Mesure de la longueur des télomères par PCR quantitative multiplexe monochrome

Noelle A. Martin; Lauren W. Y. McLester-Davis; Trevor R. Roy; Madeline G. Magruder; Waylon J. Hastings; Stacy S. Drury

doi:10.3791/66545

Article de méthode

Mesure de la longueur des télomères par PCR quantitative multiplexe monochrome

DOI :

10.3791/66545

⸱

22 mars 2024

Noelle A. Martin^*¹ , Lauren W. Y. McLester-Davis^*²^,³^,⁴ , Trevor R. Roy¹ , Madeline G. Magruder⁵ , Waylon J. Hastings¹ , Stacy S. Drury⁶

¹School of Medicine, Tulane University, ²Native American Center for Health Professions, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, ⁴Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, ⁵School of Science and Engineering, Tulane University, ⁶Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Boston Children’s Hospital

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour la mesure de la longueur relative des télomères (TL) à l’aide du test de réaction en chaîne par polymérase quantitative multiplex monochrome (MMqPCR). Le test MMqPCR est une méthode reproductible, efficace et rentable pour mesurer la TL à partir de l’ADN humain dans des études basées sur la population.

Résumé

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Les télomères sont des structures ribonucléoprotéiques à l’extrémité de tous les chromosomes eucaryotes qui protègent l’ADN des dommages et préservent la stabilité des chromosomes. La longueur des télomères (TL) a été associée à diverses expositions, processus biologiques et résultats pour la santé. Cet article décrit le protocole de test de réaction en chaîne par polymérase quantitative multiplex monochrome (MMqPCR) couramment utilisé dans notre laboratoire pour mesurer la TL moyenne relative à partir de l’ADN humain. Il existe plusieurs méthodes différentes de mesure TL basées sur la PCR, mais le protocole spécifique de la méthode MMqPCR présenté dans cette publication est reproductible, efficace, rentable et adapté aux études basées sur la population. Ce protocole détaillé décrit toutes les informations nécessaires aux chercheurs pour établir ce test dans leur laboratoire. De plus, ce protocole fournit des étapes spécifiques pour augmenter la reproductibilité de la mesure de TL par ce test, définie par le coefficient de corrélation intraclasse (ICC) sur des mesures répétées du même échantillon. L’ICC est un facteur essentiel dans l’évaluation de la puissance attendue pour une population d’étude spécifique ; en tant que tel, la déclaration des CCI spécifiques à une cohorte pour tout test TL est une étape nécessaire pour améliorer la rigueur globale des études basées sur la population de TL. Des exemples de résultats utilisant des échantillons d’ADN extraits de cellules mononucléées du sang périphérique démontrent la faisabilité de générer des données TL hautement reproductibles à l’aide de ce protocole MMqPCR.

Introduction

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Les télomères sont des complexes protecteurs situés à l’extrémité de tous les chromosomes eucaryotes, composés de séquences d’ADN répétitives hautement conservées et de protéines associées. Le télomère protège l’intégrité de l’ADN, préservant la stabilité des chromosomes. Le raccourcissement progressif des télomères se produit dans les cellules en division à la suite d’une synthèse incomplète de l’ADN à brin retardé, de dommages à l’ADN et d’autres facteurs ^1,2. L’augmentation des preuves à l’appui de la longueur des télomères (TL) en tant que biomarqueur du vieillissement et des maladies liées à l’âge tout au long de la vie humaine s’est accompagnée d’une augmentation des types de tests de mesure de TL utilisés pour évaluer le rôle de la TL dans les études sur l’exposition, la maladie et la santé humaines ^3,4,5. Des méta-analyses ont rapporté des associations entre le TL et la mortalité globale, les expositions environnementales et les résultats pour la santé, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires et le diabète 6,7,8,9,10,11,12,13 . Ces méta-associations découlent d’études utilisant l’une des deux douzaines de méthodologies de mesure TL différentes, où les forces des associations ont tendance à varier entre différentes méthodologies 14,15,16. Le choix de la méthode de mesure TL optimale pour une étude de recherche est une étape cruciale pour garantir des résultats précis, car chaque méthode possède ses propres avantages et inconvénients ^5,17.

En raison du coût relativement faible des réactifs, de la rapidité d’exécution des tests, de l’évolutivité et de la réduction des besoins initiaux en ADN, les techniques de mesure TL basées sur la PCR sont souvent utilisées de préférence lors de la réalisation d’études avec de grandes populations d’échantillons, d’études avec un accès limité à des échantillons à fortes concentrations d’ADN ou d’études privilégiant un débit élevé. La première méthode de mesure TL basée sur la PCR, la réaction en chaîne par polymérase quantitative singleplex (qPCR) développée à l’origine par Richard Cawthon, utilise le rapport des signaux de fluorescence de l’amplification des télomères (T) et du gène de copie unique (S), exécuté sur des plaques PCR séparées¹⁸. Dans cette approche, des amorces complémentaires aux séquences répétées d’ADN télomère (T) sont utilisées pour amplifier le contenu total en ADN télomérique dans l’échantillon et quantifiées par détection du rapporteur fluorescent SYBR vert. De même, des amorces complémentaires à une région intergénique d’un gène S (Single Copy) conservé sont utilisées pour quantifier le nombre de copies du génome. Ces deux estimations sont quantifiées par rapport à une courbe standard d’ADN génomique utilisée dans tous les essais d’un projet de contrôle de la variation d’une plaque à l’autre. La division de l’ADN télomérique total (T) par le nombre de copies du génome unique (S) produit le rapport T/S, une mesure relative sans unité représentant le contenu télomérique moyen par cellule pour un échantillon d’ADN individuel^18,19. Ainsi, le rapport T/S n’est pas une mesure spécifique de la longueur fonctionnelle ; cependant, conformément aux normes de la littérature, nous utilisons le terme TL moyen par échantillon tout au long de ce protocole.

Cette méthode a été avancée en 2009 lorsque Richard Cawthon a décrit le test de qPCR multiplex monochrome (MMqPCR) comme une approche permettant de réduire potentiellement la variabilité du rapport T/S par rapport à la méthode qPCR singleplex originale¹⁹. Le test MMqPCR possède les avantages du test qPCR avec l’avantage supplémentaire de mesurer les signaux T et S dans le même puits de réaction à l’aide d’un fluorophore rapporteur, réduisant ainsi l’erreur par rapport à la qPCR singleplex et entraînant une précision et une reproductibilité plus élevées¹⁹. De plus, cette méthode de multiplexage permet potentiellement de réduire les coûts et d’améliorer le rendement, car deux fois moins de réactions sont nécessaires par rapport au test singleplex¹⁹.

Compte tenu des avantages de la mesure de la TL par MMqPCR, cette méthode est bien adaptée aux études basées sur la population des associations de TL avec les expositions, les résultats pour la santé et les processus biologiques. Cependant, le lancement de la méthode peut être difficile. Pour relever ces défis, nous décrivons en détail le protocole de mesure MMqPCR TL utilisé dans notre laboratoire, en mettant en évidence les principales étapes mises en œuvre pour augmenter la précision du test, réduire le risque de contamination et améliorer la répétabilité.

De plus, ce protocole décrit les étapes de nettoyage des données et de calcul du coefficient de corrélation intraclasse (ICC), une mesure statistique importante de la reproductibilité des mesures TL². Avec nos résultats représentatifs, nous démontrons la capacité de générer des ICC élevés en utilisant ce protocole. De plus, nous identifions les étapes de contrôle de la qualité (CQ) et de dépannage qui devraient réduire la variation des mesures TL et augmenter l’ICC résultant. En raison de la répétabilité, de l’efficacité et de la rentabilité élevées de cette méthode, la mesure de la TL MMqPCR est idéale pour la recherche épidémiologique TL. La figure 1 fournit une vue d’ensemble visuelle de la méthode MMqPCR telle que décrite dans ce protocole.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode. Un aperçu général de la méthode de réaction en chaîne par polymérase quantitative multiplex monochrome pour mesurer la longueur des télomères. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

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Cette recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Ce protocole décrit le test MMqPCR effectué à une profondeur de mesure de triples dupliqués, c’est-à-dire des mesures en trois exemplaires de chaque échantillon répétées sur des plaques dupliquées, mises en œuvre à l’aide de deux thermocycleurs simultanément pour améliorer le débit. L’utilisation de plaques dupliquées est une considération primordiale prise en compte dans la mise en œuvre de ce protocole pour obtenir une reproductibilité élevée, comme l’indiquent les ICC élevés. Bien qu’il soit possible d’utiliser moins de répétitions, l’impact sur l’ICC, et par conséquent sur la puissance et la taille de l’échantillon nécessaire, doit être soigneusement examiné et mesuré avec chaque cohorte par chaque laboratoire^20,21. Si un seul thermocycleur est disponible, nous vous suggérons de maintenir la profondeur de mesure (c’est-à-dire les triples en double) et d’exécuter 2 plaques de manière séquentielle.

