XDissoudre 30 mg dans 0,6 mL de N,N-diméthylformamide (dans l’obscurité)0,3 mL
Total = 15 mL

Tableau 1 : Liste des composants requis pour la coloration à l’β-gal dans les cellules TZM-bl.

2. Infection par le VIH-1 des lignées de cellules T

  1. Décongeler et cultiver une lignée de lymphocytes T immortalisée. Cette étude a utilisé une lignée cellulaire CEM-GFP cultivée dans un milieu RPMI 1640 complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline-streptomycine et 500 μg/mL de G418.
  2. Comptez et prélevez 2 millions de cellules pour chaque point temporel (Non infecté, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h). Récolter immédiatement les cellules non infectées par centrifugation à 100 x g pendant 5 min et ajouter un tampon de lyse cellulaire (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M de NaCl, 5 mM d’EDTA, 0,5 % de NP40, 0,5 mM de NaF, 1 mM de DTT), complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase, 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 1x inhibiteur de la phosphatase (50 μL pour 1 à 3 millions de cellules) ou lyser dans le réactif Trizol (1 mL pour 1 à 3 millions de cellules) pour l’isolement de l’ARN (voir le tableau des Matériaux).
  3. Lavez les cellules une fois avec 1 mL de milieu RPMI 1640 complet contenant du polybrène (5 μg/mL) à 100 x g pendant 5 min à RT. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet.
    REMARQUE : Le polybrène est un polymère cationique qui est utilisé pour améliorer l’infection rétrovirale dans les cellules de mammifères.
  4. Remettez en suspension les 8 millions de cellules dans 1 mL de polybrène contenant du milieu complet. Calculez maintenant le volume de stock viral requis pour 4 millions de particules de virion, ajoutez le stock de virus et portez le volume total à 2 ml en ajoutant un milieu complet. Cela en fait un MOI de 0,5.
  5. Maintenez les cellules à l’intérieur de l’incubateur de CO2 à 37 °C pendant 4 h, avec des tapotements intermittents toutes les 30 à 45 minutes.
  6. Après 4 h, faites tourner les cellules et jetez soigneusement le surnageant à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité avec des méthodes d’élimination appropriées.
    REMARQUE : À partir de cette étape, centrifugez les cellules à 100 x g pendant 5 min à RT.
  7. Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de milieu incomplet. Remettez les cellules en suspension dans 8 mL de milieu complet, ce qui donne 1 million de cellules/mL.
  8. Dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits, ensemencez un nombre égal de cellules dans le nombre requis de puits et conservez la plaque dans un incubateur de CO2 maintenu à 37 °C.
  9. Pendant les 4 prochains jours, récoltez les cellules toutes les 24 h en ajoutant un tampon de lyse cellulaire. Récupérez également le surnageant et transférez-le immédiatement dans le congélateur à -80 °C.
  10. Pour vérifier s’il y a eu infection, procédez à l’ELISA de capture de l’antigène p24 pour tous les points temporels. Faites des dilutions appropriées pour les points temporels, c’est-à-dire une dilution plus faible pour les points temporels initiaux et plus élevée pour les points temporels ultérieurs allant de 1:50 à 1:500. Tracez les lectures dans un graphique qui illustre la progression de l’infection (figure 1B).

3. Coloration à la thioflavine T pour déterminer la contrainte RE

  1. Fixez 1 million de cellules CEM-GFP non infectées et 0,5 cellule CEM-GFP infectée (cellules infectées prélevées 72 h) avec 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 min à RT.
  2. Réduire les cellules en granulés à 100 x g pendant 5 minutes et traiter avec 500 μL de glycine 0,1 M pendant 5 minutes, puis laver deux fois avec 500 μL de PBS. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS.
  3. Assemblez les lames de verre, les cartes de filtre et les chambres d’échantillonnage. Ajoutez les 100 μL de cellules remises en suspension dans les chambres d’échantillonnage et faites tourner les cellules à 1000 x g pendant 4 min pour faire adhérer les cellules aux lames dans une cytocentrifugeuse (tableau des matériaux).
    REMARQUE : Il n’y aurait pas assez de cellules immobilisées sur la lame après la centrifugation par cytocentrifugation si la suspension cellulaire est trop diluée. Les cellules sont susceptibles de s’agglutiner et d’être mal réparties après la cytocentrifugation, si la suspension cellulaire est très concentrée.
  4. Perméabilisez les cellules pendant 10 minutes à l’aide de gouttes de Triton-X-100 à 0,1 % dans du PBS (suffisamment pour couvrir la zone où les cellules ont adhéré) et lavez les cellules deux fois en mettant du PBS goutte à goutte et en essuyant le PBS avec du tissu en inclinant la lame.
  5. Incuber les cellules avec 10 μL de 5 μM de Thioflavin T pendant 30 min.
    REMARQUE : Ne pas laver après l’incubation avec ThT.
  6. Monter les lames à l’aide d’un support de montage de 5 μL (80 % de glycérol v/v, 20 % de PBS v/v et 8 mg/mL de 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane [DABCO]), mettre en place la lamelle et sceller la lamelle à l’aide de vernis à ongles. Laissez sécher les lames.
    REMARQUE : À toutes ces étapes, assurez-vous que les cellules ne se dessèchent pas.
  7. Prenez les images confocales de cellules fixes avec une lentille d’immersion glycérol 63x sur un microscope confocal (voir Tableau des matériaux). Ajustez les paramètres d’excitation et d’émission suivants : GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) et ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    REMARQUE : Chaque canal fluorescent doit être imagé séquentiellement, plutôt que simultanément, pour éviter le chevauchement des canaux. La GFP a été considérée comme l’indication de l’infection par le VIH-1, car les cellules CEM-GFP ont une GFP sous la régulation du promoteur LTR, qui se déclenche lors de l’infection par le VIH-125.
  8. Convertissez les images fluorescentes en 8 bits avant de les quantifier par analyse de seuil. Quantifiez manuellement l’intensité de chaque cellule à l’aide d’un logiciel comme Image J (~50 cellules)27. Tracez le graphique avec l’intensité de chaque cellule sous forme de points sur l’axe des Y par rapport aux critères non infectés et infectés.
  9. Pour démontrer l’efficacité de ce protocole, prenez un contrôle positif, par exemple, le traitement à la Thapsigargin (inducteur de stress connu du RE) dans ce cas28. Traitez 1 million de cellules CEM-GFP, chacune avec 1 μL de DMSO (contrôle du véhicule) et 100 nM de Thapsigargin pendant 12 h.
  10. Récoltez les cellules et procédez à la coloration ThT comme mentionné pour les échantillons infectés (étapes 3.1-3.8).
    REMARQUE : Pour ces échantillons, la fluorescence GFP n’est pas requise. Par conséquent, seule la fluorescence ThT est capturée en microscopie confocale.

