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Hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH)

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DOI :

10.3791/66562

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23 février 2024

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1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole utilisant l’hybridation in situ par fluorescence infrarouge photothermique optique (OPTIR-FISH), également connue sous le nom de FISH PHOTOTHERMIQUE DANS L’INFRAROUGE MOYEN (MIP-FISH), pour identifier les cellules individuelles et comprendre leur métabolisme. Cette méthodologie peut être largement appliquée à diverses applications, notamment la cartographie du métabolisme cellulaire avec une résolution unicellulaire.

Résumé

Comprendre les activités métaboliques des cellules individuelles au sein de communautés complexes est essentiel pour démêler leur rôle dans la maladie humaine. Ici, nous présentons un protocole complet d’identification cellulaire et d’analyse métabolique simultanées avec la plateforme OPTIR-FISH en combinant des sondes FISH marquées à ARNr et des substrats marqués par isotope. L’imagerie par fluorescence permet l’identification cellulaire par la liaison spécifique de sondes FISH marquées à ARNr, tandis que l’imagerie OPTIR fournit des activités métaboliques au sein de cellules individuelles par décalage vers le rouge induit par les isotopes sur les spectres OPTIR. En utilisant des bactéries cultivées avec du 13C-glucose comme banc d’essai, le protocole décrit la culture microbienne avec marquage isotopique, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la préparation des échantillons, l’optimisation de la configuration d’imagerie OPTIR-FISH et l’acquisition de données. Nous montrons également comment effectuer une analyse d’images et interpréter des données spectrales au niveau d’une cellule unique avec un débit élevé. La nature normalisée et détaillée de ce protocole facilitera grandement son adoption par des chercheurs de divers horizons et disciplines au sein de la vaste communauté de recherche sur le métabolisme unicellulaire.

Introduction

Le métabolisme cellulaire est un pilier fondamental de la biologie cellulaire, guidant de nombreux processus qui déterminent la santé, la fonction et l’interaction des cellules avec l’environnement. L’analyse du métabolisme au niveau des cellules individuelles, en particulier dans les environnements natifs, fournit des informations inestimables pour révéler les activités hétérogènes et complexes des systèmes biologiques1. Ceci est particulièrement crucial dans l’étude des micro-organismes, car de nombreux microbes présentent des exigences de croissance uniques ou des dépendances environnementales qui remettent en question les méthodes de culture traditionnelles2. Par exemple, certaines espèces peuvent nécessiter des compositions nutritionnelles spécifiques ou des relations symbiotiques difficiles à reproduire en laboratoire, ce qui les rend non cultivables par les techniques standard3. De plus, les longues périodes nécessaires à la culture de certaines espèces posent des défis importants pour la recherche microbiologique, s’étendant souvent au-delà des délais pratiques d’étude et d’analyse. Pour contourner ces limitations, des méthodes alternatives telles que la réaction en chaîne par polymérase et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permettent d’identifier les espèces microbiennes sans nécessiter de culture4, ce qui permet d’obtenir une vue plus précise et holistique des écosystèmes microbiens. Cependant, ces technologies analytiques n’ont pas la capacité d’élucider le métabolisme cellulaire. Cette lacune met en évidence les défis actuels dans le domaine de la microbiologie : la tâche concomitante de différencier l’identité cellulaire et d’élucider le métabolisme au niveau de la cellule unique. Les progrès de techniques telles que la spectrométrie de masse par imagerie (MÉMO) couplée à des isotopes stables sont devenus des outils puissants pour l’analyse métabolique d’une seule cellule5. Dans ces expériences, des cellules ont été incubées avec des substrats contenant des isotopes tels que le 13C ou le 15N. Les biomolécules nouvellement anabolisées portent ces isotopes, ce qui les rend distinguables sur les spectres m/z. Cependant, l’IMS souffre d’une instrumentation coûteuse, d’une préparation d’échantillon compliquée, d’un débit relativement faible et de l’expertise requise pour analyser les spectres m/z. Lorsqu’il est combiné à l’imagerie de fluorescence spécifique aux marqueurs moléculaires, des progrès ont été réalisés dans l’élucidation du métabolisme cellulaire avec une spécificité accrue6. Néanmoins, des défis persistent pour faire le lien entre ces deux modalités. La différence de résolution entre l’IMS et l’imagerie de fluorescence, combinée à des configurations opérationnelles différentes, rend difficile l’alignement et la corrélation des résultats7.

L’intégration de l’imagerie spectroscopique vibrationnelle avec le marquage des isotopes stables offre une solution novatrice pour l’étude du métabolisme des cellules uniques. L’incorporation d’isotopes plus lourds ralentit la vibration des liaisons chimiques, ce qui entraîne des pics décalés vers le rouge dans les spectres vibrationnels8. Notamment, l’imagerie vibrationnelle fournit une résolution spatiale comparable à l’imagerie de fluorescence, et la quantification métabolique et l’identification cellulaire peuvent être effectuées dans une seule configuration, simplifiant ainsi l’enregistrement et la corrélation des images. Nos travaux récents ont démontré la combinaison d’une plateforme d’imagerie vibratoire avancée : l’infrarouge photothermique optique (OPTIR) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour sonder le métabolisme du glucose dans les communautés bactériennes9 (Figure 1). OPTIR est un système de microscopie spectroscopique vibrationnelle qui exploite l’effet photothermique de l’absorption dans l’infrarouge moyen en détectant le changement de lumière visible, ce qui fournit une résolution submicrométrique comme en microscopie optique, mais avec des informations spectroscopiques vibratoires supplémentaires provenant de l’absorption dans l’infrarouge moyen. La FISH est une technique couramment utilisée pour déterminer l’identité des micro-organismes au niveau de la cellule unique. La séquence d’oligonucléotides pourrait être conçue pour cibler des séquences 16S spécifiques de différents taxons, et différents fluorophores pourraient être attachés. L’hybridation spécifique des sondes oligonucléotidiques conçues avec l’ARNr cible conduit à de forts signaux de fluorescence des espèces cibles dans les cellules individuelles, et l’imagerie de fluorescence multicanal pourrait être réalisée pour identifier plusieurs espèces au sein de la population. Comme l’imagerie OPTIR et l’imagerie de fluorescence sont toutes deux basées sur la détection optique, la combinaison de la fluorescence OPTIR et FISH est simple à mettre en œuvre. Les deux modalités partagent la même résolution optique pour l’analyse d’une seule cellule et peuvent être commutées facilement sans nécessiter d’alignement ou de co-enregistrement supplémentaire.