1. Préparation du stock et conditions de stockage

Pour tous les matériaux et équipements utilisés pour ce protocole, voir le Tableau des matériaux. De plus, pour les réactifs spécifiques du mélange maître et les quantités utilisées pour le test MMqPCR, voir le tableau 1. Si vous analysez deux plaques de manière séquentielle, réduisez de moitié le volume de mélange principal tout en maintenant la concentration, en veillant à ce que les mêmes aliquotes de réactif soient utilisées sur les plaques séquentielles du même test.
REMARQUE : Tous les réactifs en stock doivent être préparés à l’avance et les réactifs aliquotes doivent être complètement décongelés avant utilisation.
Aliquote et conservez 1x Tris-EDTA, pH 7,6 (TE) dans des tubes de 5 mL dans des volumes de 3 mL à température ambiante jusqu’à 2 ans.
Aliquote et stockage de la bétaïne 5 M dans des tubes de 5 mL dans des volumes de 1 280 μL à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 1 an.
Aliquote et stockage de SYBR Green dans des volumes de 3 μL dans des tubes de bandelettes PCR individuels à -20 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à 2 ans, recouverts d’une feuille d’aluminium et peu exposés à la lumière.
Conservez l’ADN polymérase dans les tubes d’origine à -20 °C jusqu’à 1 an.
Aliquote et stockage du tampon polymérase 10x dans des tubes de 1,5 mL dans des volumes de 660 μL à -20 °C jusqu’à 1 an.
1. Pour des dilutions de tampon 1x de tampon polymérase 10x, ajouter 9,9 μL de tampon 10x à 89,1 μL de PCR grade H₂O dans des tubes de 0,5 mL ; Conserver à -20 °C jusqu’à 1 an.
Aliquote et stockage de 1 M MgCl₂ dans des tubes de 0,5 mL dans des volumes de 70 μL à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à 1 an.
Conservez les amorces lyophilisées oligonucléotidiques du télomère avant et inverse (T) et du gène de copie unique (S) à température ambiante à l’abri de la lumière. Les quatre séquences d’amorces d’oligonucléotides spécifiques sont présentées dans le tableau 2.
REMARQUE : Le gène à copie unique dans ce protocole est l’albumine ; si l’on choisit un gène à copie unique différent, il peut être nécessaire d’ajuster les concentrations de l’amorce pour assurer une efficacité acceptable de la PCR.
1. Reconstitution de l’amorce : Vortex chaque tube d’amorce lyophilisée pendant 10 s, puis placez les tubes dans une mini centrifugeuse pendant 5 s pour vous assurer que la pastille lyophilisée est au fond du tube avant d’ajouter 1x tampon TE.
2. Vérifiez la concentration en nM de chaque tube d’amorce ([nM]= alpha) et réhydratez chaque tube d’amorce en ajoutant 1x TE égal à 10x de la valeur alpha en μL (par exemple, si la concentration en nM sur le tube indique 24,6 nM, ajoutez alors 246 μL de 1x TE dans le tube d’amorce) pour créer une solution de 100 μM de chaque amorce.
3. Aliquote amorces de télomères directes et inverses séparément dans des volumes de 16 μL et amorces d’albumine directes et inverses séparément dans des volumes de 11 μL. Conservez les quatre types d’aliquotes d’apprêt à -20 °C jusqu’à 6 mois.
Mélange dNTP : Vortex 4 à 8 tubes de chacun des quatre types de dNTPS de solutions mères de 25 mM (c.-à-d. 16 à 32 tubes au total) pendant 10 s, suivi d’un essorage rapide à température ambiante à l’aide d’une mini-centrifugeuse. Placez les tubes de manière uniforme dans les positions des tubes dans la mini centrifugeuse, puis fermez le couvercle pour permettre à la machine d’atteindre sa pleine vitesse, en tournant pendant environ 5 s.
1. Dans un tube de 5 ml, ajoutez 200 à 250 μL de chaque tube, en veillant à ce que des parties égales de chacun des quatre types de dNTP soient ajoutées, et vortex le mélange de dNTP.
2. Aliquote 210 μL de mélange dans des tubes de 0,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 an.
Stockez le DTT à -20 °C et l’acétate de sodium 3M à température ambiante.
1. Solution DTT : Mesurez 0,1545 g de DTT dans un bateau de pesage taré sur une balance à l’aide d’une spatule en acier inoxydable.
  ATTENTION : Le dithiothréitol (DTT) est un réactif dangereux. La DTT est nocive en cas d’ingestion, provoque une irritation de la peau et peut causer de graves lésions oculaires. Les personnes doivent porter des gants de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation de la TNT. De plus, les individus doivent éviter de respirer les vapeurs de DTT, de travailler avec une cagoule PCR lors de la manipulation de DTT et d’éviter une exposition prolongée ou répétée.
2. Préparez 10 ml d’acétate de sodium 0,01 M en ajoutant 33,33 μL d’acétate de sodium 3 M et 9 967 μL de PCR de grade H₂O dans un tube de 15 mL et un puits de vortex. Ajouter le DTT mesuré dans le tube de 15 mL d’acétate de sodium 0,01 M. Transvaser environ 100 μL de la solution d’acétate de sodium 0,01 M dans le bateau de pesée pour recueillir le DTT résiduel. Pipetez les 100 μL dans le tube de 15 mL. Une fois que tout le DTT est dans la solution, agitez le tube jusqu’à ce qu’il se dissolve complètement.
3. Verser le contenu du tube de 15 mL dans une auge de chargement, aspirer toute la solution dans une seringue en plastique de 10 mL à partir d’une extrémité de l’auge de chargement. Fixez un filtre stérile en acétate de cellulose de 0,2 μm à 25 mm à l’extrémité de la seringue remplie, laissez saturer complètement pendant 1 minute et versez lentement la solution dans un nouveau tube de 15 ml en poussant légèrement le piston de la seringue vers le bas, en veillant à ce que toute la solution s’écoule à travers le filtre dans le nouveau tube de 15 ml.
4. Aliquote de la solution DTT dans des volumes de 200 μL dans des tubes de 0,5 mL et stockée à -20 °C jusqu’à 6 semaines.

Tableau 1 : Volumes finaux et concentrations des réactifs. Volumes et concentrations des réactifs dans les aliquotes individuelles, les mélanges maîtres et dans les puits de PCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Séquences d’amorces d’oligonucléotides de télomères et de gènes à copie unique. Liste des séquences d’amorces des gènes de copie unique des télomères et de l’albumine utilisées dans la méthodologie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

2. Extraction de l’ADN génomique et préparation des échantillons

Extraction d’échantillons analytiques : Effectuer une extraction d’ADN génomique pour les échantillons conformément aux directives du fabricant à l’aide de kits ou de méthodes établies au sein du laboratoire.
1. Vérifiez la qualité de l’échantillon d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et de l’ADN double brin (ADNdb) à l’aide d’un fluorimètre. Les échantillons présentant des rapports moyens inacceptables de 260/280 et 260/230 ou une concentration d’ADNdb inférieure à la détection (<0,20 ng/μL) ne devraient pas être analysés pour la concentration de TL^22,23. De plus, si la concentration d’ADNdb est trop élevée pour générer une lecture à l’aide du fluorimètre (>1000 ng/μL), diluez l’échantillon et répétez le test.
  REMARQUE : Pour les résultats présentés ici, les valeurs acceptables pour la pureté des acides nucléiques étaient un rapport de 260/280 entre 1,6 et 2,0 et un rapport de 260/230 entre 2,0 et 2,2.
Extraction d’échantillons de contrôle : Effectuer une extraction d’ADN génomique sur un échantillon de contrôle dérivé du même matériel biologique que les échantillons sujets analysés pour un projet donné. Assurez-vous d’extraire suffisamment d’ADN de contrôle pour toutes les plaques devant être analysées pour l’ensemble de la cohorte, de sorte qu’un seul étalon d’ADN soit utilisé pour tous les essais.
1. Vérifiez la qualité de l’échantillon d’ADN de contrôle par spectrophotomètre et fluoromètre. L’échantillon témoin doit présenter des rapports moyens acceptables de 260/280 et de 260/230 et des concentrations détectables d’ADNdb^22,23.
2. Aliquote d’ADN témoin à une concentration de 2 ng/μL en quantités de 150 μL dans des tubes de 0,5 mL étiquetés avec le type d’échantillon et la date. Conservez les aliquotes d’ADN de contrôle à -20 °C jusqu’à 5 ans. Utilisez un échantillon d’ADN de contrôle pour toutes les plaques de tous les échantillons de la même cohorte ou du même projet de recherche. Préparez ces aliquotes à l’avance.
Préparation des échantillons analytiques : Pour les échantillons dont la concentration initiale est de >5 ng/μL, créer des aliquotes de dilution à l’aide d’un facteur de dilution en nombre entier, en ajoutant la quantité appropriée d’échantillon d’ADN extrait (Fichier supplémentaire 1 Fiche de configuration MMqPCR, colonne F) et de PCR de grade H₂O (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne G) pour diluer la concentration entre 2,5 et 5,0 ng/μL (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne K). Ne diluez pas les échantillons à une concentration de <5 ng/μL, mais aliquotez-vous suffisamment de volume pour doser l’échantillon 3x en utilisant ce protocole.
REMARQUE : Des aliquotes de dilution doivent être effectuées lors de la préparation de l’échantillon afin que 15 ng d’ADN puissent être ajoutés au tube de bandelettes PCR correspondant à chaque échantillon. Les aliquotes d’échantillons permettent aux techniciens d’éviter que les cycles de gel-dégel inutiles n’affectent l’intégrité de l’ADN de l’échantillon de stock si l’échantillon ne répond pas aux critères de qualité et doit être réanalysé. L’exemple de modèle MMqPCR qui se trouve dans le fichier supplémentaire 1 peut aider à identifier le facteur de dilution et les volumes corrects pour préparer les aliquotes de dilution (fichier supplémentaire 1, feuille de configuration MMqPCR, colonnes E-I).
1. Remplissez les bandelettes de PCR avec les échantillons A1 à 8 dans la bandelette de PCR A, les échantillons B1 à 8 dans la bandelette de PCR B et les échantillons C1 à 8 dans la bande de PCR C, comme indiqué dans le Fichier supplémentaire 1 de la feuille de configuration MMqPCR et répertoriés dans le tableau 3 avec des quantités d’échantillons correctement diluées (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne L) et des quantités de PCR de grade H₂O (Fichier supplémentaire 1 Feuille de configuration MMqPCR, colonne M) pour une quantité totale de 15 ng d’ADN par tube PCR et un volume total de 75 μL. Mettez-le de côté.
  REMARQUE : Les échantillons dans des bandelettes PCR peuvent être conservés toute la nuit à 4 °C pour être plaqués le lendemain.
Préparation de la courbe standard : décongélation d’une aliquote d’ADN de contrôle, vortex pendant 30 s, centrifugeuse pendant 5 s et aspiration du volume complet (150 μL) dans le premier tube de la bande de tubes PCR de la courbe standard (SC).
1. Pipeter 70 μL de PCR de grade H₂O dans le deuxième à le huitième tube de la bandelette SC PCR. Remettez soigneusement en suspension l’ADN de contrôle dans le premier tube avant d’aspirer 70 μL et de le distribuer dans le deuxième tube PCR. Attendez 30 s, puis remettez complètement la solution en suspension dans le deuxième tube PCR avant d’aspirer 70 μL et de la distribuer dans le troisième tube PCR. Répétez cette opération pour les tubes trois à sept afin de créer une dilution en série de sept étalons. Le tube final ne doit contenir que de la PCR de grade H₂O pour fonctionner comme un contrôle non matriciel (NTC). Mettez la bandelette SC PCR de côté.

