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Microscopie intravitale à deux photons du poumon de souris transplanté

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DOI :

10.3791/66566

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19 avril 2024

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1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole d’imagerie intravitale du poumon gauche de souris transplantée à l’aide de la microscopie à deux photons. Il s’agit d’un outil précieux pour étudier la dynamique cellulaire et les interactions en temps réel après une transplantation pulmonaire murine.

Résumé

Les complications après une transplantation pulmonaire sont en grande partie liées à la réponse du système immunitaire de l’hôte à la greffe. Ces réponses immunitaires sont régulées par la diaphonie entre les cellules donneuses et receveuses. Une meilleure compréhension de ces processus repose sur l’utilisation de modèles animaux précliniques et est facilitée par une capacité à étudier le trafic de cellules immunitaires intra-greffe en temps réel. La microscopie intravitale à deux photons peut être utilisée pour imager des tissus et des organes à des profondeurs allant jusqu’à plusieurs centaines de microns avec un minimum de photodommages, ce qui offre un grand avantage par rapport à la microscopie confocale monophotonique. L’utilisation sélective de souris transgéniques avec une expression de protéine fluorescente spécifique du promoteur et/ou le transfert adoptif de cellules marquées à un colorant fluorescent pendant la microscopie intravitale à deux photons permet l’étude dynamique de cellules uniques dans leur environnement physiologique. Notre groupe a mis au point une technique pour stabiliser les poumons de souris, ce qui nous a permis d’imager la dynamique cellulaire dans des poumons naïfs et des greffons pulmonaires transplantés orthotopiquement. Cette technique permet d’évaluer en détail le comportement cellulaire dans le système vasculaire et dans l’interstitium, ainsi que d’examiner les interactions entre diverses populations cellulaires. Cette procédure peut être facilement apprise et adaptée pour étudier les mécanismes immunitaires qui régulent les réponses inflammatoires et tolérogènes après une transplantation pulmonaire. Il peut également être étendu à l’étude d’autres affections pulmonaires pathogènes.

Introduction

La transplantation pulmonaire est la dernière option pour de nombreux patients souffrant d’une maladie pulmonaire en phase terminale ; Cependant, la survie à long terme après une transplantation pulmonaire est faible par rapport à d’autres greffes d’organes solides. La survie à 5 ans n’est que de ~60 %-70 %1, contre 80 %-90 % dans le cœur2 et 85 %-90 % dans les reins3. De nombreuses complications après une transplantation pulmonaire, telles que le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet médié par les anticorps et le dysfonctionnement chronique de l’allogreffe pulmonaire, sont dues à la réponse immunitaire de l’hôte à l’allogreffe. Par exemple, notre groupe a montré que les neutrophiles sont rapidement recrutés dans l’allogreffe pulmonaire après une lésion d’ischémie-reperfusion induite par une greffe et forment des amas dynamiques autour des monocytes sanguins4. La diaphonie entre les cellules du donneur et du receveur est responsable des réponses allo-immunes délétères 5,6,7, et la capacité d’étudier ces interactions cellulaires dynamiques dans un modèle animal vivant est inestimable.

La microscopie à deux photons permet une imagerie intravitale haute résolution pour des profondeurs allant jusqu’à plusieurs centaines de microns avec un photoblanchiment minimal des tissus 8,9. Il est utilisé dans une variété de tissus et de sites anatomiques, y compris le néocortex10,11, la peau12,13 et le rein14,15. Plus récemment, il a été adapté à des organes non statiques tels que le poumon et le cœur 4,16,17. Dans ce protocole, nous décrivons une technique permettant d’imager des greffons pulmonaires stabilisés, ventilés et perfusés après une transplantation orthotopique murine du poumon gauche. L’un des principaux avantages du modèle de transplantation est la possibilité de manipuler génétiquement le donneur et le receveur séparément. Des populations cellulaires individuelles peuvent être visualisées avec des souches de souris transgéniques avec une expression de protéine fluorescente knock-in, un transfert adoptif de cellules marquées par fluorescence5 ou une injection intraveineuse d’anticorps marqués par fluorescence pour lier des marqueurs spécifiques aux cellules 4,16,17,18.