Ce protocole présente un guide détaillé sur l’exploitation de la plateforme OPTIR-FISH pour l’analyse avancée de la structure et de la fonction d’une cellule unique. Nous avons utilisé les échantillons bactériens cultivés dans des milieux contenant du 13C-glucose comme banc d’essai et avons quantifié la synthèse de novo des protéines à partir du 13C-glucose. Afin de démontrer la capacité de la plateforme à identifier les cellules, nous avons utilisé des mélanges bactériens dans lesquels chaque espèce a été marquée à l’aide de sondes FISH ciblées sur l’ARNr. Cette approche a permis l’identification précise de souches bactériennes spécifiques, telles que Escherichia coli (E. coli) et Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), et leur métabolisme. Ce protocole offre aux chercheurs un outil puissant pour le profilage métabolique et l’identification simultanée des espèces au niveau de la cellule unique, promettant de faire progresser notre compréhension des interactions cellulaires, de la physiologie et de leurs rôles dans des environnements complexes.

Protocole

L’utilisation d’échantillons bactériens dans cette étude est conforme aux directives de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Université de Boston et du National Institute of Health.

REMARQUE : Le flux de travail général suivi dans ce protocole est résumé à la figure 2.

1. Culture bactérienne et marquage isotopique (figure 2A)

REMARQUE : L’exemple donné ici concerne l’étiquetage d’une culture bactérienne pure. Si l’on applique ce protocole à des communautés polymicrobiennes, le milieu et le temps de marquage doivent être ajustés en fonction de la communauté et de la physiologie des organismes d’intérêt.

  1. Inoculer la souche bactérienne d’intérêt à partir d’une seule colonie et pré-cultiver dans un milieu riche en nutriments tel que le bouillon de soja tryptique (TSB) ou le bouillon Luria-Bertani (LB) pendant 3 h pour atteindre la phase de croissance exponentielle (log). E. coli BW25113 est utilisée comme exemple de souche dans ce protocole.
    REMARQUE : Le temps pour atteindre la phase de bûche variera en fonction de la souche utilisée. Ce temps doit être adapté à chaque souche.
  2. Mesurer la densité optique à 600 nm pour estimer la concentration bactérienne.
  3. Préparez un milieu de croissance minimal complété par des substrats marqués isotopiquement. Pour E . coli BW25113, compléter le milieu minimal M9 avec du 13C-glucose à une concentration finale de 0,2 % (p/v).
    REMARQUE : Le 13-C-glucoseutilisé (D-glucose U−13C6, 99 %) a été universellement étiqueté, où tous les atomes de carbone ont été remplacés par des atomes de 13C. Le choix du milieu de croissance minimal dépendra de la souche bactérienne. Le choix du substrat isotopique dépendra du processus métabolique spécifique d’intérêt. L’objectif global est que le substrat isotopique serve de principale source de nutrition par rapport à leurs homologues non étiquetés.
  4. Diluer les bactéries dans le milieu de croissance minimal contenant le substrat marqué isotopiquement jusqu’à une concentration finale de 5 × 105 UFC/mL.
    REMARQUE : Habituellement, un taux de dilution élevé comme 1:100 est utilisé, et la nutrition non étiquetée du milieu riche devient négligeable. Alternativement, pour assurer l’élimination complète du milieu riche en nutriments, un lavage avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pourrait être effectué par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C et remise en suspension dans du PBS suivie d’une seconde centrifugation et d’une remise en suspension finale dans le milieu de croissance minimal.
  5. Cultivez des échantillons bactériens dans un incubateur à agitation orbitale dans des conditions de croissance optimales. En général, réglez l’incubateur à agitation orbitale à une vitesse de 220 tr/min et à une température de 37 °C, et placez les tubes de culture inclinés avec un capuchon lâche pour l’incubation aérobie. Pour E. coli, 24 h d’incubation aérobie à 37 °C sont généralement suffisantes pour atteindre un marquage maximal de 13°C.
    REMARQUE : Le temps d’incubation dépend du processus métabolique d’intérêt. Un temps d’incubation plus long conduit généralement à un marquage isotopique plus élevé. Une mesure de la courbe de croissance dans les mêmes conditions avec un substrat non étiqueté pourrait fournir des informations pour déterminer les points de collecte appropriés.
  6. Prélever les cellules bactériennes aux points temporels souhaités par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans un volume égal de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS. Fixer les cellules dans une solution de PFA pendant 10 min à température ambiante (RT) ou 2 h à 4 °C. Pour un stockage à long terme, laver les cellules deux fois avec du PBS, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de 50 % (v/v) de PBS et d’éthanol à 96 %, et les conserver à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.