Tableau 3 : Organisation des échantillons et de l’étalon de contrôle en plaque. Emplacement de tous les échantillons et étalons sur une plaque de PCR à 96 puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

3. Préparation du master mix MMqPCR

Rassemblez les aliquotes de réactifs du mélange maître énumérées dans le tableau 1, à l’exception de l’ADN polymérase, et laissez-les atteindre la température ambiante à l’intérieur de la hotte de PCR. Ajouter 1 μL de l’aliquote SYBR Green à l’aliquote tampon 1x.
REMARQUE : Cette quantité exacte est nécessaire pour générer la concentration correcte de SYBR en raison des limites de la précision de la pipette pendant le test, donc même si une seule plaque est exécutée à la fois, cette quantité doit rester inchangée.
Vortex toutes les aliquotes pendant 10 s, centrifuger pendant 5 s, puis ajouter les quantités suivantes de réactifs dans le tube de 5 mL contenant la bétaïne 5 M (maintenant le tube de mélange maître) : 1 235,2 μL de PCR de grade H₂O, 640 μL du tampon 10x, 204,8 μL des dNTP, 192 μL de la DTT, 64 μL de MgCl₂, 48 μL de SYBR Green / 1x tampon (à partir de l’étape 3.1), 14,4 μL des deux amorces de télomères et 9,6 μL des deux amorces d’albumine, comme indiqué dans le tableau 1.
Retirer l’ADN polymérase d’un stockage à -20 °C, vortex pendant 10 s, centrifuger pendant 5 s, puis ajouter lentement 128 μL au mélange maître ; ramènera immédiatement l’ADN polymérase à -20 °C.
Vortex le tube de mélange principal de 5 mL pendant 30 s.

4. Préparation de la plaque à 96 puits

Placez deux plaques de 96 puits, l’auge de chargement et les pointes de pipette multicanaux à l’intérieur du capot PCR. Étiquetez chaque plaque avec le numéro de plaque (1 ou 2). Tournez la plaque 1 (la plaque P1) de 180° de sorte que les numéros des colonnes soient à l’envers. Laissez la plaque deux (P2) face au technicien.
Versez le contenu du tube de mélange principal de 5 ml dans l’auge de chargement. À l’aide d’une pointe de pipette, on recueille et distribue la solution restante dans le tube.
Chargez les pointes sur la pipette multicanaux, en poussant à la base de chaque pointe de pipette pour assurer une étanchéité parfaite. Vérifiez que les embouts n’ont pas de filtre dans la région de sortie où le mixage principal sera aspiré ; S’il y a un morceau de filtre, remplacez l’embout.
Utilisez le pipetage inversé pour remplir les plaques avec le mélange maître visqueux, faites tourner l’auge de chargement, puis enfoncez le piston de la pipette au-delà de la première butée, en aspirant plus de 15 μL dans les pointes de la pipette, en vous assurant que les pointes se remplissent en même temps avec le même volume. Lorsque vous expulsez le mélange principal dans une colonne, appuyez sur le piston jusqu’à la première butée, en laissant le mélange principal supplémentaire dans les pointes de pipette. En laissant le piston enfoncé, replongez les pointes dans l’auge de chargement et relâchez le piston pour remplir les pointes avec 15 μL supplémentaires. Utilisez les mêmes pointes pour remplir les deux plaques.
1. Remplissez les plaques en expulsant le mixage principal dans toutes les colonnes paires ou toutes les colonnes impaires en premier, en alternant entre les plaques (c’est-à-dire que si le technicien choisit de commencer par les numéros de colonnes impairs, la colonne 1 sur P2 sera remplie en premier, suivie de la colonne 11 sur P1, puis de la colonne 3 sur P2, etc.). Une fois que le technicien a rempli tous les puits de la série (pair ou impair) en travaillant de gauche à droite, faites l’autre série (paire ou impaire) de colonnes de la même manière. Voir la figure 2 pour un graphique de ce processus.
  REMARQUE : Cette méthode de remplissage des plaques fonctionne pour contrôler les effets de position sur les plaques.
Vortex les quatre bandelettes de PCR fermées contenant les échantillons et la courbe standard puis essorez-les chacune dans une mini centrifugeuse pendant 5 s.
1. Alignez les bandelettes PCR dans le support de tube PCR dans l’ordre de leur position sur la plaque. Pour P1, les 3 premières colonnes sont des échantillons (bandelette PCR A), les colonnes 4 à 6 sont l’échantillon standard (bandelette PCR S), les colonnes 7 à 9 sont des échantillons (bandelette PCR B) et les colonnes 10 à 12 sont des échantillons (bande PCR C ; voir la figure 3 et le tableau 3). Étant donné que P2 est rempli en étant tourné à 180° par rapport au technicien, les colonnes seront opposées.
Tournez les deux plaques à 180° de sorte que les numéros des colonnes soient inversés par rapport au technicien pour chaque plaque (c’est-à-dire que si le technicien a déjà fait face à l’étiquette pour P2, il fera maintenant face à l’étiquette pour P1 sur le bord de la plaque).
Réglez la pipette multicanaux sur 10 μL et chargez les pointes de la pipette sur la pipette multicanaux comme décrit à l’étape 4.3.
1. À l’aide de la pipette multicanaux, les solutions sont remises en suspension, puis effectuent le pipetage inverse décrit à l’étape 4.4 pour aspirer et distribuer 10 μL d’échantillons et de solutions étalons, en commençant par la bandelette PCR A.
2. Remplissez les 3 premières colonnes de chaque plaque à l’aide de la bande PCR A en alternant les colonnes de la même manière que le mélange maître a été placé dans la plaque (c’est-à-dire pair ou impair).
3. Remplissez les trois colonnes suivantes à l’aide de la bande PCR de courbe standard. Pour cette bandelette, remettre en suspension le 7^ème tube de dilution étalon (avant-dernier), à l’aide d’une pipette de 200 μL réglée à ~90 μL, soigneusement avant de remettre en suspension l’ensemble de la bande à l’aide de la pipette multicanaux.
  REMARQUE : Le volume plus important et la plus faible concentration d’ADN dans ce tube entraînent souvent des mesures variées dans les puits de la plaque PCR en raison d’un mauvais mélange. L’utilisation d’un volume plus important pour mélanger ce tube permet d’homogénéiser davantage la solution d’ADN.
4. Remplissez les trois colonnes suivantes avec la bandelette PCR B et les trois dernières avec la bandelette PCR C. Replacez les pointes de pipette entre chaque bandelette PCR, en remplissant les 96 puits des deux plaques avec les échantillons correspondants et l’étalon de contrôle, comme indiqué à la figure 3.
Une fois les plaques remplies, tapotez doucement la plaque sur le dessus de la paillasse pour vous assurer que le liquide sur les côtés des puits s’écoule vers le bas, puis couvrez le dessus des plaques à l’aide de films d’étanchéité. Du bout des doigts, appuyez sur tous les bords du film pour assurer une fermeture étanche.
1. Mélangez les plaques en remuant sur le dessus de la hotte pendant 30 s, puis placez les plaques scellées dans la toupie pendant 2 min avec les ouvertures du puits vers le centre.
2. Placez les plaques dans un thermocycleur, avec les numéros des colonnes des plaques dans un ordre lisible. Utilisez un mouchoir propre pour nettoyer le haut de chaque plaque avant de fermer le dessus du thermocycleur.

