Évaluation en temps réel du Ca2+ absolu, cytosolique, libre et de la contractilité correspondante dans les vaisseaux lymphatiques isolés et pressurisés

Résumé

Ce protocole décrit une méthode permettant de mesurer simultanément le calcium cytosolique, libre [Ca²⁺]_i et le diamètre des vaisseaux dans les vaisseaux lymphatiques en contraction en temps réel, puis de calculer les concentrations absolues de Ca²⁺ ainsi que les paramètres de contractilité/rythmicité. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le Ca²⁺ et la dynamique contractile dans diverses conditions expérimentales.

Résumé

Le système vasculaire lymphatique, aujourd’hui souvent appelé « troisième circulation », est situé dans de nombreux systèmes d’organes vitaux. L’une des principales fonctions mécaniques du système vasculaire lymphatique est de renvoyer le liquide des espaces extracellulaires vers les canaux veineux centraux. Le transport lymphatique est médié par des contractions rythmiques spontanées des vaisseaux lymphatiques (VG). Les contractions du VG sont largement régulées par la montée et la descente cycliques du calcium libre cytosolique ([Ca²⁺]_i).

Cet article présente une méthode permettant de calculer simultanément les changements dans les concentrations absolues de [Ca²⁺]_i et la contractilité/rythmicité des vaisseaux en temps réel dans les VG isolés et pressurisés. En utilisant des VG mésentériques de rat isolés, nous avons étudié les changements de [Ca²⁺]_i et de contractilité/rythmicité en réponse à l’ajout de médicament. Des VG isolés ont été chargés avec l’indicateur de détection ratiométrique Ca²⁺ Fura-2AM, et la microscopie vidéo couplée à un logiciel de détection des bords a été utilisée pour capturer les mesures de [Ca²⁺]_i et de diamètre en continu et en temps réel.

Le signal Fura-2AM de chaque BT a été calibré sur le signal minimum et maximum pour chaque navire et utilisé pour calculer le [Ca²⁺]_i absolu. Les mesures de diamètre ont été utilisées pour calculer les paramètres contractiles (amplitude, diamètre diastolique fin, diamètre systolique fin, débit calculé) et la rythmicité (fréquence, temps de contraction, temps de relaxation) et corrélées avec les mesures absolues [Ca²⁺]_i .

Introduction

Le système vasculaire lymphatique se trouve dans de nombreux systèmes organiques, notamment le cerveau, le cœur, les poumons, les reins et le mésentère 1,2,3,4,5,6, et fonctionne en propulsant le liquide (lymphe) des espaces interstitiels vers les canaux veineux centraux pour maintenir l’homéostasie du fluide 7,8,9,10 . Cela commence par des capillaires lymphatiques à extrémité aveugle dans les lits capillaires vasculaires qui se drainent dans les vaisseaux lymphatiques collecteurs (VG). Les VG collecteurs sont constitués de deux couches de cellules : une couche de cellules endothéliales englobée par une couche de cellules musculaires lymphatiques (LMC)^10,11. Le transport du liquide lymphatique est réalisé à la fois par des forces extrinsèques (par exemple, la formation de nouvelles lymphes, des pulsations artérielles, des fluctuations de la pression veineuse centrale) et des forces intrinsèques¹².

La force intrinsèque du transport lymphatique est la contraction rythmique spontanée des VG collecteurs, qui est au centre de la majorité des études portant sur la fonction lymphatique. Cette pompe lymphatique intrinsèque est principalement régulée par la montée et la descente cycliques du Ca²⁺ libre cytosolique ([Ca²⁺]_i). La dépolarisation spontanée de la membrane plasmique dans les LMC active les canaux Ca²⁺ (Ca_v1.x) voltage-dépendants, déclenchant l’influx de Ca²⁺ et la contraction rythmique VG ^8,9,10. Ce rôle a été démontré en bloquant Ca_v1.x avec des agents spécifiques, comme la nifédipine, qui inhibe les contractions du VG et provoque une dilatation des vaisseaux^13,14. L’augmentation transitoire de [Ca²⁺]_i ou « pic Ca²⁺ » dans les LMC médiée par les canaux Ca_v1.x peut également mobiliser les réserves intracellulaires de Ca²⁺ en activant les récepteurs de l’inositol triphosphate (IP₃) et des récepteurs de la ryanodine (RyRs) sur le réticulum sarcoplasmique (SR)15,16,17,18. Les preuves actuelles suggèrent que les récepteurs IP₃ contribuent davantage au Ca²⁺ nécessaire aux contractions normales du VG par rapport à^{RyRs 15,16,19,20,21} ; cependant, les RyR peuvent jouer un rôle au cours d’une pathologie ou en réponse à une intervention pharmaceutique^17,18. De plus, l’activation des canaux K^{+ 22} activés par Ca²⁺ et des canaux potassiques sensibles à l’ATP (K_ATP)^23,24 peut hyperpolariser la membrane LMC et inhiber l’activité contractile spontanée.