2. Hybridation in situ en fluorescence (FISH) (Figure 2B)

  1. Hybridez des cellules E. coli avec la sonde oligonucléotidique Gam42a10 marquée avec un fluorophore cyanine5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) et des cellules B. thêta avec la sonde oligonucléotidique Bac30311 marquée avec un fluorophore cyanine3 (Cy3) (Bac303-Cy3), selon un protocole FISH standard.
    REMARQUE : Principes fondamentaux de l’ARNr-FISH pour l’identification : Les molécules d’ARNr sont des cibles idéales pour les FISH car elles sont distribuées de manière omniprésente et naturellement amplifiées dans les cellules microbiennes. L’ARNr contient également des régions à séquence conservée et variable, de sorte que la profondeur phylogénétique du groupe cible pourrait être déterminée par le degré de conservation de la sonde oligonucléotidique. En liant spécifiquement la sonde conçue à la séquence cible, le fluorophore marqué montre des signaux fluorescents pour des cellules individuelles.
  2. Se référer à la littérature précédemment publiée 12,13,14 pour le protocole détaillé pour l’hybridation in situ en fluorescence. Les étapes ci-dessous décrivent brièvement le protocole standard pour les cellules microbiennes.
    1. Déshydratation:
      1. Centrifuger les cellules fixes (100 μL) à 14 000 x g pendant 10 min pour les réduire en granulés, les remettre en suspension dans 100 μL d’éthanol à 96 % de qualité analytique et incuber pendant 1 min à RT.
      2. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules à 14 000 x g pendant 5 min, retirez l’éthanol et laissez sécher la pastille de cellule à l’air.
    2. Hybridation : Hybrider les cellules en solution (100 μL) pendant 3 h à 46 °C.
      REMARQUE : Le tampon d’hybridation se compose de 900 mM de NaCl, de 20 mM de Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane HCl, de 1 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique, de 0,01 % de dodécylsulfate de sodium, de 100 ng de l’oligonucléotide marqué par fluorescence respectif et de la concentration de formamide requise pour obtenir des conditions strictes.
    3. Centrifugeuse : Immédiatement après l’hybridation, transférez les échantillons dans une centrifugeuse avec un rotor préchauffé à 46 °C et une centrifugeuse à 14 000 x g pendant 15 min à la température maximale autorisée (généralement 40 °C).
    4. Laver et ranger :
      1. Laver les échantillons dans un tampon d’une rigueur appropriée pendant 15 min à 48 °C. Ensuite, centrifugez les cellules à 14 000 x g pendant 15 min à la température maximale autorisée dans une centrifugeuse avec un rotor préchauffé à 46 °C.
      2. Enfin, lavez les cellules avec 500 μL de PBS glacé, mettez-les en suspension dans 20 μL de 1x PBS et stockez-les à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
        REMARQUE : La liaison spécifique de la sonde est assurée par une rigueur d’hybridation correcte. Une strictivité élevée pourrait être obtenue en augmentant la température d’hybridation, en diminuant la concentration en sel ou en ajoutant du formamide dénaturant. Le formamide interfère avec les liaisons hydrogène qui stabilisent les duplex d’acide nucléique. Ici, la température et la concentration en sel ne sont pas modifiées lors de l’hybridation lors de l’ajustement de la concentration en formamide. La concentration optimale de formamide pour les sondes nouvellement conçues est déterminée expérimentalement à l’aide des courbes de dissociation du formamide10. La concentration de formamide requise pour les sondes publiées peut être trouvée dans la sondeBase 15 ou par une recherche documentaire. Alternativement, les concentrations estimées de formamide peuvent être obtenues à partir d’une analyse in silico à l’aide de mathFISH16. Dans l’étape de lavage, une température légèrement plus élevée conduit à une condition légèrement plus stricte, ce qui conduit à une spécificité de liaison plus élevée.

3. Préparation de l’échantillon (figure 2C)

  1. Nettoyage et revêtement des lames :
    1. Utilisez des lames CaF2 normalisées (10 mm de diamètre et 350 μm d’épaisseur pour la compatibilité avec le porte-échantillon de l’instrument). Plongez le CaF2 dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 min et rincez deux fois à l’eau DI.
    2. Transférez les lames nettoyées dans une solution de poly-L-lysine à 0,1 % et incubez pendant une nuit à 4 °C. Rincez une fois les lames à l’eau DI et séchez-les à l’air.
  2. Décongelez les échantillons cellulaires préparés à RT à l’abri de la lumière.
  3. Pour éviter la présence excessive de cristaux de sel de PBS pendant le séchage de l’échantillon, suivez les étapes 3.3.1 et 3.3.2.
    1. Lavez les cellules deux fois avec de l’eau déminéralisée (DI). Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
    2. Rajoutez le volume d’origine d’eau DI et tourbillonnez doucement. Répétez la centrifugation et ajoutez à nouveau le lavage à l’eau DI.
  4. (Facultatif) Pour les échantillons de mélange, transférez le même volume de chaque échantillon et mélangez dans un tube à centrifuger.
  5. Concentrer les échantillons de cellules bactériennes par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.
  6. Agiter doucement la solution restante pendant ~30 s et ajouter 1 à 2 μL de solution sur la lame de CaF2 préparée. Faites sécher l’échantillon à l’air libre pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : Un petit point rond doit apparaître sur la lame après le séchage à l’air. En raison de l’effet « anneau de café », les bords du point auraient une densité plus élevée de cellules bactériennes. Cette étape de centrifugation consiste à atteindre une densité appropriée pour une imagerie bactérienne unicellulaire efficace. La concentration idéale devrait conduire à une couche uniforme et dense de cellules bactériennes individuelles au microscope. S’il y a une pastille claire qui peut être vue à l’œil nu après la centrifugeuse, retirez le surnageant de sorte qu’après le vortex, la solution semble presque claire. Un test rapide pourrait être effectué sur l’échantillon de contrôle pour estimer le volume d’élimination du surnageant. Un ensemble de gouttelettes contenant différentes quantités de surnageant restant pourrait être déposé sur la lame de verre du microscope afin d’examiner le volume de dilution optimal sous le microscope à fond clair. S’il n’y a pas de pastille visible après la centrifugation, prélever la majeure partie du surnageant afin de concentrer les échantillons au maximum. L’astuce consiste à positionner le tube de centrifugation avec la charnière à l’extérieur dans un rotor à angle fixe de sorte que la pastille apparaisse du même côté de la charnière du tube. De plus, réduisez les tailles de pipettes (P1000, P200, P10) pour une précision accrue lors de l’élimination du surnageant afin de garder la pastille intacte.
  7. Montez la lame dans un porte-échantillon fourni et utilisez de petits points de ruban adhésif en polyester pour fixer la lame pendant la mesure.