4. Détermination de l’activation et de l’expression de divers marqueurs UPR

REMARQUE : Pour déterminer l’expression des marqueurs UPR, deux méthodes sont utilisées : l’immunobuvard et la RT-PCR. Pour l’immunotransfert, prélever les cellules CEM-GFP infectées par le VIH-1 à 0,5 MOI à divers moments après l’infection (24 h, 48 h, 72 h et 96 h après l’infection) et remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse (comme mentionné à l’étape 2.2). Alternativement, pour la RT-PCR, les pastilles cellulaires sont lysées dans un réactif Trizol (1 mL pour 1 à 3 millions de cellules) (voir le tableau des matériaux). Les cellules remises en suspension dans un tampon de lyse et un réactif Trizol peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.

  1. Immunoblot pour l’analyse des marqueurs UPR.
    1. Maintenir les cellules remises en suspension dans le tampon de lyse sur de la glace pendant 45 min avec un mélange intermittent à l’aide d’un vortex.
    2. Granulez les cellules à 18000 x g pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse à grande vitesse de paillasse (voir le tableau des matériaux). Recueillir le surnageant dans un tube frais.
    3. Quantifiez la concentration en protéines dans chaque échantillon à l’aide de Bradford ou d’un réactif similaire.
    4. Prélever une concentration égale de protéines pour chaque échantillon et préparer les échantillons de protéines dans le tampon Laemmli (tampon 6x : 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10 % SDS, 30 % de glycérol et 0,02 % de bleu de bromophénol ; 5 % de β-Mercaptoéthanol).
      REMARQUE : Pour l’immunotransfert de chaque marqueur UPR, un minimum de 60 à 80 μg de protéines a été utilisé.
    5. Faites bouillir les échantillons de protéines à 96 °C pendant 5 minutes et faites-les tourner brièvement.
    6. Résolvez les échantillons de protéines sur un gel SDS-PAGE à 10 % à 12 % et transférez les protéines sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (voir le tableau des matériaux).
    7. Bloquer avec du lait écrémé en poudre à 5 % ou de l’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 à 2 h, laver deux fois avec du TBST (20 mM Tris pH7,4 et 0,137 M NaCl ; 0,1 % Tween 20) et sonder avec des anticorps primaires spécifiques des protéines contre les marqueurs UPR (voir le tableau des matières) dans un transat, toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, après avoir lavé les tampons deux fois avec du TBST, sondez avec les anticorps secondaires respectifs pendant 1,5 h.
    8. Lavez à nouveau les transferts avec du TBST et visualisez les bandes de protéines à l’aide d’un substrat de détection de chimiluminescence (voir le tableau des matériaux) dans un instrument d’imagerie par transfert Western.
  2. RT PCR
    1. Isolez l’ARN total des cellules à l’aide du réactif Trizol (voir le tableau des matériaux).
    2. Préparez l’ADNc à partir d’une concentration égale d’ARN à l’aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV-RT) (voir le tableau des matériaux).
    3. Analyser la modulation de l’expression de l’ARNm de HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP et GADD34 à l’aide de la qRT-PCR avec des amorces spécifiques au gène (Tableau 2). Préparez brièvement des mélanges réactionnels de 10 μL contenant une matrice d’ADNc (100 ng), 5 μL de colorant SYBR Green (voir le tableau des matériaux) et 10 pmol de chaque paire d’amorces oligonucléotidiques spécifiques du gène. Réglez le volume à l’aide de H2O stérile.
    4. Exécutez les mélanges sur une machine de PCR en temps réel à l’aide du programme suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min et 40 cycles de 95 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de l’analyse de la courbe de fusion. Calculez la variation du pli de l’expression du gène cible par rapport au gène d’entretien (par exemple β-Actine) comme suit :
      Changement de pli = 2-Δ(ΔCT)
      Où ΔCT = CT (cible) − CT (gène d’entretien)
      et Δ(ΔCT) = ΔCT (traité) -ΔCT (témoin)
    5. Pour confirmer davantage l’épissage de XBP1, effectuez une RT-PCR semi-quantitative avec des échantillons non infectés et infectés à 72 heures.
      REMARQUE : L’épissage de l’ARNm XBP-1 est étudié à l’aide de la RT-PCR sur le site d’épissage.
    6. Amplifier l’ADNc avec des amorces XBP1 (Tableau 2) à l’aide d’un master mix PCR haute fidélité (voir Tableau des matières) dans les conditions suivantes : 1 cycle à 98 °C pendant 30 s, suivi de 5 cycles à 98 °C pendant 15 s, 65*Δ-5 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivi de 30 cycles à 98 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis d’une extension finale de 72 °C pendant 10 min et d’un maintien à 4 °C.
    7. Séparez les amplicons sur un gel d’agarose à 2,5 % contenant 50 ng de bromure d’éthidium/mL et visualisez-les dans un instrument de mesure en gel. La bande XBP1 épissée est plus petite de 26 nucléotides.

5. Inactivation des marqueurs UPR et analyse de l’expression des gènes et de la production de virus induites par le VIH-1 LTR