Il existe de nombreux autres canaux ioniques et protéines qui peuvent réguler la dynamique du Ca²⁺ dans la collecte des VG. Il est important d’utiliser des méthodes pour étudier les changements du Ca²⁺ et de la contractilité des vaisseaux en réponse aux agents pharmacologiques en temps réel pour comprendre ces régulateurs potentiels. Une méthode antérieure utilisant Fura-2 pour mesurer les variations relatives du VG [Ca²⁺]_i a été décrite²⁵. Étant donné que la constante de dissociation pour Fura-2 et Ca²⁺ est connue²⁶, il est possible de calculer les concentrations réelles de Ca²⁺, ce qui élargit l’application de cette méthode et fournit des informations supplémentaires sur la signalisation Ca²⁺ , l’excitabilité membranaire et les mécanismes de contractilité²⁷, tout en permettant des comparaisons de base entre les groupes expérimentaux. Cette dernière approche a été utilisée dans les cardiomyocytes²⁸ et peut donc être adaptée aux VG. Cet article présente une méthode améliorée qui combine ces deux approches pour mesurer et calculer les changements de [Ca²⁺]_i absolu ainsi que la contractilité/rythmicité des vaisseaux en continu et en temps réel dans les VG isolés et pressurisés. Nous fournissons également des résultats représentatifs pour les VG traités avec de la nifédipine.

Protocole

Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de neuf à 13 semaines ont été achetés auprès d’un vendeur commercial. Après leur arrivée, tous les rats ont été logés et maintenus dans les installations de la Division de la médecine des animaux de laboratoire (DLAM) de l’Université de l’Arkansas (UAMS) avec un régime de laboratoire standard et exposés à 12 h de cycle lumière/obscurité à 25 ^°C. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé #4127 par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’UAMS.

1. Dissection et canulation des VG mésentériques

REMARQUE : Il est important de mettre en place la chambre de perfusion avant l’isolement des VG mésentériques pour s’assurer qu’il n’y a pas d’interruption du débit ou de fuite qui perturberait l’expérience.

1. Préparation du bain de perfusion
   1. Achetez des micropipettes en verre borosilicaté (diamètre extérieur de 1,2 mm, diamètre intérieur de 0,68 mm et tirées à un diamètre de pointe extérieur de 75 à 100 μm) auprès d’un vendeur commercial. Coupez et polissez les micropipettes (c’est-à-dire les canules) à environ 1 à 2 cm de longueur pour les monter dans la chambre de perfusion du récipient isolé.
   2. Connectez chaque canule en verre montée dans la chambre de perfusion du récipient à des transducteurs de pression indépendants situés en ligne avec des régulateurs de pression indépendants alimentés par gravité à l’aide d’un tube en polyéthylène.
      REMARQUE : Cela permet une manipulation indépendante des pressions d’entrée et de sortie en fonction de la conception de l’étude. La figure 1 illustre cette configuration en détail.
   3. Remplissez la chambre de perfusion (5 mL), les micropipettes en verre et le régulateur de pression indépendant alimenté par gravité avec un tube de polyéthylène avec une solution saline physiologique (PSS ; 119 mM NaCl ; 24 mM NaHCO₃ ; 1,17 mM NaH₂PO₄ ; 4,7 mM KCl ; 1,17 mM MgSO₄ ; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (glucose) ; 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA) ; et 1,6 mM CaCl₂) dépourvu de bulles d’air. Ensuite, clampez la pression pour que les canules ne soient pas pressurisées.
      REMARQUE : Le pH de cette solution est de ~7,5. Un pH de 7,4 est maintenu dans le bain de perfusion en utilisant des bulles de CO₂ pour agir sur le système tampon de bicarbonate dans le PSS, comme décrit à l’étape 1.3.7. L’EDTA est utilisé ici pour chélater les ions Ca²⁺ en excès.
2. Préparation des nœuds
   1. Faites des nœuds doubles au microscope à l’aide de fil de suture en soie tressé (taille 8-0). Les principales étapes sont illustrées à la figure 2.
      1. Séparez un seul filament.
      2. Utilisez deux pinces Dumont #5 avec des pointes micro-émoussées et à l’aide d’une pince, faites une double boucle autour de la pointe de l’autre pince.
      3. Avec la pince à boucle, saisissez l’extrémité libre de la suture et tirez-la à travers les deux boucles en veillant à ne pas fermer complètement le nœud et en laissant une petite ouverture.
      4. Utilisez des ciseaux à ressort Vanna pour couper l’excès de suture de chaque côté. Utilisez ces nœuds plus tard pour fixer le VG sur les canules.
         REMARQUE : N’utilisez pas les mêmes pinces que celles avec lesquelles vous allez disséquer ou canuler, car il y a plus de risque d’endommager les pointes des pinces pendant le nouage.
3. Isolement et canulation des VG mésentériques
   1. Anesthésier profondément les animaux en leur administrant un isoflurane à 5% avec un surdosage de 1,5 L/min d’O2 et exsanguler par décapitation.
   2. Isolez des mésentères entiers pour la dissection des VG mésentériques en faisant d’abord une coupe dans le sens de la longueur le long de la ligne médiane de la paroi abdominale, en extériorisant le mésentère, puis en coupant la connexion juste en dessous du sphincter pylorique et à ~2-3 cm au-dessus du cæcum ainsi que la connexion au rectum.
   3. Lavez les mésentères entiers disséqués dans 200 mL de PSS glacé, puis transférez-les dans une boîte de Petri (100 mm) doublée de silicone (8-10 mm) contenant du PSS glacé.
   4. Disséquez les VG mésentériques de deuxième ordre de la graisse et du tissu conjonctif environnants à l’aide d’un stéréomicroscope, d’une pince fine Dumont #5 Inox et de ciseaux à ressort Vanna. Pour aider à identifier les extrémités des VG une fois retirées du tissu, laissez un petit morceau de graisse sur l’extrémité proximale du VG.
   5. Transférez les VG disséqués dans la chambre de perfusion du vaisseau pour la canulation sur des canules en verre.
   6. Utilisez deux pinces fines Dumont #5 Inox pré-affûtées, pointe droite (0,05 x 0,01 mm) pour canuler les VG avec l’extrémité distale du VG sur la canule P1 (entrée) et l’extrémité proximale du vaisseau sur la canule P2 (sortie) pour imiter la direction de l’écoulement lymphatique.
      REMARQUE : Les canules P1 et P2 sont identiques et ne diffèrent que par l’extrémité du VG qui est connectée. Il est important d’utiliser des pinces qui se rejoignent parfaitement à la pointe et sans dommage pour faciliter la saisie de la paroi mince du vaisseau.
      1. Glissez un seul nœud pré-noué sur chaque canule en verre pour fixer plus tard le récipient sur les canules.
      2. En utilisant le petit morceau de graisse pour aider à orienter la direction VG, canulez d’abord l’extrémité distale sur P1.
      3. Faites glisser le nœud le long de la canule et serrez pour fixer le LV. Assurez-vous de ne pas trop serrer et casser l’extrémité de la canule.
      4. Pressurisez le VG à 4-5 mm Hg dans la chambre de perfusion.
         REMARQUE : Pour nos besoins, nous définissons la pression P1 et P2 pour qu’elles soient égales ; Cependant, selon les conditions expérimentales, la pression peut être ajustée à chaque canule pour induire une contrainte de cisaillement ou un reflux.
      5. Répétez les étapes 1.3.6.1 à 1.3.6.4 pour canuler l’extrémité proximale du VG sur P2.
   7. Placez la pierre bouillonnante avec 7 % de dioxyde de carbone (CO₂) / 93 % d’oxygène (O₂) dans la chambre du bain pour maintenir le pH physiologique.
   8. Raccordez la chambre au régulateur de température et réglez-la à 37 ^°C pour que les VG s’équilibrent et développent des contractions stables et spontanées (environ 30 min).
      REMARQUE : la figure 1 illustre cette configuration en détail.