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Figure 2 : Processus de remplissage des plaques. (A) Si vous choisissez de remplir d’abord les colonnes impaires, c’est l’ordre dans lequel les puits sont remplis. (B) Si vous choisissez de remplir les colonnes paires en premier, c’est l’ordre dans lequel les puits sont remplis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Disposition des plaques. Les bandelettes de PCR A, B, C et la bande de courbe standard (SC) doivent toutes être utilisées pour remplir trois colonnes sur chaque plaque afin de produire des triplets en double de chaque échantillon et dilution de l’étalon. Ce schéma montre quelles colonnes doivent être remplies avec chaque bande. La deuxième plaque est retournée à 180° (notez que les en-têtes de colonne et de ligne sont à l’envers) avant le chargement, mais la plaque est remplie de la même manière que la première plaque, éliminant ainsi les erreurs de pipetage potentielles tout en contrôlant les effets de position sur les plaques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Thermocyclage MMqPCR

Pendant que les plaques tournent à l’étape 4.8.1, allumez l’ordinateur et les thermocycleurs. Ouvrez le logiciel du thermocycleur. Ce protocole décrit l’utilisation du logiciel CFX Maestro.
Créez le protocole de thermocyclage TL conformément au protocole de thermocyclage MMqPCR¹⁹ (Figure 4).
1. Ajouter une étape d’incubation pour activer l’ADN polymérase à 95 °C pendant 15 min.
2. Pour éviter la liaison amorce-dimère, exécutez deux cycles de 94 °C pendant 15 s, 49 °C pendant 1 min, puis 3 cycles de 94 °C pendant 15 s, 59 °C pendant 15 s.
3. Pour l’amplification des télomères, ajoutez 27 cycles de 85 °C pendant 15 s, 74 °C pendant 30 s, puis l’acquisition du signal.
4. Pour l’amplification de l’albumine, ajouter 31 cycles de 94 °C pendant 15 s, 84 °C pendant 30 s, puis acquisition du signal.
5. Inclure une courbe de fusion de 59 °C à 95 °C à des intervalles de 5 s pour chaque degré croissant dans le protocole de cycle thermique.
Cliquez sur Démarrer l’exécution pour les deux thermocycleurs. Lorsque vous y êtes invité, donnez un titre aux fichiers d’analyse.

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Figure 4 : Profil de thermocyclage du test MMqPCR. Protocole MMqPCR créé dans le logiciel conformément au protocole de thermocyclage d’origine¹⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Analyse des données MMqPCR

Une fois le thermocyclage terminé, analysez les données de la manière suivante pour produire des valeurs TL pour les échantillons qui ont été traités.
Dans le logiciel, sélectionnez la fonction Configuration de la plaque . Dans le menu déroulant, cliquez sur Afficher/Modifier la plaque.
1. Mettez en surbrillance tous les puits et cliquez sur Sélectionner des fluorophores, puis cochez la case SYBR et décochez toutes les autres cases. Cliquez sur OK.
2. Bien que tous les puits soient toujours en surbrillance, à côté du mot Load, cochez la case en regard de SYBR. Maintenant, tous les puits devraient avoir SYBR écrit dessus.
3. Ensuite, mettez en surbrillance les trois puits NTC en haut ou en bas de la dilution en série de contrôle standard et sélectionnez NTC dans le menu des types d’échantillon à droite. Les trois puits devraient maintenant être jaunes et s’appeler NTC. La figure 5A montre quels puits doivent être sélectionnés pour P1 et la figure 5B montre quels puits doivent être sélectionnés pour P2.
  REMARQUE : P2 sera inversé à partir de P1, de sorte que le NTC sera en bas des colonnes 4-6 pour P1 et en haut des colonnes 7-9 pour P2.
4. Mettez en surbrillance les 21 puits de la dilution en série de contrôle standard et sélectionnez Standard dans le menu des types d’échantillon. Ces puits doivent être verts. Pendant que ces puits sont toujours en surbrillance, cliquez sur Réplication technique. Sélectionnez 3 dans le menu Taille de réplication, puis sélectionnez Horizontal > Appliquer. Ces puits doivent être étiquetés par groupes de trois de Std-1 à Std-7.
5. Bien que la norme soit toujours en surbrillance, faites défiler vers le bas et sélectionnez Série de dilution. Dans le champ Facteur de dilution, entrez 2, puis tapez la concentration de départ et la directionnalité de la dilution selon le numéro de plaque, comme décrit dans les étapes suivantes.
6. Pour la plaque P1, entrez 2.00E-03 dans le champ de concentration de départ, cochez la case Dégressif, puis sélectionnez Appliquer. Les valeurs dans les 21 puits doivent avoir les valeurs de concentration écrites dans chaque puits, allant de 2.00E-03 à 3.13E-05 de haut en bas.
7. Pour la plaque P2, entrez 3.13E-5 dans le champ de concentration de départ, cochez la case Augmentation , puis sélectionnez Appliquer. Les valeurs dans les 21 puits doivent avoir les valeurs de concentration écrites dans chaque puits allant de 3,13E-05 à 2,00E-03 de haut en bas.
Pour les échantillons, mettez en surbrillance les colonnes de la bandelette PCR A (1-3 pour P1 et P2), sélectionnez Inconnu dans le menu du type d’échantillon, puis sélectionnez Réplication technique. Sélectionnez 3 dans le menu Taille de réplication , puis sélectionnez Horizontal > Appliquer. Les puits de ces colonnes doivent être bleus et étiquetés par ligne par ensembles de 3 de Unk-1 à Unk-8.
1. Répétez l’étape 6.3 pour les colonnes de la bandelette PCR B (colonnes 7-9 pour P1 et 4-6 pour P2). Ils devraient être étiquetés Unk-9 à Unk-16.
2. Répétez l’étape 6.3 pour les colonnes de la bande PCR C (colonnes 10-12 pour P1 et P2). Ils devraient être étiquetés Unk-17 à Unk-24. Lorsque les étapes 6.2 à 6.3.2 sont terminées, les fenêtres de configuration de la plaque doivent ressembler à celles de la figure 5A, B.
Sélectionnez OK en bas à droite de la fenêtre de l’éditeur de plaques. Cliquez sur Oui pour appliquer les modifications lorsque vous y êtes invité.
Pour le contrôle de la qualité au niveau du test, assurez-vous que les courbes de l’onglet de quantification sont appropriées (p. ex., pas de courbes d’amplification inversées) pour les étapes 9 et 12 du profil de thermocyclage, qui correspondent respectivement aux amplicons des télomères et de l’albumine. Les courbes sont accessibles par le menu déroulant situé au milieu à droite de la fenêtre du logiciel. Les figures 6A et B montrent les courbes appropriées.
1. S’assurer que l’efficacité de la PCR indiquée à l’étape 9 et à l’étape 12 se situe entre 90 % et 110 % et que ces deux efficacités ne diffèrent pas l’une de l’autre de plus de 10 % (c.-à-d. que 92,4 % pour l’étape 9 et 98 % pour l’étape 12 sont appropriés, mais que 92,4 % pour l’étape 9 et 108 % pour l’étape 12 ne sont pas appropriés). De plus, assurez-vous que la courbe R² standard est de >0,995. Si P1 ou P2 ne répond pas à ces critères, les plaques doivent être refaites.
Pour P1, sélectionnez l’étape 9 et mettez en surbrillance les 21 puits correspondant à la courbe standard, comme le montre la figure 6A,B. Copiez les valeurs Cq dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel. Ouvrez le modèle de feuille de données des télomères disponible en tant que fichier supplémentaire 1 et collez ces valeurs dans la feuille standard 1, colonne B. Sélectionnez Étape 12, puis copiez ces valeurs Cq. Collez ces valeurs dans la feuille standard 1, colonne I.
1. Identifiez la valeur de pente à l’étape 9 et saisissez-la dans la cellule C4 de la feuille standard 1. Identifiez la valeur de pente à l’étape 12 et saisissez-la dans la cellule J4 de la feuille standard 1.
  REMARQUE : Le système calcule le pourcentage d’efficacité des amorces à l’aide des pentes de la courbe standard identifiée à l’étape 6.6.1. Le pourcentage d’efficacité peut être calculé manuellement à l’aide de la formule suivante :
2. S’assurer que le coefficient de variation (CV) de chaque trilot de dilution standard est inférieur à 0,1. S’ils sont supérieurs ou égaux à 0,1, exclure jusqu’à trois puits individuels au total de toutes les concentrations d’échantillons témoins inclus dans la courbe de dilution en série standard à 7 points sur la plaque. Un seul puits doit être exclu d’un ensemble en trois exemplaires.
  REMARQUE : L’exclusion des points standard de l’analyse sur le logiciel modifiera la pente, R, l’ordonnée à l’origine et l’efficacité des deux amorces. Ainsi, une fois qu’un puits étalon a été retiré de l’analyse, les étapes 6.5.1 à 6.6.1 doivent être répétées.
3. Répétez les étapes 6.6.1 à 6.6.2 pour le fichier d’analyse P2 et la feuille standard 2 correspondante.
4. Ce n’est que lorsque les feuilles standard 1 et standard 2 sont remplies avec des CV acceptables que les données d’échantillon individuelles sont collectées à partir des fichiers d’analyse. Assurez-vous que les ajustements du CQ sont déclarés dans la colonne L de la feuille P1 par rapport à la colonne P2, p. ex., combien de puits ont été exclus dans le fichier d’analyse P1.
Assurez-vous que seuls les 72 puits d’échantillonnage du fichier d’analyse P1 sont mis en surbrillance en bleu dans l’onglet Quantification, comme indiqué dans Graphique 7A,B. Choisir Étape 9. Copiez les valeurs Cq et SQ dans le coin inférieur droit de la fenêtre du logiciel. Collez ces valeurs dans la feuille P1 de l’échantillon, en commençant par la cellule D3. Choisir Étape 12 puis copiez ces valeurs Cq et SQ, et collez-les dans la feuille P1 des échantillons, en commençant par la cellule F3.
1. Répétez cette étape pour les échantillons du fichier d’analyse P2 et de la feuille P2 correspondante. Les rapports télomères/copies simples (T/S) (colonne H) sont calculés automatiquement, mais peuvent être calculés manuellement à l’aide de la formule suivante :
  