  1. Préparation de constructions shRNA pour l’inactivation de marqueurs UPR
    1. Créer des constructions shRNA à l’aide du squelette du vecteur pLKO.1-TRC (vecteur de clonage lentiviral)29.
    2. Construisez deux constructions shRNA pour chaque gène (IRE1, PERK, ATF6 et HSPA5). Les oligonucléotides sens et antisens ciblant l’ARNm du gène respectif sont conçus par le Consortium ARNi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tableau 3).
      REMARQUE : De la même manière, des constructions shRNA peuvent être faites pour d’autres marqueurs UPR.
    3. Recuit les amorces (100 nM pour l’avant et pour l’arrière) à 95 °C, suivi d’un refroidissement progressif à RT.
    4. Ensuite, ligaturez-le dans les sites Age1 et EcoRI du vecteur pLKO.1 à l’aide d’une ADN ligase T4 (voir Tableau des matériaux). Confirmez la séquence par séquençage de l’ADN.
      REMARQUE : Une construction shRNA ciblant le gène LacZ est utilisée comme contrôle non ciblant.
  2. Inactivation de PERK, ATF6, IRE1 et HSPA5 dans les cellules HEK-293T, dosage de la luciférase et ELISA p24
    1. Préparez un mélange de construction shRNA (0,9 μg) et d’un réactif de transfection comme la polyéthylénimine (PEI) (3 μL de PEI pour 1 μg d’ADN) (voir le tableau des matériaux) dans 50 μL de milieu sans sérum par vortex et incubez pendant 20 min.
    2. À partir d’un confluent de cellules HEK-293T contenant un flacon, trypsiniser et ensemencer ~0,25 x 106 cellules avec le mélange de transfection dans une plaque à 24 puits, ce qui fait le volume total de 125 μL et incuber pendant 6 h à 37 °C dans un incubateur de CO2 . Cette méthode est appelée transfection inverse où les cellules sont ensemencées avec le mélange de transfection.
    3. Après 6 h, ajouter 125 μL de milieu complet dans les puits et remettre les cellules en suspension pour un ensemencement uniforme.
      REMARQUE : Pour les expériences de knockdown, la transfection inverse (étapes 5.2.1-5.2.3) donne une meilleure efficacité avec les shRNA et les siRNA.
    4. Après 24 h, effectuez une deuxième transfection. Préparez un mélange de constructions pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) et pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3 :pLTR-Luc :pEGFPN1-1:1:0.5) avec du PEI (3 μL de PEI pour 1 μg d’ADN) dans 50 μL de milieu incomplet par vortex. Incuber le mélange pendant 20 min à RT. Remplacer le milieu existant par 250 μL de milieu frais incomplet et ajouter le mélange dans les cellules.
      REMARQUE : Un vecteur rapporteur pour le LTR du VIH-1 a été mis au point par sous-clonage du LTR de pU3RIII30,31 dans pGL3basic en laboratoire précédemment32. L’expression de la GFP à l’aide de pEGFP-N1 a été utilisée pour normaliser l’efficacité de transfection32.
    5. Changez le support après 6 h après la transfection avec 500 μL de DMEM complet. Récoltez les cellules après 36 h pour l’immunobuvard et le dosage de la luciférase.
    6. Pour le dosage de la luciférase, granulez les cellules et mettez-les en suspension dans un substrat de luciférase (50 μL) obtenu dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Ajouter le lysat cellulaire remis en suspension dans une plaque opaque à 96 puits et incuber pendant 10-15 min. Obtenez la lecture de la luciférase dans un luminomètre. Mesurez également la fluorescence GFP dans les mêmes échantillons pour normaliser la lecture de la luciférase dans un lecteur de plaques micromodes sur microplaques (Ex : 494 nm, Em : 519 nm).
    7. Tracez le graphique en tant qu’unité de luciférase/GFP sur l’axe Y.
      REMARQUE : L’inactivation des marqueurs UPR respectifs doit être vérifiée, et cela peut être fait par immunoblot ou qRT-PCR en utilisant des anticorps ou des amorces spécifiques au gène, respectivement.
    8. Collectez les surnageants à traiter pour l’ELISA p24 comme mentionné ci-dessus.
  3. Création de cellules stables avec inhibition des marqueurs UPR et de l’infection par le VIH-1.
    1. Préparez les particules de lentivirus en transfectant des cellules HEK-293T ensemences dans une plaque à 6 puits, avec les constructions shRNA respectives (1 μg) ainsi que pMD2.G (vecteur d’enveloppe VSV-G) (0,75 μg) et psPAX2 (plasmide d’emballage lentiviral) (0,25 μg) (voir le tableau des matériaux) en utilisant le PEI dans le rapport 1 μg d’ADN : 3 μL de PEI. Préparez le mélange dans 100 μL de DMEM incomplet et incubez pendant 20 min à RT. Ajoutez le mélange à 1,8 mL de milieu complet dans les cellules HEK-293T ensemencées.
      REMARQUE : Ensemencer les cellules HEK-293T dans une plaque à 6 puits au moins 12 h avant la transfection jusqu’à ce qu’elles acquièrent une morphologie et soient confluentes à environ 60-70 %.
    2. Après 24 h de transfection, ajoutez 1 mL de DMEM complet dans chaque puits.
    3. Recueillir les surnageants après 48 h, les conserver au congélateur à -80 °C et effectuer l’ELISA p24 pour confirmer la présence du virus dans ces surnageants. Utilisez ce surnageant lentiviral brut pour transduire les cellules J6.
    4. Incuber 2 millions de cellules dans une plaque à 6 puits avec un volume égal de surnageant lentiviral (500 μL) pour chaque lentivirus témoin et knockdown spécifique au gène et ajouter un milieu RPMI 1640 complet frais en présence de polybrène (5 μg/mL) pour porter le volume à 2 mL.
    5. Après 24 h, ajouter Puromycine (1 μg/mL) dans chaque puits pour sélectionner des cellules stables. Après avoir ajouté Puromycin, granulez les cellules toutes les 24 h et ajoutez 2 ml de milieu frais avec Puromycin.
    6. Faites-le jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de mort cellulaire (~1 semaine). Les cellules survivantes sont les cellules stables avec l’inactivation génétique souhaitée.
      REMARQUE : L’inactivation des gènes respectifs peut être vérifiée à intervalles réguliers et, enfin, lorsque seules les cellules survivantes sont visibles dans les milieux contenant de la puromycine en utilisant l’immunobuvardage ou la qRT-PCR.
    7. Infecter les cellules knockdown LacZ et spécifiques du gène avec 0,5 MOI de VIH-1 comme décrit dans la rubrique 2 et récolter les cellules 48 heures après l’infection.
    8. Prélever le surnageant de chaque échantillon et traiter p24-ELISA comme décrit précédemment et traiter les cellules pour vérifier le niveau d’inactivation par immunobuvardage.

6. Traitement par inducteur de stress RE et analyse de son effet sur la réplication du VIH-1

REMARQUE : Pour déterminer l’effet de la surstimulation de l’UPR pendant la réplication du VIH-1, la molécule inductrice pharmacologique, la thapsigargin, peut être utilisée.