2. Mesure des concentrations absolues de [Ca²⁺]_i dans les VG

1. Coloration Fura-2AM des VG canulés
   1. Après l’apparition de contractions spontanées (à partir de l’étape 1.3.8), incuber les VG avec de l’ester de Fura-2-acétoxyméthyle (Fura-2AM ; 2 μM ou 10 μL/5 mL) et de l’acide pluronique (PA ; 0,02 % P/V ou 5 μL/5 mL de 20 % PA) pendant 30 min dans l’obscurité.
      REMARQUE : Après l’ajout de Fura-2AM, toutes les étapes restantes doivent être effectuées dans l’obscurité.
   2. Après 30 min, remplacer la solution dans la chambre de perfusion 3 fois en vidant tout le volume du bain avec un vide à pression négative, en le remplaçant par du PSS sans réactif adapté à la température (37 ^°C).
      REMARQUE : Cela doit être fait rapidement pour minimiser le temps pendant lequel le VG est en suspension dans l’air. Utilisez les deux mains, par exemple, la main droite pour le vide et la main gauche pour le remplacement du nouveau PSS sans réactif.
   3. Après le lavage, incubez les LV pendant 15 min dans l’obscurité pour éliminer l’excès d’indicateur et permettre la désestérification.
2. Capturer le Ca²⁺ fluorescence et diamètre du vaisseau
   1. Transférez la chambre sur la platine de microscope à fluorescence inversée équipée d’une source lumineuse LED, d’un objectif S Fluor 20x, d’un adaptateur de cadre de cellule et d’un système de caméra vidéo CMOS rapide, qui permet une capture de fluorescence image par image à 15 Hz.
      REMARQUE : La figure 3 présente un schéma de cette configuration de flux de travail. Le signal Ca²⁺ peut être capturé à l’aide d’une caméra CCD avec au moins 15 ips.
   2. Connectez le microscope à l’ordinateur équipé d’un logiciel d’imagerie pour enregistrer la fluorescence et la détection des bords.
      REMARQUE : Le logiciel référencé permet également l’enregistrement simultané de la pression ; Cependant, cela n’est pas inclus ici.
   3. Allumez la source lumineuse LED et l’interface du système fluorescent.
      REMARQUE : Les instructions logicielles décrites ici concernent les logiciels référencés, mais d’autres logiciels peuvent être utilisés pour obtenir ces données.
   4. Ouvrez le logiciel (IonWizard).
   5. Sous l’onglet Fichier , sélectionnez Nouveau.
   6. Sous l’onglet Collecter , sélectionnez Test.
   7. Chargez le modèle expérimental souhaité et cliquez sur OK.
      REMARQUE : Vous devrez mettre en place un modèle expérimental avec les paramètres à mesurer. Les instructions pour la configuration du modèle se trouvent dans le manuel du logiciel²⁹.
   8. Ajustez les traces à l’écran pour afficher le diamètre du récipient, le numérateur (signal 340), le dénominateur (signal 380) et le rapport dans l’ordre décroissant.
   9. Ajustez l’échelle de l’axe Y si nécessaire pour faciliter la visualisation des traces.
      1. Sous Traces, sélectionnez Modifier les limites d’utilisateurs. Assurez-vous que l’option Limites automatiques n’est pas cochée.
      2. Sélectionnez le paramètre que vous souhaitez ajuster, entrez les valeurs minimale et maximale de l’axe, puis sélectionnez OK.
   10. Pour commencer l’expérience, cliquez sur DÉMARRER (en bas de l’écran).
   11. Pour mesurer simultanément le diamètre des VG, utilisez le logiciel de détection des bords intégré au système d’imagerie, qui génère des traces contractiles de VG à 3 Hz. Utilisez ces mesures pour analyser les paramètres contractiles et rythmiques décrits dans la section 3 et illustrés à la figure 4.
       1. Assurez-vous d’ajuster l’éclairage de manière à ce que le mur LV apparaisse sous forme de lignes sombres.
       2. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) dépourvue de graisse et de débris. Une fois l’expérience lancée, ne déplacez pas ce ROI.
       3. Assurez-vous que le seuil est réglé de manière à ce que le bord de la paroi du vaisseau soit détecté tout au long du cycle de contraction.
   12. Pour les mesures de fluorescence, allumez le tube photomultiplicateur (PMT).
   13. Excitez Fura-2, un indicateur ratiométrique, en alternant les longueurs d’onde de 340 et 380 nm lors d’expositions de 50 ms à l’aide d’illuminateurs LED, et capturez les spectres d’émission à 510 nm à 15 Hz sur l’ensemble du champ d’imagerie.
       REMARQUE : Il est important de garder tous les paramètres optiques (paramètres d’excitation, filtres d’émission, lentille d’objectif et miroirs dichroïques) identiques pour toute une série d’expériences afin d’obtenir des mesures de Ca²⁺ reproductibles.
   14. Mesurez le rapport signal/bruit de fond en obtenant d’abord les fluorescences 340 et 380 avec le BT au milieu du champ de vision (signal) puis, à l’aide des manipulateurs de platine, déplacer le champ de vision vers le bord du bain sans récipient (en prenant soin d’éviter le bord doublé de silicone et/ou en enlevant tout débris du bain) pour capturer l’arrière-plan.