  Où E_T/S est l’efficacité de l’amplification exponentielle pour les réactions ciblant respectivement le gène des télomères ou des copies uniques, et Cq_T/Sest le cycle auquel une réplique donnée ciblant le contenu télomérique ou le gène à copie unique atteint le seuil critique de quantification de la fluorescence. Les rapports T/S moyens (colonne I) sont calculés sur six mesures par échantillon.
  REMARQUE : Les numéros d’identification de l’échantillon en CFX ne correspondent pas au même échantillon biologique sur les deux plaques. Le modèle de fiche technique des télomères tient compte de cette différence et alignera les triplets en double appropriés.
2. Dans CFX Maestro, vérifiez que les valeurs Cq de tous les échantillons analytiques se situent entre la valeur Cq la plus basse et la valeur Cq la plus élevée de la courbe standard, comme le montre la figure 7B. Si un échantillon se trouve en dehors de la plage comme le montre la figure 7A, il devra être analysé à nouveau après ajustement de la concentration. Un échantillon dont la valeur Cq est inférieure à l’étalon de concentration le plus élevé doit être dilué par un facteur approximatif au nombre de cycles d’amplification où il est hors de portée, et un échantillon dont la valeur Cq est supérieure à l’étalon de concentration le plus bas devrait être concentré par un facteur approximatif au nombre de cycles d’amplification au-delà du seuil.
  REMARQUE : Une grande variation de la concentration des échantillons analytiques introduit un niveau potentiel supplémentaire de variation et doit être effectuée avec prudence.
3. S’assurer que la concentration initiale dans le NTC était inférieure à 5 % de la quantité moyenne d’ADN présente dans les puits d’échantillons. Cela peut être vérifié en visualisant le pourcentage de contamination de l’eau sur les feuilles des échantillons P1 et P2 du MMqPCR. Si le NTC indique une contamination, relancez les plaques.
  REMARQUE : En raison de la sensibilité du test MMqPCR, une contamination mineure incontrôlable peut occasionnellement provoquer une amplification des puits NTC. Cependant, cette amplification doit être mineure et se produire plusieurs cycles après l’amplification du gène à copie unique à l’étape 12 du protocole de thermocyclage.
4. Pour le contrôle de la qualité au niveau de l’échantillon, examinez les écarts-types (ET) (colonne J) et les CV (colonne K) dans les échantillons P1 et les exemples de feuilles P2. S’assurer que les CV intraplaques sur les rapports T/S triples de l’échantillon sont inférieurs à 0,10 (10 %). Pour corriger tout CV intraplaque supérieur à 0,1, un rapport T/S d’un ensemble de triplets peut être exclu.
  REMARQUE : Une seule répétition totale des six mesures par échantillon peut être exclue, c’est-à-dire qu’une répétition pour le même échantillon ne peut pas être exclue à la fois sur P1 et P2.
5. Vérifiez que les CV interplaques de chaque échantillon dans la feuille P1 v P2, colonne G, sont inférieurs à 0,05 (5%). Pour corriger tout CV supérieur à 0,05, effectuez l’exclusion d’un rapport T/S des six mesures par échantillon sur les deux plaques. Exclure les échantillons après inspection visuelle sur les triplets intraplaques et les six mesures si nécessaire.
  REMARQUE : Seuls les échantillons satisfaisant à ces critères de CQ, CV intraplaque < 10 % et CV interplaque < 5 %, peuvent être inclus dans les résultats finaux de TL. Sinon, l’échantillon doit être exclu des fiches techniques P1 v P2 et ICC pour cette analyse, et l’échantillon doit être réévalué lors d’un deuxième test MMqPCR.
6. Pour le contrôle de la qualité au niveau de la plaque, vérifiez que la variation intraplaque moyenne entre tous les échantillons de chaque plaque, située au bas des feuilles des échantillons P1 et P2, est inférieure à 0,05 (5 %). Pour un contrôle de la qualité supplémentaire au niveau de la plaque, vérifiez que la variation globale entre les plaques dans la feuille P1 par rapport à la feuille P2, cellule G29, est inférieure à 0,06 (6 %). Assurez-vous que les échantillons qui n’ont pas réussi le CQ sont retirés du calcul du CV interplaque dans la cellule G30.
  REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des groupes d’échantillons associés (par exemple, des membres de la famille, des points temporels différents, etc.), tous les échantillons d’un groupe doivent être analysés sur la même plaque. Par conséquent, si un échantillon du groupe ne satisfait pas aux critères de contrôle qualité, tous les échantillons du groupe doivent être réanalysés.
7. Dans un fichier de données global de cohorte ou d’expérience distinct, enregistrez les données finales de CQ pour chaque échantillon qui a réussi le CQ (feuille P1 v P2, colonne I), les calculs ICC pour chaque échantillon qui a réussi le CQ (feuille de données ICC, colonnes E-K) et les données finales du test QC de la feuille P1 v P2 (colonnes J-L)
Utilisez le fichier supplémentaire 2 créé par le Telomere Research Network (TRN) pour calculer l’ICC pour le projet²⁰.
Enfin, pour améliorer la comparabilité entre les études TL, transformez les données TL finales pour chaque échantillon de la cohorte globale distincte ou du fichier de données d’expérience en scores Z à l’aide de l’équation suivante où le rapport T/S moyen pour tous les échantillons de la cohorte est soustrait du rapport T/S de l’échantillon individuel, puis divisé par l’ET pour tous les échantillons de la cohorte.

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Figure 5 : Configuration logicielle de la plaque. (A) Configuration logicielle d’une plaque P1 après avoir terminé les étapes 6.2 à 6.4. (B) Configuration logicielle d’une plaque P2 après avoir terminé les étapes 6.2 à 6.4. Les ID d’échantillon et de norme ne sont pas alignés entre les deux plaques CFX en raison de la façon dont le logiciel attribue les ID d’échantillon en fonction de la position du puits (c’est-à-dire que l’échantillon CFX 1 sur P1 est l’échantillon CFX 24 sur P2). Le modèle Excel fourni dans le fichier supplémentaire 1 en tient compte, en veillant à ce que les mesures interplaques effectuées sur le même échantillon biologique soient correctement alignées les unes par rapport aux autres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Courbes standard pour les amplicons del’élomère et de l’albumine. (A) Cette courbe standard provient de l’amplicon du télomère P1 de l’ensemble de données de résultats représentatifs. Une norme a été supprimée parce qu’elle ne répondait pas aux critères de CQ. (B) Cette courbe standard provient de l’amplicon d’albumine P2 de l’ensemble de données de résultats représentatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Amplicons de télomères et de gènes à copie unique. (A) Amplification des télomères et (B) amplification du gène de l’albumine d’échantillons rapportés dans des résultats représentatifs affichés dans le logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Communication des données MMqPCR

