Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

Zhongyue Guo; Yeran Bai; Fátima C. Pereira; Ji-Xin Cheng

doi:10.3791/66562

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Article de méthode

Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

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DOI :

10.3791/66562

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23 février 2024

Zhongyue Guo^*¹ , Yeran Bai^*²^,³ , Fátima C. Pereira⁴ , Ji-Xin Cheng¹^,⁵

¹Department of Biomedical Engineering, Boston University, ²Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, ³Photothermal Spectroscopy Corp., ⁴School of Biological Sciences, University of Southampton, ⁵Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant l’hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH), également connue sous le nom de FISH PHOTOTHERMIQUE DANS L’INFRAROUGE MOYEN (MIP-FISH), pour identifier les cellules individuelles et comprendre leur métabolisme. Cette méthodologie peut être largement appliquée à diverses applications, notamment la cartographie du métabolisme cellulaire avec une résolution unicellulaire.

Résumé

Comprendre les activités métaboliques des cellules individuelles au sein de communautés complexes est essentiel pour démêler leur rôle dans la maladie humaine. Ici, nous présentons un protocole complet d’identification cellulaire et d’analyse métabolique simultanées avec la plateforme OPTIR-FISH en combinant des sondes FISH marquées à ARNr et des substrats marqués par isotope. L’imagerie par fluorescence permet l’identification cellulaire par la liaison spécifique de sondes FISH marquées à ARNr, tandis que l’imagerie OPTIR fournit des activités métaboliques au sein de cellules individuelles par décalage vers le rouge induit par les isotopes sur les spectres OPTIR. En utilisant des bactéries cultivées avec ^{du 13}C-glucose comme banc d’essai, le protocole décrit la culture microbienne avec marquage isotopique, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la préparation des échantillons, l’optimisation de la configuration d’imagerie OPTIR-FISH et l’acquisition de données. Nous montrons également comment effectuer une analyse d’images et interpréter des données spectrales au niveau d’une cellule unique avec un débit élevé. La nature normalisée et détaillée de ce protocole facilitera grandement son adoption par des chercheurs de divers horizons et disciplines au sein de la vaste communauté de recherche sur le métabolisme unicellulaire.

Introduction

Le métabolisme cellulaire est un pilier fondamental de la biologie cellulaire, guidant de nombreux processus qui déterminent la santé, la fonction et l’interaction des cellules avec l’environnement. L’analyse du métabolisme au niveau des cellules individuelles, en particulier dans les environnements natifs, fournit des informations inestimables pour révéler les activités hétérogènes et complexes des systèmes biologiques¹. Ceci est particulièrement crucial dans l’étude des micro-organismes, car de nombreux microbes présentent des exigences de croissance uniques ou des dépendances environnementales qui remettent ....