4. Imagerie OPTIR-FISH

REMARQUE : L’imagerie de fluorescence et l’imagerie OPTIR seront effectuées sur le système OPTIR.

  1. Géométrie du système :
    1. Utilisez la contre-propagation de la pompe à infrarouge moyen et de la sonde visible, la détection arrière (epi) de la lumière visible avec ce protocole.
    2. Pour focaliser la lumière visible et collecter la lumière visible réfléchie et diffusée, utilisez un objectif aérien (50x 0,8NA). Pour focaliser la lumière infrarouge moyenne, utilisez un objectif Cassegrain (40x 0,78NA).
    3. Assurez-vous que le système est également équipé d’un module d’épifluorescence à champ large avec plusieurs jeux de filtres de fluorescence. Pour les fluorophores utilisés dans ce protocole, sélectionnez le jeu de filtres à protéines fluorescentes vertes (GFP) pour la détection Cy3 et le jeu de filtres Alexa Fluor 647 pour la détection Cy5.
  2. Préparez-vous aux mesures :
    1. Mettez le système sous tension et ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument. Après l’initialisation, basculez les curseurs Contre-prop et Fluorescence sur la position Activé.
    2. Fixez l’objectif à 50x, puis effectuez l’arrière-plan automatique pour acquérir le spectre de puissance IR. Utilisez le spectre de puissance pour normaliser les spectres d’échantillons acquis ou normaliser les images OPTIR à différents numéros d’onde. Cela exclura l’effet des différences de puissance laser dans l’infrarouge moyen sur l’analyse et la quantification des données.
      REMARQUE : L’acquisition de spectres de puissance IR pour la normalisation est impérative pour l’analyse quantitative en aval, car l’intensité mesurée est linéairement liée à la puissance IR. Après avoir effectué l’arrière-plan automatique, le logiciel normalisera automatiquement les spectres OPTIR et les images OPTIR aux spectres de puissance IR pour les utilisateurs. La purge du système avec du N2 peut minimiser l’influence de la vapeur d’eau et augmenter la reproductibilité entre les expériences.
  3. Pour charger l’échantillon, utilisez le bouton Décharger pour déplacer l’étage d’échantillon. Utilisez un objectif à faible grossissement tel que 10x pour localiser la zone de l’échantillon et naviguer vers la région qui a la densité d’échantillon optimale. Focalisez l’échantillon en ajustant la hauteur de l’objectif dans le logiciel de contrôle. Changez la sélection de l’objectif à 50x.
  4. Acquisition d’images
    REMARQUE : Les échantillons utilisés sont les suivants : i) E. coli (13C-glucose incubés) ; ii) E. coli (12C-glucose incubés) ; iii) B. thêta (12C-glucose incubés) ; iv) mélange d’E. coli (13C-glucose incubé) et de B. thêta (12C-glucose incubé).
    1. Images en fond clair (Figure 2D) : Faites la mise au point sur l’échantillon en regardant les images en fond clair.
    2. Images de fluorescence (Figure 2E) : modifiez le jeu de filtres en cliquant sur le bouton de nom du filtre (GFP pour Cy3 et Alexa Fluor 647 pour Cy5) pour détecter les fluorophores associés aux sondes FISH conçues et acquérir l’imagerie de fluorescence de manière séquentielle à l’aide du module de fluorescence du logiciel. Ajustez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition pour obtenir un contraste de signal adéquat avant de blanchir les fluorophores.
      REMARQUE : Étant donné que la sonde utilisée dans les mesures OPTIR peut photoblanchir les fluorophores, acquérez toujours des images de fluorescence avant les images OPTIR. Pour toute question concernant l’effet des marqueurs fluorescents sur la détection d’OPTIR, se référer à un travail précédemment publié qui a démontré que FISH avec fluorophore Cy5 n’affecte pas la quantification suivante basée sur les images OPTIR, car Cy5 est de petite taille et peu abondant par rapport à la protéine bactérienne cible9.
    3. Images OPTIR (Figure 2F) :
      1. Déterminez la position normale du pic et du pic décalé vers le rouge induit par les isotopes. Dans le cas de la synthèse des protéines à partir du 13C-glucose, le pic normal de l’amide I est détecté à environ 1656 cm-1, et le pic décalé vers le rouge est à environ 1612 cm-1 (Figure 3A).
        REMARQUE : La position normale du pic dépend du composant biochimique et/ou du produit métabolique d’intérêt. La position décalée du pic dépend également de l’isotope utilisé pour le marquage. Ces deux nombres d’onde pourraient également être déterminés expérimentalement en mesurant les spectres complets de cellules non marquées et marquées au maximum (voir étape 4.5)
      2. Réglez la longueur d’onde de la pompe IR à 1656 cm-1 à l’aide du logiciel. Modifiez la puissance de la sonde et le gain du détecteur en conséquence pour éviter la saturation du signal DC (8 V). Ajustez la hauteur inférieure de l’objectif Cassegrain pour maximiser le signal AC.
        REMARQUE : La puissance IR typique au niveau de l’échantillon est d’environ 5 mW et la puissance de la sonde au niveau de l’échantillon est d’environ 3 à 15 mW, selon l’échantillon. La puissance de l’IR et de la sonde peut être ajustée à l’aide du logiciel de contrôle pour optimiser le niveau de puissance afin d’assurer un contraste d’image élevé tout en évitant d’endommager les cellules.
      3. Réglez les images OPTIR pour qu’elles contiennent 200 x 200 pixels et réglez la vitesse de balayage sur 100 μm/s. Réglez la taille du pas dans les directions X et Y sur 150 nm afin que la taille de l’image soit d’environ 30 x 30 μm2.
      4. Acquérez l’image.
      5. Réglez la longueur d’onde de la pompe IR sur 1612 cm-1 et acquérez une image du même champ de vision à ce numéro d’onde.
      6. Pour chaque échantillon, imagez au moins trois champs de vision à des fins d’analyse statistique.
  5. (Facultatif) Mesure spectrale : Après l’acquisition de l’image, si une caractéristique spatiale d’intérêt est localisée, effectuez la mesure spectrale.
    1. Sélectionner les emplacements : choisissez un seul point ou spécifiez un tableau de points à analyser dans le module Spectral du logiciel.
    2. Définissez le paramètre de balayage spectral. Sélectionnez la plage de couverture du numéro d’onde, la vitesse de balayage et l’espacement des données en fonction des besoins.
      REMARQUE : si la vitesse de balayage et l’espacement des données de sortie sont différents de ceux utilisés dans l’étape d’acquisition de l’arrière-plan (étape 4.2), un nouvel arrière-plan basé sur les paramètres de balayage spectral actuels est nécessaire pour une normalisation correcte.
    3. Réglez le nombre de co-moyenne et lancez la mesure spectrale. L’augmentation de la co-moyenne augmente également le rapport signal/bruit des spectres, mais nécessite des temps d’acquisition plus longs.
      REMARQUE : Si une fluctuation significative est observée pendant le co-étalage, cela peut indiquer une instabilité de l’échantillon induite par l’échauffement laser. Ce problème peut souvent être résolu en réduisant la puissance IR et/ou la puissance visible de la sonde.