Lorsque vous rapportez les résultats de la recherche à l’aide des données TL créées à partir du MMqPCR, assurez-vous de déclarer les éléments décrits dans les directives minimales de déclaration TRN. Ces lignes directrices se trouvent sur le site Web du RRT (https://trn.tulane.edu/resources/reporting-guidelines/) et un modèle de déclaration de ces informations est fourni dans le dossier supplémentaire 3. Citez ce protocole et d’autres directives et ressources TRN, le cas échéant.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats présentés dans les tableaux 4 et 5 offrent un exemple de mesures TL hautement reproductibles obtenues en suivant le protocole. Pour ces résultats, l’ADN a été extrait de 24 échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’un kit commercial conformément aux directives du fabricant. Ces 24 échantillons ont été analysés sur deux plaques de 96 puits. La qualité de tous les échantillons d’ADN a été vérifiée à l’aide d’un spectrophotomètre et d’un fluorimètre, à l’aide du rapport moyen de 260/280, du rapport moyen de 260/230 et de la concentration d’ADNdb pour déterminer l’admissibilité au test et le facteur de dilution de l’échantillon (tableau 6). Le tableau 6 souligne également l’importance de quantifier la concentration d’ADNdb, qui peut différer de la concentration d’ADN mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. Cette variabilité est le résultat de différentes approches de quantification. Plus précisément, le spectrophotomètre calcule la concentration d’ADN en fonction de l’absorption à 280 nm et est sensible aux fluctuations dues aux contaminants (par exemple, protéines, sel, etc.) affectant les lectures d’absorbance. En revanche, les concentrations d’ADNdb mesurées à l’aide d’un fluorimètre sont déterminées par la fluorescence d’un colorant qui se lie spécifiquement à l’ADNdb et, en tant que tel, sont présumés refléter plus fidèlement le contenu de l’ADN. Les échantillons d’ADN ont subi jusqu’à trois cycles de congélation-décongélation avant l’analyse MMqPCR TL. L’ADN témoin a été créé à partir d’extractions d’ADN groupées de PBMC d’un individu, qui ont été utilisées pour créer une dilution en série en sept points de 2 ng/μL à 0,0313 ng/μL d’ADN. Les courbes standard indépendantes créées pour l’étape 9 de la PCR (amplicon des télomères) et l’étape 12 (amplicon du gène à copie unique, albumine dans ce protocole) sont présentées dans la figure 6A, B. Les tests ont été effectués sur un système commercial de détection PCR en temps réel qui a généré une courbe de fusion qui montre les produits d’amplicon individuels fabriqués à des températures distinctes, comme le montre la figure 8.

Tableau 4 : Données de sortie de la mesure MMqPCR pour des résultats représentatifs optimaux. Rapports T/S moyens, écarts-types, CV et TL notés Z pour 24 échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Sortie des données de longueur des télomères. Les données brutes du test MMqPCR sont analysées dans le logiciel, puis ajoutées au modèle de tableur joint en tant que fichier supplémentaire 1 pour une analyse plus approfondie et un contrôle de la qualité. Cette feuille de sortie de modèle TL présente un résumé des données, affichant les ID d’échantillon, les TL, les SD et les CV moyens pour chaque échantillon sur les deux plaques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Indicateurs de qualité de l’ADN du spectrophotomètre et du fluoromètre pour les résultats d’échantillons. Données de contrôle qualité provenant de l’analyse d’un spectrophotomètre en double et de la mesure au fluoromètre unique de l’ADNdb et de tout contaminant par échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Figure 8 : Exemple de courbe de fusion. Courbe de fusion pour les données d’échantillon telles que générées dans le logiciel. Le pic antérieur ~80 °C représente l’amplicon des télomères et le pic secondaire à ~89 °C représente l’amplicon de l’albumine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour ce projet, l’efficacité moyenne des télomères était de 98,6 % avec une plage de 90,7 à 102,1 et l’efficacité moyenne de l’albumine était de 102,3 % avec une plage de 93,6 à 108,2 sur toutes les chaînes. Il y a eu une moyenne de 0,97 réplicats retirés des courbes standard, ce qui répond aux critères de CQ de ce protocole. Le CV interplaque moyen était de 1,83 % avec un écart-type de 0,00616 et le CV intraplaque moyen était de 3,78 % avec un écart-type de 0,00658. Les LT moyennes pour ces échantillons représentatifs sont présentées dans les tableaux 4 et 5. Le LT moyen était de 1,37 avec un écart-type de 0,24 et une plage de 0,84 à 2,32. Le rapport T/S, l’écart-type, le CV et le TL noté Z par échantillon sont indiqués dans le tableau 4. Étant donné que le rapport T/S du test MMqPCR est une mesure relative de TL, les rapports ont été transformés en ce score Z pour permettre une comparaison entre les études. L’ICC pour ce projet a été calculé à l’aide du script R, comme décrit dans les directives TRN trouvées dans le fichier supplémentaire 2, en tenant compte des effets de lot et d’exécution²⁰. Afin de calculer l’ICC intra-projet, nous avons réanalysé 10 % des échantillons réussis, en veillant à remplir les plaques ICC avec au moins un échantillon de chaque plaque de la cohorte. L’ICC global du projet de 0,801 [IC : 0,703, 0,86] indique la haute reproductibilité des résultats TL.

Tous les résultats ne seront pas optimaux. Les résultats de la figure 9 et du tableau 7 montrent des résultats sous-optimaux du test MMqPCR. La figure 9 montre une courbe standard avec une efficacité des télomères inférieure à 90 %, ce qui est inférieur aux normes de contrôle qualité, nécessitant que la plaque entière soit répétée. Les problèmes d’efficacité des amorces sont généralement dus à un problème avec les réactifs, il est donc important de suivre les dates d’aliquote des réactifs et leur date d’expiration comme première étape pour déterminer quel réactif est responsable d’une faible efficacité. Les réactifs périmés doivent être remplacés avant que la plaque ne soit à nouveau utilisée. Le tableau 7 montre une plaque qui a satisfait aux critères de CQ initiaux au niveau de l’échantillon, mais qui présente un niveau élevé de variabilité entre les plaques, ce qui a conduit à une défaillance du CQ au niveau de la plaque. Les variations entre les plaques sont généralement dues à des erreurs dans les techniques de pipetage et de remplissage des plaques. Dans ce cas, le technicien doit évaluer tout problème survenu lors de l’installation de la plaque et s’assurer que les pipettes sont calibrées.

figure-results-2
Figure 9 : Résultats sous-optimaux. Cette courbe standard affichée dans le logiciel n’a pas réussi à passer le contrôle qualité, car l’efficacité de l’amplification de l’amorce des télomères était inférieure à 90 %. L’image provient de P1, mais P2 avait des rendements tout aussi faibles. Les données de cette analyse n’ont pas pu être utilisées et tous les échantillons ont dû être analysés à nouveau après avoir remplacé le réactif causal qui avait expiré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 7 : Résultats sous-optimaux. Le tableau présente le modèle de données de télomères pour une série où de nombreux échantillons n’ont pas satisfait aux normes de contrôle qualité. Les échantillons qui devaient être analysés à nouveau ont été déterminés en fonction des valeurs CV, puis le nom de l’échantillon a été remplacé par une police rouge pour une identification facile. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1 : Modèle de feuille de calcul de données télomères. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Calcul ICC. Ce protocole a été créé par le Telomere Research Network (TRN). Ce fichier a été modifié au lieu de²⁰. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Lignes directrices pour la production de rapports TRN. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode de mesure de la TL la plus couramment utilisée dans les grandes études basées sur la population, avant 2002, était l’analyse par transfert de Southern des longueurs de fragments de restriction terminale (TRF)^24,25. La TRF, bien qu’elle offre une excellente précision et reproductibilité dans des laboratoires spécialisés, est limitée en applicabilité en raison de la quantité et de la qualité de l’ADN requis et du débit limité, fournissant ainsi la toile de fond pour l’utilisation accrue des tests TL basés sur la qPCR, et par conséquent du test MMqPCR. La méthode MMqPCR TL fournit une mesure TL reproductible lorsqu’elle est configurée, optimisée et maintenue avec une attention particulière à chaque critère de QC. Le calcul et la communication de l’ICC spécifique pour chaque cohorte analysée sont nécessaires pour garantir la fiabilité du test. Bien qu’elle soit soumise à la qualité de l’ADN et à l’expertise technique, la méthode MMqPCR est bien adaptée aux grandes études de population portant sur le TL, car elle nécessite de petites quantités d’ADN, est plus fiable que la PCR singleplex et est plus efficace en termes de coûts de réactifs et de temps de technicien que les autres méthodes. La capacité de générer des CCI élevées fournit des données supplémentaires à l’appui de l’utilisation de la MMqPCR pour les grandes études de TL basées sur la population. La mesure de la TL MMqPCR peut être appliquée à un large éventail d’études cherchant à définir le rôle de la TL en tant que biomarqueur de la mortalité toutes causes confondues, du vieillissement, du stress au cours de la vie, des expositions environnementales et des résultats de santé physique tels que les maladies cardiovasculaires et le cancer 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28^, 29,30,31.