Afin de stabiliser le poumon pendant l’imagerie, ce protocole consiste à coller le poumon à un couvre-verre, tandis que d’autres groupes ont décrit la stabilisation de l’aspiration à l’aide d’un dispositif d’aspiration réversible sur mesure19. Notre protocole présente plusieurs avantages, notamment une plus grande zone d’imagerie et une relative facilité d’installation en utilisant des matériaux couramment disponibles dans un laboratoire de microscopie (y compris le verre de protection et la colle). Étant donné que cette technique de collage contraint le poumon au niveau de la surface supérieure, on s’attend à ce qu’elle diminue le mouvement ventilatoire et permette une imagerie plus profonde. Cette technique d’imagerie intravitale permet d’observer en temps réel le comportement et les interactions des cellules immunitaires, ce qui contribue à l’étude des mécanismes immunitaires qui régulent les réponses inflammatoires par rapport aux réponses tolérogènes après une transplantation pulmonaire.

Protocole

Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de Washington.

1. Anesthésie et intubation

REMARQUE : Une greffe orthotopique du poumon gauche de souris est effectuée, comme décrit précédemment20,21. Des poumons de souris C57BL/6 (B6) de 20 à 25 g sont transplantés chez des receveurs de B6 appariés selon le sexe et l’âge. N° B6. Les souris rapporteures LysM-GFP sont utilisées comme receveuses pour des expériences sélectionnées visant à visualiser l’infiltration de neutrophiles dans les greffes pulmonaires. Les souris receveuses peuvent être imagées immédiatement après une greffe de poumon.

  1. Réanesthésie les souris par administration intrapéritonéale de kétamine (80 à 100 mg / kg) et de xylazine (8 à 10 mg / kg). Administrer de la buprénorphine à libération prolongée (0,5-1,0 mg/kg) par voie sous-cutanée pour un meilleur contrôle de la douleur. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie avec un pincement de la patte.
    REMARQUE : Si le temps entre la transplantation pulmonaire et l’imagerie intravitale planifiée est inférieur à deux heures, on peut redoser l’anesthésique avec 50% de la dose initiale de kétamine.
  2. Retirez les poils de toute la poitrine gauche à l’aide d’une tondeuse électrique et essuyez la poitrine pour enlever l’excès de poils coupés.
  3. Appliquez une pommade ophtalmique non médicamenteuse sur les yeux de la souris pour prévenir le dessèchement de la cornée.
  4. Réintuber la souris par voie orotrachéale avec un angiocathéter de 20 G, comme décrit précédemment21.
  5. Aérer à l’air ambiant à un rythme de 120 respirations/min et un volume courant de 0,5 cc.
  6. Administrer 1 % d’isofluorane par voie endotrachéale pendant toute la procédure.
  7. Pour visualiser les vaisseaux sanguins pendant l’imagerie, injectez 20 μL de points quantiques non ciblés (q-dots) de 655 nm dans 50 μL de solution saline tamponnée au phosphate par voie intraveineuse au moins 5 minutes avant l’imagerie.