       REMARQUE : Il est important de revenir à la section d’origine du récipient à chaque fois pour les mesures Ca²⁺ .
   15. Remplacez la solution de bain par du PSS sans réactif de température adaptée pour éliminer l’indicateur en excès dans le bain. Il peut falloir plusieurs changements de bain pour éliminer l’excès de Fura-2, alors répétez cet échange jusqu’à ce que le rapport signal/bruit de fond soit d’environ 10:1.
   16. Enregistrer le signal de fluorescence Fura-2 de base et les contractions spontanées pendant environ 30 minutes, suivis d’une réponse de concentration cumulative de nifédipine (NIF ; 0,1-100 nM), un antagoniste Ca_v1,x dépendant de la tension. Obtenez des mesures de fond pour chaque concentration de médicament.
   17. À la fin de chaque expérience, laver les VG avec du PSS sans Ca²⁺ adapté à la température pour obtenir le signal de fluorescence Fura-2 minimum (R_min) et le diamètre maximal des VG en l’absence de Ca²⁺. Assurez-vous de mesurer l’arrière-plan.
       REMARQUE : Le PSS sans Ca²⁺ a la même composition que le PSS mais sans CaCl₂, et l’EDTA est remplacé par 1 mM d’EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~7,5).
   18. Remplacez la solution de bain par un PSS adapté à la température contenant 10 mM de Ca²⁺ et de l’ionomycine (10 μM IONO), un ionophore de Ca²⁺ , pour obtenir le signal de fluorescence Fura-2 maximal (R_max) et le diamètre minimum des VG dans des conditions de saturation de Ca²⁺. Assurez-vous de mesurer l’arrière-plan.
3. La formule de mesure absolue [Ca²⁺]_i
   1. Utilisez R_min et R_max pour calibrer le rapport des longueurs d’onde de 340 et 380 nm et calculer la concentration absolue de Ca²⁺ sans cytosolique ([Ca²⁺]_i).
   2. Calculer la concentration absolue de Ca²⁺ cytosolique libre ([Ca²⁺]_i) à l’aide de l’équation (1)²⁶ :
      (1)
      Où K_d = 225 nM (constante de dissociation pour Fura-2)²⁶, R = rapport 340/380, R_min = rapport 340/380 en l’absence de Ca²⁺, R_max = rapport 340/380 avec des conditions de saturation de Ca²⁺, S_libre = 380 signal en l’absence de Ca²⁺, S_lié = 380 signal avec des conditions de saturation de Ca²⁺
      REMARQUE : Tous les signaux fluorescents ont été corrigés pour la fluorescence de fond.
   3. La figure 5 est un exemple de trace Ca²⁺ détaillant les paramètres enregistrés. Définissez la ligne de base Ca²⁺ comme le Ca²⁺ au repos le plus bas avant le pic Ca²⁺ et le pic Ca²⁺ comme le Ca²⁺ le plus élevé atteint pendant le pic Ca²⁺ . L’amplitude est la différence entre le pic et la ligne de base Ca²⁺. Exportez tous les paramètres directement depuis le logiciel d’imagerie, à l’exception de la fréquence des pointes de Ca²⁺ qui doit être calculée hors ligne comme le nombre de pointes de Ca²⁺ /s. Vous trouverez ci-dessous les étapes clés au sein du logiciel référencé pour obtenir ces paramètres.
      REMARQUE : Des traces entières peuvent être exportées dans un fichier .txt et tous les paramètres peuvent être analysés ou calculés dans le logiciel de votre choix.
   4. Pour R_min, mettez en surbrillance la section de la trace du numérateur qui correspond à l’arrière-plan pendant le PSS sans Ca²⁺. Une boîte de dialogue s’ouvre et fournit les valeurs de cette partie de la trace.
   5. Sous Opérations, sélectionnez Constantes.
   6. Sélectionnez Arrière-plan Calcium-Numérique et entrez les numéros d’arrière-plan pour le numérateur et le dénominateur de l’étape précédente. Cliquez sur OK.
   7. Mettez en surbrillance la section de la trace Ratio qui correspond au ratio le plus bas pendant le PSS sans Ca²⁺. Il s’agit de R_min. Notez également la valeur du dénominateur pour cette section ; c’est_{S gratuit}.
   8. Répétez les étapes 2.3.4 à 2.3.7 pour R_max et S_lié à la section de la trace qui correspond à un PSS libre Ca²⁺ élevé et au rapport le plus élevé.
   9. Sous Opérations, sélectionnez Constantes.
   10. Sélectionnez Étalonnage calcium-calcium et entrez les valeurs répertoriées dans l’équation 1. Cliquez sur OK.
   11. Ajustez l’une des traces à l’écran comme décrit à l’étape 2.2.8 afin de voir le calcium-numérique soustrait le calcium.
   12. Effectuez une analyse transitoire monotone pour acquérir les paramètres restants. Vous trouverez des instructions à ce sujet dans le manuel du logiciel³⁰.
   13. Sinon, sous Exporter, sélectionnez Trace actuelle.
   14. Sélectionnez l’emplacement vers lequel vous souhaitez exporter le fichier .txt et cliquez sur OK.
       REMARQUE : Assurez-vous de cliquer sur la trace individuelle que vous souhaitez exporter. Vous pouvez exporter l’intégralité de la trace ou des sections sélectionnées de la trace.