  1. Détermination du pourcentage de viabilité cellulaire lors du traitement par Thapsigargin.
    REMARQUE : La cytotoxicité de la thapsigargine est déterminée par le réactif MTT (voir tableau des matériaux).
    1. Amorcez de 25 000 à 30 000 cellules CEM-GFP par puits dans une plaque de 96 puits contenant 100 μL de RPMI 1640 complet. Ajoutez 100 nM de Thapsigargin dans le milieu et incubez à 37 °C dans un incubateur.
      REMARQUE : Les cellules traitées avec 1 μL de DMSO ont été prises comme contrôle du véhicule.
    2. Après 48 h, ajouter 10 μL de MTT (5 mg/mL) dans chaque puits et incuber dans l’obscurité pendant 4 h pour la formation de cristaux de formazan à 37 °C avec 5% de CO2.
    3. Après 4 h, dissoudre les cristaux à l’aide de 100 μL d’isopropanol pour former une couleur violette et mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
    4. Calculez le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de l’équation ci-dessous
      % de viabilité cellulaire = (OD570 de contrôle -OD570 de traitement)/OD570 de contrôle x 100
  2. Prétraitement de Thapsigargin et analyse de la progression de l’infection par le VIH-1 par ELISA p24.
    1. Ensemencez 1 million de cellules CEM-GFP dans une plaque de 12 puits contenant 1 mL de RPMI 1640 complet et traitez les cellules avec 100 nM de Thapsigargin ou 1 μL de DMSO (contrôle du véhicule) pendant 12 h dans un incubateur de CO2 maintenu à 37 °C. Après 12 h, laver les cellules avec du RPMI 1640 complet et les infecter avec 0,5 MOI de VIH-1 comme décrit précédemment.
    2. Récoltez les cellules à différents moments, par exemple 24 h, 48 h et 72 h après l’infection, pour l’immunoblottage.
    3. Prélevez les surnageants de chaque échantillon et effectuez l’ELISA p24 comme décrit précédemment.
    4. Tracez le graphique avec la concentration de p24 dans l’échantillon sur l’axe des Y et les points temporels respectifs sur l’axe des X.
    5. À l’aide de l’immunoblotting, analysez l’induction du stress du RE due au traitement à la thapsigargine en mesurant le niveau de tous les marqueurs UPR. Cette étude a utilisé HSPA5 comme marqueur.

7. Essai d’infectiosité TZM-bl β-gal pour déterminer l’effet de l’UPR sur l’infectiosité du virion

REMARQUE : Pour comprendre le rôle de l’UPR dans l’infectiosité du virion, le surnageant issu de l’inactivation ainsi que le traitement à la thapsigargine peuvent être utilisés pour le test d’infectivité TZM-bl β-gal tel que décrit à la section 1.2, sur la base de la concentration p24 déterminée par l’ELISA p24.

  1. Infectez les cellules TZM-bl avec une concentration égale de p24 dans chaque échantillon et effectuez une coloration β-gal. Comptez les cellules infectées bleues au microscope avec un grossissement de 10x pour 5 champs aléatoires.
  2. Faites la moyenne du comptage des 5 champs pour chaque échantillon à partir des étapes ci-dessus.
  3. Calculez le changement de pli comme mentionné ci-dessous :
    Changement de pli = Nombre moyen de cellules bleues dans les échantillons de test/Nombre moyen de cellules bleues dans l’échantillon de contrôle.

Résultats

Dans ce travail, nous avons décrit un protocole détaillé pour étudier in vitro le stress du RE et l’activation de l’UPR lors de l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T (Figure 2). Cette étude décrit également des méthodes d’analyse de la pertinence fonctionnelle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion (Figure 3).

Dans ce but, nous avons analysé le stress du RE causé par l’infection par le VIH-1 en observant les agrégats de protéines à l’intérieur de la cellule par coloration avec de la Thioflavine T. Comme le montre la figure 4A, l’intensité de ThT représente les agrégats de protéines dans les cellules non infectées et infectées. De même, en tant que témoin positif, la figure 4B représente la coloration ThT dans les cellules traitées à la thapsigargin. L’intensité accrue de ThT suggère la présence d’un plus grand nombre d’agrégats de protéines, ce qui est corrélé à un stress accru du RE.

De plus, pour valider cette observation, une méthode plus conventionnelle a été utilisée, qui impliquait l’analyse des marqueurs UPR. L’activation de l’UPR a d’abord été analysée par l’activation des effecteurs primaires -IRE1, ATF6 et PERK. L’activation d’IRE1 a été mesurée en analysant les niveaux de phospho-IRE1 par immunobuvardage des lysats de cellules non infectées et infectées récoltées à différents moments après l’infection, comme le montre la figure 5A. L’augmentation des niveaux de pIRE1/Total IRE1 suggère l’activation de IRE1. De même, l’activation de PERK a été mesurée par les niveaux de phospho-PERK dans les cellules non infectées et infectées (Figure 5B). L’activation d’ATF6 a été quantifiée par le niveau d’expression de la forme ATF6 P50 par immunoblot (Figure 5C). Un autre marqueur important de l’UPR est le régulateur principal et un chaperon ER, HSPA5. Le taux de HSPA5 a également été analysé par immunobuvardage, comme le montre la figure 5D. Un protocole similaire a été suivi pour d’autres marqueurs UPR, tels que sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP et GADD34, en utilisant leurs anticorps spécifiques (figure supplémentaire 1). L’épissage de l’ARNm XBP1 peut être analysé à la fois par RT-PCR quantitative (Fig 5E) et par RT-PCR semi-quantitative. Comme la RT-PCR quantitative n’a pas permis d’identifier spécifiquement l’épissage, elle a été associée au test d’épissage, où la RT-PCR semi-quantitative a été utilisée (figure 5F). Avec le protocole mentionné ci-dessus, nous avons observé que les données qRT-PCR correspondent aux données semi-qRT-PCR. Semblable à la qRT-PCR réalisée pour sXBP1, le protocole a été utilisé pour l’analyse d’autres marqueurs de l’UPR, tels que HSPA5, ATF4, CHOP et GADD34 au niveau de l’ARNm (Figure supplémentaire 2)

Ensuite, pour étudier le rôle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion, nous avons effectué une neutralisation de certains marqueurs de l’UPR : PERK et HSPA5. En utilisant les protocoles mentionnés, nous avons réussi à réduire ces marqueurs à un niveau significatif dans les cellules HEK-293T (Figure 6A) ainsi que dans les cellules J6 (Figure 6B). À l’aide de ces cellules knockdown, nous avons étudié l’effet de l’inactivation de l’activité génique induite par le LTR du VIH-1 (Figure 6A), qui est représentée par le rapport d’expression Luc/GFP dans les échantillons respectifs. La production du virus a été mesurée par l’ELISA p24 du surnageant, comme le montre la figure 6B. L’infectiosité des virions produits peut également être analysée à l’aide du protocole de coloration à l’β-gal de la même manière que celle illustrée à la figure 1A.