5. Traitement et analyse des données au niveau de la cellule unique

  1. Quantifier la synthèse métabolique à partir de substrats isotopiques (Figure 2G)
    REMARQUE : La quantification suivante de l’incorporation métabolique à partir de substrats isotopiques est basée sur des images OPTIR à deux numéros d’onde correspondant aux pics normaux et décalés des macromolécules cibles. Par rapport à une pile hyperspectrale complète, l’imagerie à deux numéros d’onde pourrait réduire considérablement le temps nécessaire pour chaque FOV et améliorer le débit tout en recapturant pleinement l’effet isotopique essentiel à la quantification du métabolisme.
    1. Soustraire l’image OPTIR du pic décalé de l’image OPTIR du pic normal pour générer une carte visuelle des activités de synthèse à partir des substrats isotopiques. À titre de démonstration (Figure 3C), pour E. coli cultivé avec du 13C-glucose, les pixels positifs dans l’image (1656 cm-1-1612 cm-1) indiquent une incorporation active du 13C dans les protéines, donc un niveau de synthèse protéique plus élevé.
      REMARQUE : La soustraction peut être effectuée à l’aide de la fonction ImageJ Image Calculator. Alternativement, la soustraction pourrait facilement être effectuée dans n’importe quel langage de programmation préféré pour le traitement par lots.
    2. Quantification de l’activité métabolique d’une cellule unique
      1. Obtenir les coefficients (représentés par h dans la figure 2G) à partir d’échantillons de référence non étiquetés et entièrement étiquetés. Comme le pic décalé vers le rouge induit par l’isotope chevaucherait partiellement le pic normal, les échantillons non marqués et marqués (nouvellement synthétisés à partir du substrat marqué isotopiquement) contribueront aux signaux OPTIR au niveau du pic normal et décalé. Quantifiez ces différentes contributions à l’aide de l’intensité normalisée du signal OPTIR au pic normal et décalé à partir d’échantillons de référence non étiquetés et entièrement étiquetés.
        REMARQUE : Pour les échantillons de référence, les échantillons de référence non étiquetés sont cultivés (ou incubés) sans aucun substrat marqué isotopiquement. Les échantillons de référence entièrement étiquetés sont généralement cultivés avec la plus forte concentration de substrat marqué isotopiquement avec le temps de culture le plus long.
      2. Pour l’analyse de cellules uniques, obtenez des masques de cellules uniques basés sur les images en fond clair.
        REMARQUE : Diverses techniques de traitement d’images pourraient être appliquées ici pour générer ce masque, y compris différentes méthodes de détection de particules comme l’analyse des gouttes et des méthodes de segmentation cellulaire comme le bassin versant.
      3. Mesurez l’intensité du signal OPTIR à partir de cellules individuelles. Appliquez le masque de cellule unique acquis aux deux images OPTIR (au pic normal et au pic décalé) et, pour chaque cellule unique, calculez la moyenne des valeurs de pixel dans la région du masque de cellule unique. La valeur moyenne des cellules individuelles sera utilisée pour la quantification.
      4. Pour chaque cellule, calculez la contribution relative des composants biologiques non étiquetés et marqués en fonction des coefficients de l’étape 5.1.2.1 et des signaux de l’étape 5.1.2.3.
        REMARQUE : Un rapport de remplacement isotopique est défini comme la contribution relative des composants biologiques marqués sur la somme des composants biologiques marqués et non marqués (Figure 2G). Ce rapport doit être compris entre 0 et 1. Le rapport de remplacement isotopique est linéairement proportionnel au rapport 13-C-glucoseà 12C-glucose (avec une quantité totale fixe de glucose)9. Une sensibilité de détection élevée de 5 % de 13C-glucose a été démontrée pour les cellules E. coli .
  2. Identifier les espèces bactériennes à partir d’images de fluorescence multicanaux (Figure 2H)
    1. Fusionnez les canaux de fluorescence multicolores pour créer un guidage visuel pour différentes espèces bactériennes à l’aide d’ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
    2. Pour l’analyse de cellules uniques, pour chaque canal de fluorescence, générez un ensemble de régions d’intérêt (ROI) pour des cellules individuelles.
      REMARQUE : Diverses techniques de traitement d’image peuvent être appliquées ici pour générer le masque, y compris différentes méthodes de seuillage automatique et méthodes de segmentation cellulaire.
  3. Corréler les identités FISH et les activités métaboliques d’OPTIR (Figure 2I)
    1. Reliez directement les identités bactériennes au niveau de la cellule unique à partir des images de fluorescence FISH aux activités métaboliques des images OPTIR en corrélant les positions des ROI.
    2. Effectuer des analyses statistiques pour comparer les activités métaboliques de différentes espèces.
      REMARQUE : Les masques sont générés séparément à partir des images de fluorescence et des images OPTIR, car les activités métaboliques pourraient être analysées pour toutes les cellules à partir des images OPTIR, tandis que les cellules inconnues n’apparaîtraient sur aucun des canaux de fluorescence. Cela garantit que toutes les cellules pourraient être incluses dans l’analyse métabolique. S’il y a un grand nombre de cellules non identifiées, il peut être nécessaire d’envisager différentes sondes FISH ciblant l’ARNr de différents taxons d’intérêt.