3. Mesure de la contractilité et de la rythmicité du VG

1. Le logiciel de détection des bords intégré au système d’imagerie génère des traces contractiles pour les mesures de diamètre BT comme décrit ci-dessus. Utilisez ces mesures pour analyser les paramètres contractiles et rythmiques. La figure 4 est un exemple de trace contractile détaillant les paramètres contractiles à enregistrer. Exportez tous les paramètres directement depuis le logiciel d’imagerie à l’aide de la fonction d’analyse transitoire monotone sur le tracé Diameter³⁰, à l’exception de la fréquence des contractions, du débit calculé et de l’intervalle, qui doivent être calculés hors ligne.
   REMARQUE : Des traces entières peuvent être exportées dans un fichier .txt et tous les paramètres peuvent être analysés ou calculés dans le logiciel de votre choix à l’aide des équations ci-dessous.
2. EDD, ESD, amplitude, fréquence et mesures de débit calculées
   1. Mesurez les diamètres maximum et minimum (diamètre diastolique final [EDD] et diamètre systolique final [ESD], respectivement) que les VG peuvent atteindre lors de leurs contractions rythmiques et spontanées.
   2. Calculez l’amplitude des contractions (AMP) comme la différence entre EDD et ESD.
   3. Calculez la fréquence en nombre de contractions par période de mesure (en s).
   4. Calculer le débit par μm calculé à l’aide de l’équation (2) :
      Débit calculé = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Où EDD² = section transversale du vaisseau pendant l’état de relâchement, ESD² = mesure de la section transversale du vaisseau pendant la constriction, F = fréquence des contractions/s
3. Rythmicité : contraction et temps de relaxation :
   1. D’autres mesures de la rythmicité du VG sont le temps de contraction et le temps de relaxation.
   2. Définissez le temps de contraction comme le temps mis par le VG pour atteindre l’ESD à chaque contraction.
   3. Définir le temps de relaxation comme le temps mis par le VG pour atteindre l’EDD pour chaque relaxation, ce qui donnera une indication globale de la rythmicité corrélée avec le [Ca²⁺]_i absolu dans un laps de temps spécifique.
   4. Calculer le temps d’intervalle (ΔT) à partir de l’équation (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Résultats