De plus, à l’aide d’un inducteur chimique du stress du RE, la thapsigargin, l’effet de la surstimulation de l’UPR sur la réplication du VIH-1, la production de virus et l’infectiosité du virion peut être étudié. La cytotoxicité de la thapsigargine à la concentration donnée a été analysée à l’aide d’un test MTT (figure 7A), qui montre que la cytotoxicité à la concentration souhaitée n’est pas significative. L’immunotransfert pour HSPA5 a été effectué afin d’analyser l’effet du médicament sur le stress du RE (figure 7B). Les résultats montrent qu’un prétraitement de 12 h de Thapsigargin 100 nM a induit l’expression de HSPA5 à des points historiques. L’ELISA p24 montre l’effet sur la production de virus et l’infectiosité des virions produits, qui peuvent être analysés comme décrit précédemment.

figure-results-1
Figure 1 : Quantification de l’infectiosité du virion et analyse de la progression de l’infection. (A) Quantification de l’infectiosité du virion par dosage β-gal basé sur TZM-bl. L’infectiosité du virus a été déterminée en ajoutant 1 ng, 0,1 ng et 0,01 ng du virus aux cellules TZM-bl, suivi d’une coloration à β-gal et d’un comptage du nombre de cellules bleues. Grossissement : 10x. (B) Analyse de la progression de l’infection dans les cellules CEM-GFP infectées par le VIH-1 0,5 MOI sur la base de la capture de l’antigène p24 ELISA des surnageants de culture. Les cellules CEM-GFP ont été infectées par 0,5 MOI de VIH-1, et les surnageants ont été traités pour l’ELISA p24. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. Les astérisques indiquent le niveau de signification, qui est indiqué dans les figures comme ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 et ****=p ≤ 0,0001 tel qu’analysé par le test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Présentation schématique des étapes à suivre pour analyser l’effet de l’infection par le VIH-1 sur le stress du RE et l’UPR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Organigramme des étapes à suivre pour analyser l’effet de l’UPR sur la réplication du VIH-1, la production du virus et l’infectiosité du virion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Analyse du niveau de stress du RE dans les lymphocytes T dus à l’infection par le VIH-1 à l’aide de la coloration ThT. (A) Les cellules CEM-GFP ont été infectées par 0,5 MOI de VIH-1 et récoltées 72 heures après l’infection. Les cellules ont été fixées et colorées avec de la Thioflavin T. L’expression de la GFP indique des cellules CEM-GFP infectées. Le graphique montre l’intensité de la thioflavine T dans le cas de cellules non infectées et infectées par le VIH-1. Les données de ~50 cellules de n = 3 réplicats biologiques sont présentées dans le graphique. (B) Les cellules CEM-GFP ont été traitées avec du DMSO et du TG pendant 12 h. Les cellules ont été fixées et colorées avec de la Thioflavin T. Le graphique montre l’intensité de la thioflavine T dans le cas des cellules traitées au DMSO et au TG. Les données de ~50 cellules de n = 3 réplicats biologiques sont présentées dans le graphique. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. Les astérisques indiquent le niveau de signification, qui est indiqué dans les figures comme ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 et **** = p ≤ 0,0001 tel qu’analysé par le test t de Student. ONU : Non infecté ; IN : Infectés ; TG : Thapsigargin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Analyse de l’expression de différents marqueurs UPR dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1. (A-E) Les cellules CEM-GFP infectées par le VIH-1 (0,5 MOI) ont été récoltées jusqu’au jour 4 toutes les 24 h et ont été traitées pour diverses analyses comme décrit ci-dessous. (A) L’activation d’IRE1 a été analysée par immunotransfert de pIRE1. (B) L’activation de PERK a été analysée par immunobuvardage de pPERK. (C) L’activation d’ATF6 a été analysée par immunobuvardage de la forme ATF6 P50. (D) L’expression de HSPA5 a été analysée par immunoblot HSPA5. (E) L’épissage de XBP1 a été analysé par qRT-PCR de sXBP1 à l’aide d’amorces spécifiques en temps réel. (F) Pour analyser l’épissage de XBP1 par semi-qRT-PCR, l’ARNm de XBP-1 a été amplifié par RT-PCR à travers le site d’épissage, et les bandes ont été visualisées. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. ONU : Non infecté. IN : Infecté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Analyse du rôle de l’UPR sur la réplication du VIH-1 et la production du virus. (A) PERK (panneau de gauche) et HSPA5 (panneau de droite) ont été éliminés dans les cellules HEK-293T, et un test de luciférase a été effectué pour analyser l’activité du gène LTR du VIH-1. Les immunoblots indiquent les niveaux d’inactivation des protéines respectives. (B) PERK (panneau de gauche) et HSPA5 (panneau de droite) ont été éliminés dans les cellules J6, et l’ELISA p24 a été réalisé avec le surnageant collecté pour analyser la production de virus. Les immunoblots indiquent les niveaux d’inactivation des protéines respectives. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. Les astérisques indiquent le niveau de signification, qui est indiqué dans les figures comme ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 et ****=p ≤ 0,0001 tel qu’analysé par le test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Analyse de l’effet de l’inducteur chimique du stress du RE, la thapsigargin, sur la progression de l’infection par le VIH-1. (A) Viabilité cellulaire des cellules CEM-GFP après traitement par 100 nM de thapsigargin. La viabilité cellulaire est analysée par le test MTT. (B) Les cellules CEM-GFP prétraitées avec 100 nM de TG pendant 12 h ont été infectées par 0,5 MOI de VIH-1 et ont été récoltées à 24 h, 48 h et 72 h après l’infection. L’immunoblot montre l’effet de TG sur l’expression de HSPA5, tandis que le graphique montre la production virale telle qu’analysée par l’ELISA p24. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. Les astérisques indiquent le niveau de signification, qui est indiqué dans les figures comme ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 et ****= p ≤ 0,0001 tel qu’analysé par le test t de Student. TG : Thapsigargin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Analyse de l’expression de divers marqueurs en aval de l’UPR. Expression de (A) sXBP1, (B) phosphorylation de eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP et (E) GADD34 analysée par immunoblottage. (A-E) Des cellules CEM-GFP infectées par 0,5 MOI de VIH-1 ont été prélevées 24 h, 48 h, 72 h et 96 h après l’infection et ont été utilisées pour l’immunobuvardage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Analyse de différents marqueurs UPR au niveau de l’ARNm par qRT-PCR. (A-D) Des cellules CEM-GFP infectées par 0,5 MOI de VIH-1 ont été prélevées toutes les 24 h jusqu’au jour 4 et ont été utilisées pour la qRT-PCR de (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP et (D) GADD34. Les barres d’erreur sont affichées sous forme de valeurs moyennes ± S.E. Les astérisques indiquent le niveau de signification, qui est indiqué dans les figures comme ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 et **** = p ≤ 0,0001 tel qu’analysé par le test t de Student. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

ConstruireSéquence d’amorçage 5' à 3'
TEST D’ÉPISSURE XBP1 FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
TEST D’ÉPISSURE XBP1 RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
ÉPISSÉ XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
ÉPISSÉ XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
HAPOT FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
CHOP RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
ACTINE FAGAAAATCTGGCACCACACC
ACTINE RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tableau 2 : Liste des amorces utilisées pour l’analyse RT-PCR. F : En avant ; R : Inverser