Résultats

Le flux de travail général pour l’analyse métabolique microbienne unicellulaire avec identification génétique par OPTIR-FISH est résumé dans Graphique 2. Les résultats représentatifs démontrant la capacité d’imagerie métabolique unicellulaire d’OPTIR sont présentés dans Graphique 3. Cet exemple a utilisé des cellules E. coli incubées avec 12C- ou 13C-glucose pendant 24 h. L’incorporation de 13Il a été démontré que C dans les protéines provoque un décalage vers le rouge significatif des amides protéiques I et II (Graphique 3A)17,18. Par conséquent, ces deux numéros d’onde clés représentant le 12protéine C (1656 cm-1amide normal, bande I) et 13protéine C (1612 cm-1, décalée dans la bande amide I) ont été sélectionnées, et des images OPTIR à ces deux numéros d’onde ont été acquises. Les images en fond clair correspondantes sont également montrées pour démontrer la morphologie des cellules (Graphique 3B,E). Les bactéries en forme de bâtonnet peuvent être clairement résolues au niveau de la cellule unique dans les images en fond clair et OPTIR, ce qui confirme la haute résolution spatiale de la technique OPTIR (Graphique 3B-G). Pour les cellules incubées avec 12C-glucose (Graphique 3B-D), une intensité plus élevée à 1656 cm-1 a été observée, tandis qu’une altitude supérieure de 1612 cm-1 a été observée pour les cellules incubées avec 13C-glucose (Graphique 3E-G). Ce décalage de pic indique l’incorporation d’isotopes de carbone plus lourds dans la masse protéique17. L’évaluation a été élargie pour évaluer la capacité d’OPTIR-FISH à discriminer les taxons bactériens et leurs activités métaboliques dans des échantillons multi-espèces. Nous avons mélangé artificiellement deux espèces bactériennes qui sont répandues dans le microbiome intestinal humain : E. coli et B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli cellules incubées avec 13Le C-glucose a été hybridé avec une sonde Gam42a-Cy5, ciblant l’ARNr 23S des gammaprotéobactéries10. B. theta cellules incubées avec 12Le C-glucose a été hybridé avec la sonde Bac303-Cy3, ciblant l’ARNr 16S de la plupart des espèces de Bacteroidaceae11. Il est très difficile de différencier les deux espèces sur la base des images en fond clair, car elles sont toutes deux en forme de bâtonnet (Graphique 4A). Ainsi, l’imagerie par fluorescence multicolore de sondes hybridées était essentielle pour attribuer une identité taxonomique à chaque cellule bactérienne analysée (Graphique 4B). En soustrayant les images OPTIR acquises à 1612 cm-1 de celui de 1656 cm-1, nous avons remarqué qu’un segment de cellules de cet échantillon bi-espèces présentait des valeurs de soustraction positives (Graphique 4C), indiquant l’incorporation de 13C. Sur la base des conditions de culture, nous avons attribué aux cellules avec une valeur de soustraction positive E. coli, et la valeur de soustraction négative à B. theta. L’attribution d’espèces bactériennes est confirmée par les résultats de l’imagerie de fluorescence : les cellules produisant des valeurs de soustraction positives produisent un contraste Cy5, qui est spécifique à E. coli, et les cellules produisant des valeurs de soustraction négatives produisent B. theta-contrastes Cy3 spécifiques. Ensuite, le rapport de remplacement isotopique a été calculé, dans ce cas, nouvellement synthétisé 13Protéine C de 13C-glucose (Graphique 4D). Comme prévu, une différence significative dans le rapport de remplacement isotopique entre les deux espèces bactériennes (test t par paire, p = 9,74 x 10-33) a été observée. Cet ensemble de données souligne la faisabilité de l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour étudier le métabolisme dans un environnement complexe où plusieurs espèces d’échantillons sont présentes.