La contractilité des VG et les altérations correspondantes du Ca²⁺ libre cytosolique ([Ca²⁺]_i) ont été évaluées dans des VG mésentériques de rat isolés lors d’une exposition à des concentrations variables de nifédipine (NIF ; 0,1-100 nM) (figure 6). Les paramètres, y compris l’amplitude du pic de Ca²⁺, le Ca²⁺ de base et le pic de Ca²⁺, ont montré une réduction dépendante de la concentration avec l’ajout progressif de NIF dans la chambre de perfusion (Figure 7A). Parallèlement, les paramètres contractiles tels que l’amplitude de contraction et l’écoulement calculé ont également montré une diminution progressive (Figure 7B). Il y a eu une légère augmentation du diamètre EDD avec le NIF (Figure 7B). La fréquence de pic et la fréquence de contraction de Ca²⁺ semblent être une réponse tout ou rien. Cependant, cet effet s’est produit à 10 nM pour un VG, alors que tous les VG avaient cessé leurs contractions à 100 nM. Ainsi, les données combinées génèrent des graphiques qui ressemblent à une réponse de concentration graduelle. Cet effet est cohérent avec les publications antérieures qui utilisaient le NIF sur les VG dans d’autres préparations (myographie par fil et pression^13,14). Les graphiques de Manhattan montrent les réponses individuelles du VG pour les mesures de la rythmique, y compris l’intervalle, le temps de contraction et le temps de relaxation (Figure 7C). Ce type de représentation des données permet au chercheur de démêler ces réponses tout ou rien ou la variabilité des rythmes de contraction afin de fournir des informations supplémentaires sur les mécanismes sous-jacents. En fin de compte, les diminutions de l’amplitude et de la fréquence de contraction ont entraîné une réduction du débit calculé à travers ces VG isolés, qui sert d’indicateur de substitution pour la fonction in vivo. Dans l’ensemble, la baisse de la contractilité du VG était corrélée à la réduction de [Ca²⁺]_i. Nos résultats fournissent des preuves directes que dans la gamme de 100 nM, le NIF a efficacement arrêté les contractions et les oscillations de [Ca²⁺]_i dans les VG en antagonisant les canaux Ca_v1.x présents dans les cellules musculaires lymphatiques (LMC).

Figure 1 : Image de la configuration isolée de la chambre de la cuve. Les études de perfusion vasculaire ont utilisé une chambre vasculaire isolée équipée d’un thermorégulateur. La gravité a été utilisée pour contrôler la pression via un réservoir PSS. La pression a été surveillée par des transducteurs reliés à des canules d’entrée (P1) et de sortie (P2). Abréviation : PSS = solution saline physiologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Préparation du nœud en un coup d’œil. (A) Préparation à double boucle sous le microscope de dissection à l’aide d’un seul filament de fil de suture en soie à 3 plis, (B) saisir l’extrémité libre et la tirer à travers les deux boucles, (C) tirer le nœud des deux extrémités pour garder une petite ouverture, et (D) couper l’excédent de filament de chaque côté et la boîte bleue montrant un double nœud plat complet prêt à l’emploi. Barre d’échelle = 1,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma du flux de travail expérimental pour l’acquisition de données. Un rat en bonne santé a été anesthésié avec une induction d’isoflurane à 5 % et une décapitation a été effectuée pour enlever le sang du tronc. Une incision médiane a été pratiquée pour exposer et isoler le mésentère. Le mésentère isolé a été étalé dans une solution glacée de PSS et un VG a été disséqué sans graisse pour la canulation dans une chambre de perfusion de vaisseaux isolés. Le bain a été placé sur la platine du microscope inversé à l’aide d’un objectif 20x. Le vaisseau a été excité alternativement avec une lumière de longueur d’onde de 340 et 380 nm et les spectres fluorescents d’émission ont été collectés à l’aide d’une caméra CCD à 510 nm. L’ordinateur connecté au microscope a généré les traces contractiles et Ca²⁺ à l’aide d’un logiciel d’imagerie par capture de fluorescence et détection de bord. Barre d’échelle = 1 mm. Abréviations : PSS = solution saline physiologique ; LV = vaisseau lymphatique ; CCD = dispositif à couplage de charge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