Construction shRNASéquence d’amorçage 5' à 3'
AVANTAGE SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
AVANTAGE SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
AVANTAGE SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
AVANTAGE SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTGTGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATGATGATGATATATATAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATGATGATGATGATtatagtatcaatgcgctc
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tableau 3 : Liste des amorces utilisées pour générer des constructions de shRNA. F : En avant ; R : Inverser

Discussion

Le champ d’application du présent protocole comprend (i) la manipulation des stocks de virus VIH-1 et la mesure de la concentration virale et de l’infectiosité du virion, (ii) l’infection des lymphocytes T par le VIH-1 et l’évaluation de son effet sur le stress du RE et différents marqueurs de l’UPR, (iii) l’effet de l’inactivation des marqueurs de l’UPR et leur effet sur l’activité du gène LTR du VIH-1, la production de virus et l’infectiosité du virion et (iv) la surstimulation de l’UPR à l’aide de molécules pharmacologiques et l’analyse de son effet sur la réplication du VIH-1. En utilisant l’ensemble actuel de protocoles, des informations complètes sur l’interaction entre le VIH-1 et l’EPU peuvent être obtenues. Les protocoles énumérés dans cette étude sont faciles à réaliser, rentables et très fiables.

Étant donné que l’UPR est une voie de signalisation sensible au stress, travailler sur cette voie implique des étapes plutôt délicates. Pour toutes les expériences, nous recommandons d’éviter les cellules à long passage afin d’obtenir des résultats cohérents. Il est également important de maintenir des conditions stériles dans toutes les techniques de culture cellulaire afin d’éviter les contaminations bactériennes et de levures, car elles peuvent entraver les expériences et les résultats correspondants. De plus, lors de la manipulation des cellules pendant les expériences, y compris leur culture ultérieure, évitez les modifications de température brutales ou prolongées et assurez-vous que les cellules sont saines et non stressées pour commencer. Sinon, les changements pourraient causer un stress supplémentaire aux cellules, ce qui peut altérer les résultats. Essayez de garder les points temporels aussi fixes que possible, car l’UPR est une voie de signalisation sensible, et un léger changement dans les points temporels peut faire varier les résultats.

La méthode de coloration ThT qui détecte les agrégats de protéines et est utilisée pour déterminer le stress ER22, montre très clairement les niveaux de stress du RE dans les cellules infectées par le VIH-1. La coloration ThT est basée sur la détection d’agrégats de protéines, qui est corrélée au stress RE. Cependant, il convient de noter que l’activation de l’UPR ne peut pas toujours être corrélée avec les agrégats de protéines, car les voies de signalisation individuelles de l’UPR peuvent être activées directement sans l’implication des agrégats de protéines. Ainsi, même si cette méthode de coloration ThT donne une idée des niveaux de stress du RE, pour une analyse approfondie de l’activation de l’UPR, elle doit toujours être validée par une analyse plus poussée des marqueurs UPR. De plus, pour définir davantage la localisation subcellulaire de la coloration ThT, des marqueurs tels que KDEL dans le cas du marquage du RE peuvent être utilisés. De plus, dans de nombreux cas, le stress du RE entraîne un changement de taille et de forme des cellules, de sorte que l’on peut également prendre en compte la surface des cellules lors de la quantification de l’intensité du ThT. La disponibilité d’anticorps commerciaux hautement sensibles, fiables et rentables spécifiques aux gènes a révolutionné de nombreux aspects du domaine des sciences de la vie, permettant une analyse plus facile des niveaux de protéines dans les cellules. De plus, de nos jours, il existe des types d’équipements très sensibles pour visualiser les bandes protéiques sur les transferts et rendre la quantification rapide et plus facile. Ainsi, l’activation des marqueurs UPR peut être facilement analysée par immunoblottage. Cependant, comme l’expression des protéines marqueurs UPR est relativement faible, il est nécessaire d’utiliser une concentration significative de protéines pour analyser leur expression. De plus, la dilution des anticorps primaires doit être optimisée correctement en fonction de l’expression des protéines dans les cellules utilisées afin d’éviter les liaisons non spécifiques et le bruit de fond dans les transferts. De plus, comme le montre le Graphique 4C, l’anticorps ATF6 est polyclonal et donne un certain nombre de bandes non spécifiques. L’optimisation appropriée du lavage et de la concentration d’anticorps est nécessaire pour réduire ces bandes non spécifiques dans une certaine mesure. Les taches doivent être lavées correctement après l’incubation dans une solution bloquante, un anticorps primaire et un anticorps secondaire pour réduire le bruit de fond et les bandes non spécifiques. Lors de la mise au point des transferts, il faut éviter la sursaturation des bandes afin d’obtenir une visualisation correcte du motif dans les résultats obtenus. En ce qui concerne l’objectif général de cet article sur la méthode, nous ne nous sommes pas concentrés sur les méthodes détaillées et le dépannage des techniques générales d’immunobuvardage ; cependant, on peut se référer aux articles de méthode de Mahmood et Yang33 ainsi que Ghosh et al.34 pour la même chose. Étant donné que, de nos jours, la RT-PCR est une méthode très couramment utilisée, les amorces et les machines RT-PCR facilement disponibles fournissent des données pour analyser certains marqueurs UPR. Cependant, des précautions doivent être prises lors de la préparation de l’ARN et de l’ADNc pour la RT-PCR car il s’agit d’une méthode très sensible, et de légères variations dans la qualité des échantillons et du pipetage peuvent entraîner d’énormes variations dans la lecture. Toute contamination par l’ADN ou les protéines doit être éliminée des échantillons d’ARN. De plus, prélevez toujours les échantillons en trois exemplaires pour la qRT-PCR afin de réduire l’erreur de pipetage. La concentration de l’ADN utilisée pour la qRT-PCR doit être optimisée de manière à ce que la valeur CT de chaque échantillon soit inférieure à 30, car tout ce qui dépasse 30 n’est pas considéré comme idéal. Un contrôle négatif doit toujours être conservé pour la qRT-PCR afin d’éviter toute lecture faussement positive. L’épissage de XBP1 peut être analysé à la fois par qRT-PCR et semi-qRT-PCR. Étant donné que la qRT-PCR ne montrerait pas avec précision l’épissage, une semi-qRT-PCR doit toujours être effectuée en dehors de la qRT-PCR pour valider les données et déterminer le rapport relatif entre XBP1 et XBP1 non épissés. Étant donné que la différence entre la taille de XBP1 épissé et non épissé n’est que de 26 nt, un pourcentage plus élevé de gel d’agarose doit être utilisé pour résoudre le gel. De plus, les bandes doivent être résolues en basse tension et de plus longue durée pour une meilleure séparation. Une autre méthode qui est plus populaire de nos jours pour observer l’épissage de XBP1, est le test d’épissage qui utilise le Pst1 digestion enzymatique de restriction de l’ADNc et permet une meilleure visualisation de l’épissage de XBP135. Cette méthode peut également être utilisée afin de visualiser l’épissage de XBP1 dans des échantillons infectés par le VIH-1. Les résultats obtenus par immunobuvardage et RT-PCR peuvent être utilisés pour valider les résultats de coloration ThT.