L’une des limites de la méthode MMqPCR est qu’elle rapporte TL sous la forme d’un rapport T/S, une estimation relative de la longueur qui varie en fonction de la sélection du gène à copie unique, de la composition du mélange maître et des paramètres de cycle de PCR³². Le rapport T/S est sans unité. Ainsi, sans être combinée avec d’autres méthodologies de mesure TL, cette méthode est incapable de rapporter des estimations en valeurs de paire de bases 18,33,34. Par conséquent, le rapport T/S doit être transformé en un score Z pour être pertinent dans les études³⁵. Il faut faire preuve d’une grande prudence lorsqu’on fait cela dans les laboratoires, les méthodes et les essais. De plus, cette méthode, comme les tests d’hybridation sur gel, peut inclure la quantification des télomères interstitiels. Cependant, ces séquences comprennent une très faible proportion du contenu total de l’ADN des télomères par génome. De plus, les séquences télomériques interstitielles sont plus susceptibles de contenir des séquences de paires de bases non appariées qui s’écartent des répétitions de télomères canoniques, ce qui diminue la probabilité de liaison et d’amplification de l’amorce. De plus, bien que la quantité minimale d’ADN nécessaire pour le test MMqPCR soit avantageuse, il est important de noter que les mesures de TL basées sur la qPCR sont influencées par des facteurs pré-analytiques ayant un impact sur la qualité et l’intégrité de l’ADN, notamment les conditions de stockage des échantillons, la méthodologie d’extraction de l’ADN et les tissus biologiques^36,37. Il a été démontré que le contrôle analytique de ces facteurs peut améliorer la validité externe des mesures TL générées à l’aide de la qPCR³⁸. Malgré cela, l’impact des différences de qualité de l’ADN sur le TL généré par le test MMqPCR doit être évalué systématiquement, car il n’existe actuellement aucune directive fondée sur des données permettant de déterminer si un échantillon est de qualité suffisante pour générer une estimation précise du TL à l’aide de cette approche. Malgré ces limites, les applications de ce test pour les études sur les résultats de santé au niveau de la population sont considérables.

Lors de l’utilisation du test MMqPCR, une évaluation continue de la précision et du débit est nécessaire. Tel qu’il est actuellement conçu, les techniciens analysent simultanément des triplés d’échantillons sur des plaques dupliquées à l’aide de deux thermocycleurs. En l’absence de plusieurs thermocycleurs, nous recommandons de conserver les mesures en double et les plaques de fonctionnement de manière séquentielle pour une précision accrue, même au prix d’une diminution du débit. Toute décision de privilégier le débit à la précision, par exemple en utilisant des mesures uniques en trois exemplaires, doit être accompagnée d’essais et d’une évaluation approfondis des CCI résultants avant de procéder à l’analyse des échantillons analytiques. Lorsque l’on prend des décisions concernant le débit et la précision, il faut prendre en considération la taille de l’échantillon et la qualité de l’ADN de l’échantillon. Une taille d’échantillon plus petite ou des échantillons d’ADN de mauvaise qualité nécessitent une précision plus élevée²³. Ceci est encore plus important lorsque l’on travaille avec des échantillons de groupes apparentés (par exemple, des membres de la famille, des sujets avec plusieurs points temporels). Dans ces cas, une planification minutieuse, par exemple l’attribution d’échantillons apparentés à la même plaque avant de commencer l’expérience, est un moyen d’éviter la perte de puissance statistique due à une confusion accidentelle groupe par plaque.

Pour ce test, un spectrophotomètre a été utilisé pour évaluer la qualité de l’échantillon d’ADN : des échantillons compris entre 1,6 et 2,0 pour les rapports 260/280 et entre 2,0 et 2,2 pour les rapports 260/230 ont été jugés acceptables. Cette évaluation de la qualité et l’évaluation précise de l’ADN double brin via un fluorimètre sont des étapes critiques de ce protocole pour obtenir des données TL reproductibles. D’autres mesures plus descriptives de l’intégrité de l’ADN, telles que la taille des fragments et/ou des mesures sommaires de la qualité de l’ADN déterminées par gel d’agarose (par exemple, le numéro d’intégrité de l’ADN) peuvent également être utilisées pour déterminer la qualité de l’échantillon³⁸. Nous recommandons également que la dilution des échantillons ne se produise qu’au moment de la préparation de l’échantillon pour l’exécution du test MMqPCR. Cela permet de s’assurer que les aliquotes d’ADN subissent le moins de manipulation possible après l’extraction, ce qui réduit la variabilité de la manipulation avant le dosage. Si des échantillons d’ADN doivent être transportés, ils doivent être expédiés sur de la glace sèche à la concentration la plus élevée possible afin d’atténuer la dégradation qui se produit dans les échantillons d’ADN à des concentrations plus faibles^39,40. En raison de la dégradation de l’ADN qui se produit lors des cycles de gel-dégel, le nombre de gels-dégels pour stocker l’ADN devrait être réduit au minimum⁴¹. Des aliquotes de l’ADN témoin combiné doivent être créées avant l’exécution de la cohorte et des aliquotes d’échantillons d’ADN analytiques individuels doivent être créées avant l’exécution de l’essai.

Les indicateurs clés de la performance du test et du contrôle qualité comprennent le signal NTC, les CV interplaques et intraplaques et la courbe standard R². Le non-respect des critères de CQ peut être atténué de plusieurs façons. Le fait de changer régulièrement les stocks de PCR de grade H₂O et d’aliquote des sous-stocks de PCR de grade H₂O pour chaque paire de plaques permet de minimiser les sources de contamination ainsi que l’amplification du NTC. Les étapes supplémentaires pour réduire la contamination comprennent les suivantes : désigner un capuchon PCR spécifique dédié uniquement aux tests MMqPCR ; essuyer la cagoule et l’équipement de PCR avec une solution décontaminante d’ADN ; irradier la pièce avec une lumière ultraviolette ; et la pratique de la technique stérile dans la cagoule PCR. Pour améliorer la répétabilité du test et réduire les CV, il est recommandé d’utiliser vigoureusement les échantillons de vortex, les dilutions et les bandelettes de PCR à leurs étapes de vortex respectives et de les remettre en suspension complètement lors du pipetage des échantillons d’ADN. Une courbe R² inférieure au seuil standard (<0,995) est très probablement attribuable à des erreurs de pipetage lors du chargement de la plaque. Pour éviter cela, faites très attention à un pipetage précis et calibrez les pipettes chaque année, mélangez vigoureusement les bandelettes PCR standard avant le chargement et organisez soigneusement les fournitures pour favoriser un flux de travail efficace. Si l’utilisation de deux machines et d’une plaque permet d’obtenir des CV constamment plus élevés, la machine doit être entretenue comme un moyen potentiel d’améliorer le problème. Des plaques de contrôle qualité du fabricant doivent être appliquées régulièrement sur les plaques pour évaluer les performances du thermocycleur.

Si les problèmes persistent même après l’application des étapes recommandées ci-dessus, les étapes suivantes peuvent être utilisées pour dépanner le protocole. Garder une trace de la date d’aliquote de tous les réactifs et de toutes les dates d’expiration pertinentes peut aider à rationaliser le processus de dépannage lorsque des difficultés surviennent inévitablement. Une partie importante de tout processus de dépannage consiste à n’ajuster qu’un seul réactif à la fois pour déterminer la cause spécifique des plaques qui ne répondent pas aux critères de contrôle qualité, en commençant par le réactif le moins cher en question. Par exemple, si le télomère et le gène de copie unique ont tous deux une faible efficacité, les réactifs partagés tels que le DTT, les dNTP ou l’aliquote SYBR sont plus susceptibles d’en être la cause que les amorces spécifiques aux amplicons. Au prix indiqué, les nouvelles aliquotes doivent être testées dans l’ordre de la DTT, puis des dNTP, et enfin, si le problème persiste, de nouvelles aliquotes SYBR. À l’inverse, si un seul des amplicons (télomère ou gène à copie unique) a une faible efficacité, la cause de la difficulté est plus probablement l’une des amorces. L’interprétation des pics de la courbe de fusion présentés à la figure 8 peut servir de source d’informations clés pour le dépannage. La visualisation des deux pics de la courbe de fusion peut être utilisée pour identifier les problèmes potentiels avec un échantillon particulier, car un échantillon problématique individuel se démarquera de la tendance générale des pics présentés par les étalons ou les échantillons analytiques restants. La courbe de fusion peut également être utilisée pour diagnostiquer des problèmes avec une amorce particulière si les pics d’un amplicon donné sont systématiquement moins nets que l’autre.