(A) Exemple d’enregistrement des changements de diamètre des VG canulés chargés avec l’indicateur d’imagerie Ca²⁺ Fura 2 AM en PSS et (B) une trace zoomée pour montrer tous les paramètres liés à la contractilité du vaisseau : EDD, ESD, AMP, et fréquence. Ces valeurs ont été utilisées pour calculer la rythmicité et le débit. Abréviations : PSS = solution saline physiologique ; LV = vaisseau lymphatique ; EDD = diamètre diastolique final ; ESD = diamètre systolique final ; AMP = amplitude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Trace d’imagerie VG Ca²⁺ représentative. (A) Exemple d’enregistrement des changements de [Ca²⁺]_i absolu dans les VG canulés chargés de Fura-2 dans PSS et (B) une trace zoomée pour montrer tous les paramètres (Peak, Amplitude et Baseline) liés à [Ca²⁺]_i (non corrigé en arrière-plan). Abréviation : PSS = solution saline physiologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Aperçu de la contractilité du VG et de l’imagerie Ca²⁺. Traces représentatives correspondant à (A) le diamètre, (B) le rapport 340/380 et (C) absolu [Ca²⁺]_i de la ligne de base du PSS, la nifédipine, un antagoniste des canaux Ca_v1.x (Ca²⁺), la réponse à la concentration, y compris R_min et R_max. Abréviations : PSS = solution saline physiologique ; LV = vaisseau lymphatique ; NIF = nifédipine ; R_min = signal de fluorescence Fura-2 minimal ; R_max = signal de fluorescence Fura-2 maximal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Oscillation Ca²⁺ et contractilité correspondante bloquée par la nifédipine dans les VG. (A) Les paramètres Ca²⁺ (n = 3) et (B) contractile (n = 3) ont diminué de manière dépendante de la concentration avec l’ajout de nifédipine, un antagoniste des canaux Ca_v1.x (Ca²⁺) dépendant de la tension. (C) Les graphiques représentatifs de Manhattan montrent l’intervalle de temps moyen (Δt) entre les contractions et les temps de contraction et de relaxation. Données présentées en moyenne ± MEB. Abréviations : PSS = solution saline physiologique ; LV = vaisseau lymphatique ; NIF = nifédipine ; EDD = diamètre diastolique final ; AMP = amplitude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

En raison de la nature fragile et minuscule des VG, il est impératif de faire preuve de la plus grande prudence pendant les processus de dissection et de canulation. Même des dommages mineurs au vaisseau pourraient entraîner le développement d’un VG non viable ou donner lieu à des anomalies dans les transitoires [Ca²⁺]_i . La cohérence des paramètres d’excitation est tout aussi cruciale tout au long de la série expérimentale pour assurer la comparabilité des mesures de [Ca²⁺]_i entre les groupes témoins et traités. Le fait de ne pas maintenir des paramètres uniformes présente un risque important de surestimation ou de sous-estimation de [Ca²⁺]_i entre les récipients d’une série expérimentale. De même, il est tout aussi important d’identifier et de surveiller avec précision la même région du vaisseau tout au long de chaque expérience.

L’utilisation de l’indicateur ratiométrique Fura-2AM normalise les variations de fluorescence causées par l’épaisseur inégale des tissus, la distribution/fuite de fluorophores ou le photoblanchiment, problèmes courants avec les colorants à longueur d’onde unique. ³¹ Cela permet la surveillance continue décrite dans le présent protocole. Cependant, comme Fura-2 agit en chélant le Ca²⁺, il est possible de surcharger les VG et de réduire le [Ca²⁺]_i disponible pour la contraction ou la réponse médicamenteuse. Dans ces cas, des pics de Ca²⁺ peuvent encore être observés en l’absence de contractions rythmiques. La longueur variable du VG peut également contribuer à ce phénomène. Bien que ces mesures de Ca²⁺ puissent probablement être encore valides, il peut être nécessaire de réduire la concentration de Fura-2AM dans les configurations répétées pour réussir à obtenir des mesures de Ca²⁺ et de diamètre. Nos résultats n’incluent que les VG pour lesquels des pics de Ca²⁺ et des contractions rythmiques étaient présents au départ.

La mesure de R_min et R_max est une étape critique dans le calcul absolu de [Ca²⁺]_i. Étant donné que R_min devrait être le rapport Fura-2 en l’absence de Ca²⁺, une forte concentration d’EGTA a été ajoutée au PSS sans Ca²⁺ pour assurer la chélation de tout Ca²⁺ résiduel. Des études initiales ont été menées avec de l’EDTA dans le PSS sans Ca²⁺, ce qui a entraîné des contractions sporadiques des vaisseaux avec des pics de Ca²⁺ correspondants. Pour R_max, une forte concentration de Ca²⁺ a été ajoutée au PSS avec un ionophore, l’ionomycine, pour maximiser le signal [Ca²⁺]_i . La solution à haute teneur en Ca²⁺ peut précipiter, ce qui peut nécessiter l’élimination de l’EDTA du PSS. Il est important de noter que ces mesures supplémentaires de R_min et R_max offrent l’occasion d’évaluer des changements physiologiquement pertinents dans [Ca²⁺]_i, ce qui peut fournir des informations sur les mécanismes d’excitabilité et de contractilité membranaires²⁷ et permettre des comparaisons de base entre les groupes expérimentaux par rapport aux protocoles qui ne rapportent que le rapport 340/380 pour Fura-2. L’incapacité d’atteindre des valeurs R_min et R_max adéquates empêche de calculer le [Ca²⁺]i absolu_.