Analyse microbienne ; hybridation par fluorescence, marquage isotopique, imagerie OPTIR, phénotype du génotype.
Figure 1 : Schéma de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces et l’analyse du métabolisme. Différents membres de la communauté microbienne ont pu être identifiés par liaison spécifique des sondes d’ARN ribosomique microbienne par hybridation in situ en fluorescence et détectés par imagerie en fluorescence des fluorophores attachés. L’activité métabolique a pu être analysée par culture avec des substrats isotopiques et détectée par imagerie OPTIR. L’imagerie OPTIR détecte le changement de diffusion induit par l’absorption IR, et OPTIR est intrinsèquement compatible avec les outils fluorescents largement utilisés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Schéma du processus de marquage isotopique : FISH microbien, analyse OPTIR, détermination de l’identité, ratios.
Figure 2 : Flux de travail général pour l’analyse unicellulaire de l’activité métabolique avec identification génétique par OPTIR-FISH. (A) Les cellules bactériennes ont été cultivées avec des substrats marqués isotopiquement. (B) Une hybridation in situ en fluorescence (FISH) a ensuite été réalisée. (C) Préparation de l’échantillon sur une lame transparente IR. (D) Les images en fond clair identifient les régions où la densité cellulaire est optimale. (E,H) L’imagerie par fluorescence multicolore de différents fluorophores FISH révèle l’identité génétique des cellules individuelles telle que spécifiée par les sondes FISH ou reste inconnue. (F,G) L’imagerie OPTIR multispectrale ultérieure au pic normal et décalé révèle l’incorporation isotopique dans la biomasse microbienne. En se référant aux spectres OPTIR pour les échantillons non marqués et entièrement marqués (coefficient h), la contribution relative des composants biologiques réguliers (cr) et isotopiques (ci) a pu être quantifiée. La synthèse des protéines à partir de substrats métabolisés marqués isotopiquement a été quantifiée à l’aide du « rapport de remplacement isotopique ». (I) Par OPTIR-FISH, une analyse à haut débit de l’activité métabolique d’espèces microbiennes dans une population complexe peut être obtenue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Spectroscopie d’E. coli à l’aide du glucose 12C/13C ; spectres OPTRIR ; images en fond clair et OPTIR.
Figure 3 : Spectres représentatifs d’OPTIR et résultats d’imagerie. (A) Spectres OPTIR pour des cellules d’E. coli cultivées avec 12C-glucose (cyan) et 13C-glucose (orange) couvrant les régions de l’amide I et de l’amide II. Un pic clair d’amide I décalé vers le rouge (1656 cm-1 à 1612 cm-1) est observé pour 13cellules cultivées de C-glucose. Images représentatives en fond clair et OPTIR des cellules d’E. coli dans la bande normale de l’amide I et de l’amide I décalé dans des conditions de culture de (B-D) 12C-glucose et (E-G) 13C-glucose. Barres d’échelle : 10 μm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bai et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Images de microscopie à fond clair et FISH avec soustraction OPTIR, tableau de quantification d’E. coli et de B. thêta.
Figure 4 : Images représentatives et résultats de quantification à partir de mélanges bactériens. Les cellules d’E. coli ont été incubées avec du 13C-glucose, puis hybridées avec la sonde oligonucléotidique Gam42a-Cy5. Les cellules de B. thêta ont été incubées avec 12C-glucose, suivies d’une hybridation avec la sonde oligonucléotidique Bac303-Cy3. (A) L’image en fond clair montre la morphologie du mélange de cellules. (B) L’image de fluorescence bicolore montre la distribution d’E. coli (rouge) et de B. thêta (vert). (C) Le résultat de la soustraction OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) montre le métabolisme protéique des cellules bactériennes. (D) Quantification du rapport de remplacement isotopique représentant la protéine C 13nouvellement synthétisée à partir du glucose 13C. (Test t par paires : p = 9,74 x 10-33). Barres d’échelle : 10 μm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bai et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole détaillé pour l’application de la plateforme OPTIR-FISH pour l’identification simultanée des espèces microbiennes et la quantification des activités métaboliques à la résolution de la cellule unique. Les étapes critiques comprennent la culture avec marquage d’isotopes stables pour l’étude d’activités métaboliques spécifiques et l’hybridation in situ en fluorescence pour identifier les espèces microbiennes cibles. L’imagerie par fluorescence multicanaux et l’imagerie OPTIR à des numéros d’onde sélectionnés ont pu être effectuées séquentiellement sur le même microscope. Nous avons montré comment analyser quantitativement ces images pour révéler les niveaux d’activité métabolique de différentes espèces au sein de la communauté complexe. Le protocole pourrait être particulièrement intéressant pour l’étude métabolique de diverses espèces au sein de la communauté complexe de leur environnement d’origine.

Nous avons utilisé les bactéries comme exemple ici, mais ce protocole peut être adapté à d’autres organismes, tels que les champignons et les cellules de mammifères. Un point clé est d’ajouter les sondes vibratoires du processus métabolique cible dans le milieu de culture libre de l’homologue normal. Par exemple, si vous étudiez le métabolisme des lipides à partir d’acides gras, les acides gras marqués à l’azido doivent être complétés dans leur milieu de culture standard composé de sérum bovin fœtal (FBS) délipidant, car les acides gras proviennent à l’origine de FBS. De plus, le temps d’incubation doit également correspondre au taux de croissance des différents champignons ou cellules de mammifères. Cela garantit la croissance normale des cellules tout en maximisant l’efficacité de marquage des sondes vibrationnelles dans les macromolécules cibles.