Les résultats représentatifs présentés à la figure 5 suggèrent que l’activation de l’UPR lors de l’infection par le VIH-1 est corrélée à la coloration ThT améliorée montrée à la figure 4. Cependant, les limites de l’utilisation de l’immunobuvardage et de la RT-PCR pour analyser l’UPR sont qu’elles sont rigoureuses et qu’il faut surveiller plusieurs produits géniques, car les gènes individuels de l’UPR peuvent être modifiés indépendamment par des facteurs de stress non RE. De plus, ces méthodes mesurent indirectement le stress du RE en examinant les différents marqueurs UPR. C’est pourquoi la coloration ThT et l’analyse des marqueurs UPR par immunoblot et RT-PCR peuvent être utilisées ensemble pour analyser l’effet de l’infection par le VIH-1 sur le stress du RE et l’activation de l’UPR dans les lymphocytes T.

La deuxième partie de cet article traite des protocoles impliqués dans la compréhension de l’impact de l’EPU sur la réplication du VIH-1. La méthode de transfection inverse utilisée pour l’inactivation des marqueurs UPR décrite dans cet article s’est avérée entraîner une réduction significative de l’expression des marqueurs UPR. Comme mentionné dans le protocole, la fluorescence GFP a été utilisée pour normaliser la lecture de la luciférase pour le dosage de la luciférase. Cependant, dans de nombreux cas, la lecture de la GFP peut également être affectée en raison de la transfection génique spécifique36, donc dans ce cas, on peut utiliser d’autres marqueurs fluorescents tels que RFP, YFP ou la concentration totale en protéines pour normaliser la lecture de la luciférase. De plus, dans certains cas où les cellules sont difficiles à lyser, comme les cellules TZM-bl, un réactif de lyse supplémentaire peut être ajouté avant d’ajouter le substrat de la luciférase. Comme le montrent les résultats, les résultats de la luciférase (Graphique 6A Panneau de gauche) avec les résultats ELISA p24 dans le cas de PERK (Graphique 6B Panneau de gauche), où l’inactivation de PERK réduit considérablement l’activité du gène VIH-1 et la production de virus. Alors que dans le cas de HSPA5, l’inactivation de HSPA5 n’affecte pas l’activité génique induite par LTR (Graphique 6A panneau de droite) selon les résultats de l’essai de luciférase, tandis qu’il affecte la production du virus selon l’ELISA p24 (Graphique 6B Panneau de droite). De cette façon, ces résultats suggèrent que différents marqueurs UPR peuvent avoir des effets différents sur l’activité génique induite par le LTR du VIH-1 et la production de virus. L’antigène p24 mesuré dans le surnageant par ELISA est principalement indicatif de la concentration de particules virales libérées dans le surnageant de culture. Ainsi, les chercheurs ont régulièrement utilisé les résultats de l’ELISA de capture de l’antigène p24 comme indication indirecte de la production de virus dans le surnageant cellulaire37. Ainsi, le dosage de la luciférase dans les cellules et l’ELISA p24 du surnageant peuvent être utilisés ensemble pour déterminer l’effet sur l’activité du gène LTR du VIH-1 et la production du virus. De plus, ce protocole peut être utilisé pour analyser l’effet d’autres marqueurs UPR sur l’activité des gènes induits par le LTR du VIH-1 et la production de virus en utilisant des shRNA spécifiques aux gènes. Pour toutes les expériences impliquant des lectures de l’ELISA p24 et du dosage de la luciférase, il est important de s’assurer que les dilutions et le temps d’incubation appropriés sont maintenus et que les valeurs entrant dans la catégorie des valeurs aberrantes ne doivent pas être prises en compte. Par exemple, lors de l’exécution de p24 ELISA, un OD450 Une valeur comprise entre 0,1 et 2 est considérée comme idéale. La deuxième approche pour étudier le rôle de l’UPR dans la réplication du VIH-1 est l’utilisation de molécules pharmacologiques telles que la Thapsigargin, un inducteur de stress du RE ou le TUDCA, un inhibiteur du stress du RE. Ces médicaments sont très couramment utilisés pour étudier l’UPR dans divers contextes38,39,40,41. Dans cet article, nous avons démontré le protocole de traitement à la thapsigargine et analysé son effet sur la progression de l’infection par le VIH-1 dans les lymphocytes T. Avant d’utiliser le médicament pour toute expérience, il est fortement recommandé de tester la viabilité cellulaire pour une gamme de doses pour le médicament dans la lignée cellulaire à utiliser. La concentration qui donne moins de ~80% de viabilité cellulaire dans la lignée cellulaire donnée doit être évitée. De plus, pour les tests de viabilité cellulaire, des cellules saines doivent toujours être prélevées, car les cellules déjà stressées ne montreront pas la bonne lecture, et les débris cellulaires peuvent créer de la turbidité et donner de fausses lectures. Le protocole mentionné dans cette étude montre l’effet de la thapsigargine sur la réplication virale plus de 72 heures après l’infection, ce qui permet de mieux comprendre l’effet du médicament sur la réplication virale au cours d’une période donnée. On peut également prendre des intervalles de temps plus courts tels que 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection pour analyser plus en détail le moment le plus précoce où le médicament commence à montrer son effet sur la réplication virale.