En raison de la nature contractile des VG, cette méthode ne peut fournir qu’une mesure des niveaux globaux de Ca²⁺ plutôt que des événements locaux de libération de Ca²⁺ qui peuvent être mesurés dans les vaisseaux paralysés³². Cependant, cette méthode est avantageuse pour corréler les changements de la dynamique absolue du [Ca²⁺]_i avec la contractilité par rapport aux méthodes utilisant des vaisseaux paralysés ou des cellules individuelles^28,32. Pour cette approche, on suppose que la majorité du Ca²⁺ mesuré provient des cellules musculaires lymphatiques. Cependant, les cellules endothéliales, qui sont également présentes dans ces VG isolés, peuvent contribuer au signal Ca²⁺ total observé³³. Cette contribution a pu être estimée à l’aide de VG qui ont été dénudés de l’endothélium³⁴. Les contractions du VG peuvent également entraîner un léger décalage de la paroi du vaisseau vers l’intérieur et vers l’extérieur pendant le cycle de contraction. Par conséquent, il est important d’utiliser des segments de récipient courts qui peuvent être tendus mais sans étirer le récipient.

Au-delà de son application dans les VG, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier des vaisseaux isolés d’autres lits vasculaires, y compris les artérioles et les veines, et est prometteuse pour une utilisation potentielle en neurobiologie et dans d’autres branches de la biologie vasculaire. L’exploration des effets de divers agonistes ou antagonistes ciblant différentes voies de transduction du signal est une autre voie pour étudier la dynamique sous-jacente du Ca²⁺ . En outre, cette technique peut également être utilisée pour des recherches comparatives impliquant des échantillons de contrôle et traités d’animaux respectifs. De plus, cette approche est adaptable pour être mise en œuvre au niveau cellulaire, par exemple dans des cellules musculaires lymphatiques isolées, nécessitant des ajustements minimes de la chambre de perfusion et des objectifs du microscope. En résumé, cette méthode fournit un aperçu physiologiquement pertinent de la dynamique globale du Ca²⁺ , car elle est corrélée à la contractilité et à la rythmicité dans les VG et fournit une évaluation robuste des régulateurs potentiels de la dynamique du Ca²⁺ dans la collecte des VG.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif fluor 20x S	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, États-Unis)	UPlanSApo
Micropipettes en verre borosilicaté	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, États-Unis)	GCP-75-100
Chlorure de calcium (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis)	BP510-500
Dioxyde de carbone (CO2)	nexAir (Memphis, TN, États-Unis)	UN3156
Pince à dissection	Fine Science Tools (Foster City, CA, États-Unis)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, États-Unis)	F1221
Glucose (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis)	D16-500
Régulateur de pression alimenté	par gravité fabriqué sur mesure en laboratoire
Unité de chauffage	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, États-Unis)	TC-09S
Logiciel d’imagerie	IonOptix (Westwood, MA, États-Unis)
Microscope à fluorescence inversée	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, États-Unis)	IX73
Ionomycine	Invitrogen (Waltham, MA, États-Unis)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, États-Unis)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Telangana, Inde)	NDC 66794-017-10
Chambre de perfusion de vaisseaux isolés	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, États-Unis)	CH-1
Pince de préparation de nœuds	Fine Science Tools (Foster City, CA, États-Unis)	11253-20
Source lumineuse LED	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, États-Unis)	TL4
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Acros Organics (New Jersey, NJ, États-Unis)	213115000
MyoCam-S3 Système vidéo CMOS rapide	IonOptix (Westwood, MA, États-Unis)	MCS300
Nifedipine	Sigma (St. Louis, MO, États-Unis)	N7634
Sutures
Oxygen (O2)	nexAir (Memphis, TN, États-Unis)	UN1072
Acide pluronique	Sigma (St. Louis, MO, États-Unis)	P2443
Chlorure de potassium (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis	BP366-500
Système de surveillance de pression	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, États-Unis)	PM-4
Transducteur de pression	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, États-Unis)	PT-F
Boîte de Petri doublée de silicone	fabriquée sur mesure en laboratoire
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Bioréactifs (Waltham, MA, États-Unis	BP328-500
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis	BP358-212
Phosphate de sodium (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, États-Unis	BP329-500
Rats Sprague-Dawley	Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)	Mâle	9-13 semaines
Stéréomicroscope	Leica Microsystems (Wetzlar, Allemagne)	S9D
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools (Foster City, CA, États-Unis)	15000-03