Le protocole décrit ici peut également être adapté pour étudier d’autres processus métaboliques au-delà de la synthèse des protéines à partir du glucose. Toutes les principales biomolécules, y compris les protéines, les lipides, les acides nucléiques et les glucides, ont pu être imagées par OPTIR19,20. De plus, il existe une vaste sélection de stratégies de marquage, y compris le marquage isotopique tel que 13C, 15N, 18O et 2H, et l’ajout d’étiquettes vibrationnelles telles que C≡C et C≡N aux petites molécules21. En raison de la petite taille des étiquettes et de la biocompatibilité élevée, il s’agit d’une méthode préférée pour l’étude du métabolisme par rapport aux analogues de fluorescence. Pour étudier d’autres processus métaboliques à l’aide de différentes sondes vibrationnelles, ce protocole peut être modifié, y compris les étapes de culture cellulaire et de marquage métabolique, ainsi que la sélection du nombre d’onde basée sur différentes sondes et produits métaboliques, que l’on peut trouver dans les référencescorrespondantes 21,22,23. Parmi les exemples, citons la cartographie des lipides nouvellement synthétisés à partir de l’acide azide-palmitique dans les systèmes de culture bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) d’origine humaine24, l’imagerie des protéines nouvellement synthétisées à partir de l’azidohomoalanine dans les cellules macrophages23, l’imagerie du métabolisme du glucose avec le deutérium-glucose dans les cellules PC325 et l’analyse de l’incorporation de deutérium dans l’eau lourde comme marqueur d’activité dans le microbiome intestinal humain26.

Une limitation potentielle du protocole est la limite de détection de 13°C dans les communautés complexes. Nous avons montré que pour la culture pure utilisée ici, la limite de détection est de 5 % de 13°C dans le carbonetotal 9. Nous démontrons également qu’en mélangeant des cellules E. coli entièrement marquées au carbone 13avec des échantillons de microbiome intestinal complexe humain non marqués, nous pouvons différencier en toute confiance E. coli sur la base des profils métaboliques malgré la variation spectrale potentielle associée à différentes compositions chimiques cellulaires provenant de diverses espèces de microbiome intestinal non marquées.. Cependant, les communautés microbiennes complexes, influencées par les physiologies uniques des espèces microbiennes présentes, peuvent présenter des taux d’assimilation incohérents du 13C. Dans de tels cas, il convient de tester davantage la capacité de différenciation métabolique de 13cellules marquées au carbone et de 12cellules marquées au carbone d’OPTIR-FISH dans le contexte d’une communauté complexe. Les performances de la plate-forme peuvent être encore améliorées. Par exemple, en combinant la configuration OPTIR à champ large, la vitesse d’imagerie peut être considérablement augmentée27. Des méthodes de débruitage avancées basées sur l’apprentissage automatique peuvent être intégrées à la plate-forme pour augmenter encore la vitesse d’imagerie28,29. Pour mieux visualiser la distribution détaillée des métabolites dans les cellules microbiennes, les technologies de super-résolution récemment développées peuvent être adoptées30,31.

Les étapes critiques de ce protocole comprennent l’optimisation de l’efficacité du marquage FISH pour les microbes cibles, ce qui pourrait être réalisé par une conception rationnelle de la sonde oligonucléotidique, l’optimisation de la concentration de formamide et un contrôle minutieux de l’environnement d’hybridation. La préparation d’échantillons à une densité de cellule unique appropriée pour l’analyse à haut débit est importante pour un débit élevé dans la pratique. Il est également essentiel d’optimiser le système pour obtenir un signal adéquat pour la quantification. Cela se fait automatiquement dans le logiciel de contrôle de l’instrument lors de l’étape d’arrière-plan automatique. En cas d’écart dans la préparation de l’échantillon, par exemple en utilisant un type de lame différent au lieu de la lame CaF2 standard, une optimisation manuelle peut être effectuée dans le logiciel. Au cours de l’étape d’optimisation manuelle, le chevauchement entre l’IR moyen et la lumière visible est optimisé en balayant un ensemble de positions IR moyennes. Les principaux défis comprennent le choix des substrats vibratoires les plus appropriés et des numéros d’onde OPTIR correspondants pour quantifier les activités métaboliques d’intérêt.

En conclusion, cette étude démontre comment l’activité métabolique et l’identification microbienne pourraient être réalisées simultanément au niveau de la cellule unique par la plateforme OPTIR-FISH. Nous pensons que ce protocole détaillé fournira des conseils utiles pour promouvoir l’adoption généralisée de cette nouvelle plate-forme d’imagerie vibratoire avec une compatibilité élevée avec les outils de fluorescence largement utilisés, permettant des applications dans divers domaines des sciences de la vie et de la médecine et ouvrant des opportunités pour de nouvelles découvertes.

Déclarations de divulgation

Y.B. est consultant à temps partiel pour Photothermal Spectroscopy Corp.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 à J.X.C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Éthanol à 96 %ThermoScientificT032021000
Fluorure de calciumCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99 %)Cambridge Isotopic LaboratoriesCLM-1396-1
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-AldrichE9884-100G
formamideThermoScientific17899
Bouillon Luria-Bertani  ;Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Sels minimaux 5xSIGMAM6030-1KG
Instrument OPTIRSpectroscopie Photothermique Corp.mIRage LS
Solution de paraforaldéhyde, 4 % dans une solution deThermoScientificJ19943-K2
à 0,1 % (p/v)  ;Sigma-AldrichP8920-500ML
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888-25G
Dodécylsulfatede sodium Sigma-AldrichL3771-25G
Chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 99+ %ThermoScientificA11379.18
Bouillon de soja trypicSigma-Aldrich22092-500G
poly-L-lysine PBS

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