Ce manuscrit détaille comment mettre en place avec succès le test MMqPCR pour mesurer le TL avec une large applicabilité à la recherche en santé publique et présente des recommandations clés pour le CQ et le dépannage dans le but d’accroître l’accessibilité et la fiabilité de cette méthode efficace et rentable.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier le comité consultatif du réseau de recherche sur les télomères et le financement du National Institute on Aging / National Institute of Environmental Health Sciences (U24 AG066528 et U24 AG066528-S1) qui ont rendu ce travail possible.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de 0,5 ml	USA Scientific	1605-0099	Tubes de microcentrifugation Seal-Rite de 0,5 ml, stériles Température et conditions de stockage : Température ambiante
Tubes de 1,5 ml USA	Scientific	1615-5599	Tubes de microcentrifugation Seal-Rite de 1,5 ml, stériles Température et conditions de stockage : Température ambiante
100 mM DTT	en interne	Non applicable	Fabriqué avec du DTT d’origine, de l’acétate de sodium dilué et des PCR de qualité H₂O Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
Tubes de 15 ml	Thermo Fisher	14-959-53A	Corning 352196 Falcon Tubes à centrifuger coniques de 15 ml Température et conditions de stockage : Température ambiante
1M MgCl₂	Thermo Fisher	50152107	Biotang Inc 1M MgCl₂ 1M Solution de chlorure de magnésium, préparée dans de l’eau de 18,2 Megohms et filtrée à travers un filtre de 0,22 micron Température et conditions de stockage : 4 ° ; C ;
1x Tampon d’or	interne	Non applicable	10X Tampon d’or dilué avec PCR Grade H₂O Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
25 mM de dNTPs	New England BioLabs	N0446S	Ensemble de solutions de désoxynucléotides Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
Tubes de 5 ml	Thermo Fisher	3391276	Argos Technologies Tubes de microcentrifugation > 5 mL
Plaque à 96 puits	Plaque Bio-Rad	HSP9601	Plaque PCR à coque dure à 96 puits, profil bas, paroi mince, jupe, blanc / transparent Température et conditions de stockage :
Température ambiante Feuille d’aluminium	Bureau Depot	3489072	Rouleau de papier d’aluminium Reynolds Wrap Stanard, 12" x 75', argent Température et conditions de stockage : Température ambiante
AmpliTaq Gold Kit &ndash ; Polymérase et tampon	Thermo Fisher	4311806	AmpliTaq Gold DNA polymérase avec tampon d’or et MgCl₂ (MgCl₂ dans ce kit n’est pas utilisé), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
Bétaïne	Thermo Fisher	AAJ77507AB	Bétaïne, solution 5M, qualité biologie moléculaire, ultrapure, 10mL Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
Big Tube Rack	Thermo Fisher	344817	Fisherbrand Rack de tubes à 4 voies Température et conditions de stockage : Température ambiante
Logiciel CFX Maestro Logiciel	Bio-Rad	12004110	pour la configuration des plaques de PCR en temps réel, la collecte de données, les statistiques et la représentation graphique des résultats Température et conditions de stockage : Température ambiante
Module de réaction optique CFX96 pour les systèmes de PCR en temps réel avec pack de démarrage	Bio-Rad	1845096	Module optique à 96 puits pour la PCR en temps réel Température et conditions de stockage :
DTT	Fisher Scientific	AAJ1539706	Dithiothreitol, >99.5+ Biologie moléculaire Grade, 5 g Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C ;
ELIMINase	Fisher Scientific	04-355-32	ELIMINase Laboratory Decontaminant Température et conditions de stockage : Température ambiante
Filtre HEPA	USA Scientific	Filtres	particules à haute efficacité pour postes de travail AirClean Température et conditions de stockage : Température ambiante
Kimwipes	Thermo Fisher	06666A	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Essuie-glaces Kimwipes Delicate Task, 1 pli Température et conditions :
Auge de chargement	Thermo Fisher	14387069	Thermo Scientific Matrix Réservoirs de réactifs Température et conditions de stockage : Température ambiante
Microsoft Excel	Microsoft	Sans objet	Package Microsoft 365, application logicielle Excel Température et conditions de stockage :
Mini centrifugeuse	Genesee Scientific	31-500B	Poseidon 31-500B Mini centrifugeuse, Blue Lid Température et conditions de stockage : Température ambiante
PCR Grade H₂O	Thermo Fisher	AM9937	Eau sans nucléases (non traitée DEPC) Température et conditions de stockage :
Température ambiante PCR Hood	USA Scientific	4263-2588	Station de travail d’acide nucléique avec filtration HEPA, AirClean Systems Combination PCR Workstation Température et conditions de stockage :
Bandes PCR à	Thermo Fisher	AB0776	Tubes à profil bas et bouchons plats, bandes de 8 Température et conditions de stockage :
Rack de tubes PCR	Thermo Fisher	344820	Fisherbrand Rack de tubes PCR à 96 puits Température et conditions de stockage :
Pointes de pipette à température ambiante (multicanaux)	Pointes	de	pipette 17005860 Ranin SR LTS 20µ ; L F 960A/5, 20µ ; L Maximum Température et conditions de stockage :
Pointes de pipette à température ambiante (monocanal)	USA Scientific	1181-3850	10µ ; L Pointes de filtre RPT graduées TipOne Température et conditions :
Pointes de pipette à température ambiante (monocanal)	USA Scientific	1180-1850	20µ ; L Embouts filtrants biseautés TipOne RPT Température et conditions de stockage :
Embouts de pipette à température ambiante (canal unique)	USA Scientific	1111-0880	200µ ; L Natural TipOne Pipette Tips in Racks Température et conditions de stockage :
Pointes de pipette à température ambiante (monocanal)	USA Scientific	1111-2890	1000µ ; L Natural Graduation TipOne Pipette Tips in Racks Température et conditions de stockage :
Pipetteurs à température ambiante (multicanaux)	Ranin	17013802	Pipet-Lite Multi Pipette L8-10XLS, 0,5 à 10µ ; L Température et conditions de stockage :
Pipetteurs à température ambiante (multicanaux)	Ranin	17013803	Pipet-Lite Multi Pipette L8-20LS+, 2 à 20µ ; L Température et conditions de stockage :
Pipetteurs à température ambiante (monocanal)	Pipettes Thermo Fisher	F144802G	Gilson Pipetman Classic, 1 à 10µ ; L Température et conditions de stockage :
Pipetteurs à température ambiante (monocanal)	Thermo Fisher	F123600	Gilson Pipetman Classic Pipets, 2 à 20µ ; L Température et conditions de stockage :
(monocanal)	Thermo Fisher	F123601	Gilson Pipetman Pipettes classiques, 20 à 200µ ; L Température et conditions de stockage :
Pipetteurs à température ambiante (monocanal)	Thermo Fisher	F123602	Gilson Pipetman Classic Pipets, 200 à 1000µ ; L Température et conditions de stockage : Plaque à température ambiante
Film d’étanchéité	Bio-Rad	MSB1001	Microseal " B” Film d’étanchéité de plaque PCR, adhésif, optique Température et conditions de stockage : Température ambiante
Plaque Spinner	Thermo Fisher	14-100-141	Fisherbrand Mini Plate Spinner Centrifugeuse, 230 V Température et conditions de stockage : Température ambiante
Pré-Hood Filter	USA Scientific	4235-3724	Préfiltre pour systèmes AirClean Workstations Température et conditions de stockage : Pièce température
R Software	The R Project for Statistical Computing	Non applicable	R version 4.2.2 Température et conditions de stockage :
Échelle à	Thermo Fisher	01-922-329	OHAUS 30430060 PR Series Balance analytique, capacité de 62 g Température et conditions de stockage :
Ciseaux	à	458612	Ciseaux de marque Office Depot, 8", Droit, Noir, Paquet de 2 Température et conditions :
Température ambiante Sharpies Sharpie		2151734	Brush Twin Permanent Markers, Noir Température et conditions : Température ambiante
Single Copy Gene Forward Primer	Integrated DNA Technologies		CustomVoir tableau séparé Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C lorsqu’il est réhydraté
Amorce inverse de gène à copie unique Technologies	d’ADN intégrées	Personnalisé	Voir tableau séparé Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C lorsqu’il est réhydraté
Petit Tube Rack	Thermo Fisher	21-402-17	Thermo Fisher 8601 Supports de microtubes réversibles avec couvercle Température et conditions de stockage :
Acétate de sodium	Thermo Fisher	J63560. EQE	3M NaOAc pH 5.2 Température et conditions de stockage : Température ambiante
Spatule en acier inoxydable	Thermo Fisher	3990240	Bel-Art SP Scienceware Cuillère et spatule d’échantillonnage en acier inoxydable Température et conditions de stockage : Température ambiante
SYBR Vert	Thermo Fisher	S7563	SYBR Green I Teinture en gel d’acide nucléique &ndash ; Concentré 10 000X dans DMSO Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C lorsqu’il est réhydraté
Filtres à seringue	Fisher Scientific	09-927-55A	GD/X 25 mm Filtre à seringue stérile, milieu filtrant en acétate de cellulose, 0,2 & mu ; m Température et conditions de stockage :
Seringues	Thermo Fisher	148232A	BD Seringues jetables Luer-Lok sans aiguilles, 10mL Température et conditions de stockage :
Tampon TE	à	BP2474100	Tampon TE, Tris-EDTA, Solution 1X, pH 7,6, Biologie moléculaire, Fisher BioReagents Température et conditions de stockage : Température ambiante
Telomere Forward Primer	Integrated DNA Technologies	Custom	Voir tableau séparé Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C lorsqu’il est réhydraté
Amorce inverse de télomère	Technologies d’ADN intégrées	Personnalisé	Voir tableau séparé Température et conditions de stockage : moins 20 ° ; C lorsqu’il est réhydraté
Lumière UV	USA Scientific	4288-2540	Ampoule UV pour postes de travail Température et conditions de stockage : Température ambiante
Vortex	Thermo Fisher	14-955-151	Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz Température et conditions de stockage : Température ambiante
Weigh Boat	Thermo Fisher	01-549-752	Fisherbrand Pesée hexagonale stérile, 10mL Température et conditions de stockage : Température ambiante

à à température ambiante à température ambiante température ambiante à température ambiante Pipettes à température ambiante température ambiante température ambiante Bureau Depot à température ambiante à température ambiante température ambiante Fisher Scientific

Références

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Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227(2014).
Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304(2019).
Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).
D'mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).
Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).
Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).
Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).
Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246(2013).
Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247(2023).
Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).
Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098(2017).
Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).
RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).
Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: https://cran.r-project.org/ (2024).
Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

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PCR multiplex monochrome mesure des t lom res essai MMqPCR cellules mononucl es du sang p riph rique SYBR Green courbe standard r plicat technique contr le qualit de la plaque

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