Étant donné que l’UPR est également impliqué dans la dégradation des protéines et la dynamique membranaire42,43, il est possible que l’UPR puisse jouer un rôle dans l’infectiosité des virions. L’infectiosité des virions produits par les cellules peut également être analysée à l’aide du protocole donné. Les protocoles mentionnés ci-dessus peuvent également être utilisés pour déterminer l’effet de l’infection par le VIH-1 sur le stress du RE et l’UPR et sa pertinence fonctionnelle dans les PBMC humains pour des études plus pertinentes sur le plan biologique. Il est essentiel de comprendre la fonction de l’ER-UPR dans l’infection par le VIH-1 en raison de la prise de conscience croissante de son implication dans le développement de nombreuses maladies graves. Les informations obtenues à l’aide de cet ensemble de méthodes s’ajouteront à ce domaine inexploré en offrant une compréhension importante de l’interaction entre le VIH-1 et l’EPU.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions le Centre national des sciences cellulaires, Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde, pour son soutien intra-muros. AT et AD sont reconnaissants du soutien à la recherche doctorale reçu du Centre national des sciences cellulaires, Département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde. DM est reconnaissant pour la bourse nationale JC Bose du SERB, gouvernement de l’Inde.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcrylamamideBiorad, États-Unis1610107
AgaroseG-Biosciences, États-UnisRC1013
Persulfate d’ammoniumSigma-Aldrich, États-UnisA3678
Anticorps anti-ATF4Technologie de signalisation cellulaire, États-Unis11815Détection par transfert Western Dilution-1:1000
Anticorps anti-ATF6Abcam, Royaume-Uniab122897Détection par transfert Western Dilution-1:1000
Anticorps anti-CHOPCell Signaling Technology, États-Unis2897Détection par transfert Western Dilution-1:1000
anticorps anti-eIF2&alphaSanta Cruz Biotechnology, États-Unissc-11386Détection par transfert Western Dilution-1:2000  ;
anticorps anti-GADD34Abcam, Royaume-Uniab236516Détection par transfert Western Dilution-1:1000
Anticorps anti-GAPDHSanta Cruz Biotechnology, États-Unissc-32233Détection par transfert Western Dilution-1:3000  ;
anticorps anti-HSPA5Technologie de signalisation cellulaire, États-Unis3177Détection par transfert Western Dilution-1:1000
Anticorps anti-IRE1Technologie de signalisation cellulaire, États-Unis3294Détection par transfert Western Dilution-1:2000
Anticorps conjugué HRP anti-souris  ;Biorad, États-Unis1706516Détection par transfert Western Dilution - 1:4000
anticorps anti-peIF2&alphaInvitrogen,États-Unis 44-728GDétection par transfert Western Dilution - 1:1000
Anticorps anti-PERKTechnologie de signalisation cellulaire, États-Unis5683Détection par transfert Western Dilution-1:2000
Anticorps anti-pIRE1Abcam, Royaume-Uniab243665Détection par transfert Western Dilution - 1:1000
anticorps anti-pPERKInvitrogen, États-UnisPA5-40294 Détectiontransfert Western Dilution-1:2000
Anticorps conjugué anti-rabbit HRPBiorad, États-Unis1706515Détection par transfert Western Dilution - 1:4000
Anticorps anti-XBP1Abcam, Royaume-Uniab37152Détection par transfert Western Dilution-1:1000
Centrifugeuse à grande vitesse de paillasseEppendorf, États-Unis5804RRotor - F-45-30-11
Centrifugeuse de paillasse à basse vitesseEppendorf, États-Unis5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, États-Unis1610201
Albumine sérique bovine (BSA)MP biomedicals, États-Unis160069
Réactif BradfordBiorad, États-Unis5000006
CalPhos mammalian Kit de transfectionClontech, Takara Bio, États-Unis631312Stock de virus préparation
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, USA3655
Substrat Clarity ECLBiorad, USA1705061substrat de détection de chimiluminescence
Substrat Clarity max substrat ECLBiorad, USA1705062substrat de détection de chimiluminescence
Microscope confocal à balayage laserOlympus, JaponModèle :FV3000
CentrifugeuseCytospin Thermo Fisher Scientific, États-UnisASHA78300003
DMEMInvitrogen, États-Unis11995073
DMSOSigma-Aldrich, États-UnisD2650
dNTPsPromega, États-UnisU1515
DTTInvitrogen, États-UnisR0861
EDTAInvitrogen, États-Unis12635
EtBrInvitrogen, États-Unis15585011
sérum de veau fœtalInvitrogen, États-Unis16000044
G418Invitrogen, États-Unis11811023
Glutaraldéhyde 25 %Sigma-Aldrich, États-UnisG6257Essai d’infectiosité
GlycineThermo Fisher Scientific, États-UnisQ24755
HEK-293TNCCS, Inde
VIH-1 infectieux Clone moléculaire pNL4-3NIH, AIDS Repository, USA114
Microscope inverséNikon, JaponModèle : Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, USA1715124
Jurkat J6NCCS, Inde
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich, USAM8266Infectiosité dosage
MMLV-RT  ;Invitrogen, États-Unis28025013
Réactif MTTSigma-Aldrich, États-UnisM5655Essai de viabilité cellulaire
N,N-diméthyl formamideFluka Chemika40255Essai d’infectiosité
NaClThermo Fisher Scientific, États-UnisQ27605
NaFSigma-Aldrich, États-Unis201154
NP40Invitrogen, États-Unis85124
Kit ELISA de capture d’antigène P24ABL, États-Unis5421
Échelle de protéines pré-colorées PageRulerSci-fi Biologicals, IndePGPMT078
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich, États-UnisP6148
pEGFP-N1Clontech, États-Unis632515
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen, États-Unis151140122
Inhibiteur de la phosphataseSigma-Aldrich, États-Unis4906837001
Phusion Mastermix PCR haute fidélité avec tampon GCNEB, États-UnisM05532
pLKO.1-TRCAddgene, États-Unis10878Vecteur de clonage lentiviral
pMD2.GAddgene, États-Unis12259Vecteur d’enveloppe VSV-G
PMSFSigma-Aldrich, États-UnisP7626
Polyéthylénimine (PEI)  ;Polysciences, Inc., États-Unis23966
Ferricyanure de potassiumSigma-Aldrich, États-Unis244023Essai d’infectivité
Ferrocyanure de potassiumSigma-Aldrich, États-UnisP3289Essai d’infectiosité
Inhibiteur de protéaseSigma-Aldrich, États-Unis.
psPAX2Addgene, États-Unis12260Plasmide d’emballage lentiviral
PuromycineSigma-Aldrich, États-UnisP8833Sélection de cellules stables
Membrane PVDFBiorad, États-Unis1620177
Amorces aléatoiresInvitrogen, États-Unis48190011
RPMI 1640Invitrogen, États-Unis22400105
SDSSigma-Aldrich, États-UnisL3771
Substrat Steady-GloPromega, États-UnisE2510Essai luciférase
T4 ADN ligaseInvitrogen, États-Unis15224017
TEMEDInvitrogen, États-Unis17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, États-UnisT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, États-Unis596200
TrisThermo Fisher Scientific, États-UnisQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, États-UnisT8787
TrizolInvitrogen, États-Unis15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, États-UnisP1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, États-Unis8129
UltracentrifugeuseBeckman Optima L90K, États-Unis330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen,États-Unis 15520-018Essai d’infectiosité
par 5056489001

Références

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

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Mots-clés

Infection des lymphocytes Tcoloration la thioflavine Tmarqueurs de l UPRimmunotransfertRT PCRessai rapporteur lucif raseELISA p24
Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1
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