2. Préparation chirurgicale du poumon gauche pour l’imagerie

  1. Placez la souris en position de décubitus latéral droit (voir Figure 1A).
  2. Désinfectez la peau de la poitrine avec un mélange de 0,75% d’iode et de 70% d’éthanol, trois fois.
  3. Rouvrir la thoracotomie gauche (issue d’une greffe de poumon de souris) par le troisième espace intercostal (voir Figure 1A).
  4. Retirer une partie de la peau et des tissus mous sur le site de la thoracotomie gauche, mesurant 1,5 cm x 1,5 cm (voir la figure 1B).
  5. Avant la résection des côtes, clampez d’abord les côtes pendant ~10 secondes pour thrombose toute microvascularisation afin d’obtenir une hémostase (voir Figure 1C, D).
  6. Réséquez des parties de la 3à la 5e côte pour créer une fenêtre d’imagerie suffisamment grande pour extraire le poumon (~0,8 cm cranio-caudale et ~1,0 cm antéropostérieurement, Figure 1D, E).
  7. Arrêtez tout saignement supplémentaire des bords des côtes grâce à l’électrocautérisation.
    REMARQUE : Il est essentiel d’obtenir une hémostase dans le bord coupé des côtes pour éviter une perte de sang excessive pendant la période d’imagerie.
  8. Placez une petite bosse (gaze de 4 cm x 4 cm, pliée longitudinalement 3 fois) sous la poitrine droite (voir Figure 1E).
  9. À l’aide de cotons-tiges, soulevez le greffon pulmonaire hors de la poitrine et placez la partie inférieure du poumon sur une bande de gaze imbibée de sérum physiologique de 1 cm x 3 cm (voir figure 1F).
    REMARQUE : Cette bande de gaze imbibée de sérum physiologique empêche le glissement du poumon, maintient un environnement humide pour le poumon, protège le poumon des bords tranchants des côtes réséquées et sépare le poumon du mouvement cardiaque. Une fois que la chambre d’imagerie circonférentielle est appliquée sur le poumon (Figure 1G, H, décrite à la section 3), il devrait y avoir une perte minimale de chaleur et de liquide de la cavité thoracique ouverte pendant la période d’imagerie.

3. Préparation de la chambre d’imagerie

REMARQUE : Une chambre d’imagerie est fabriquée sur mesure (voir Figure 2A). Cette chambre d’imagerie se compose d’une plaque de base et d’une plaque supérieure entre lesquelles la souris est placée et fixée en place à l’aide de boulons à ressort de chaque côté (Figure 2B). La plaque supérieure contient une découpe circulaire mesurant ~2 cm de diamètre. Un joint torique noir de taille correspondante est placé dans cette ouverture sur la face avant de la plaque supérieure, ce qui protégera la lentille de l’objectif (Figure 2C). Une vitre de protection de 24 mm x 50 mm est collée à l’arrière de la plaque supérieure à l’aide de graisse sous vide poussé, ce qui créera un joint étanche. Ce couvre-objet servira de fenêtre d’imagerie en adhérant au poumon situé en dessous et en maintenant le support d’imagerie (c.-à-d. l’eau) au-dessus. Assurez-vous qu’aucune graisse sous vide ne pénètre dans la fenêtre d’imagerie circulaire. Le couvre-objet sera remplacé pour chaque nouvelle expérience d’imagerie. La plaque de base est chauffée à 35-37 °C à l’aide d’une sonde de température à thermocouple (Figure 2A).

  1. Placez la souris intubée sur la plaque de base de la chambre d’imagerie, la poitrine gauche ouverte vers le haut (voir Figure 1G, H). Fixez la souris avec du ruban adhésif en soie sur le visage, les pattes avant et la queue (voir Figure 1H et Figure 2A).
  2. Appliquez de la colle sur la face inférieure de la vitre de protection fixée à la plaque supérieure (cercle gris sur la figure 2C, en bas), en laissant un cercle sans colle de 0,8 à 1,0 cm au centre.
    REMARQUE : Il y a un compromis entre la taille du cercle sans colle et la quantité d’artefact de mouvement ; Ainsi, il est recommandé que le cercle ne dépasse pas 1,0 cm de diamètre.
  3. Abaissez la plaque supérieure jusqu’à ce que la vitre entre en contact avec le poumon, la colle touchant la surface du poumon (voir Figure 1G).
    REMARQUE : Le poumon gauche sera collé sur le couvre-objet avec un cercle propre et sans colle au milieu, qui est la zone qui sera imagée.
  4. Tenez le couvre-verre contre le poumon et gonflez le poumon pendant 1 à 2 s afin que la zone de colle adhère aux tissus environnants. Réaliser le gonflage pulmonaire en obstruant le tube d’écoulement du tube endotrachéal de la souris au ventilateur.
    REMARQUE : Ne gonflez pas le poumon pendant plus de 1 à 2 secondes, car cela pourrait provoquer un barotraumatisme excessif.
  5. Reculez légèrement la plaque supérieure pour réduire la pression sur le tissu pulmonaire. Assurez-vous que la zone du poumon à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie ne bouge pas avec la ventilation.
  6. Fixez les deux extrémités de la plaque supérieure en fixant l’écrou à oreilles sur chaque boulon (voir Figure 2B).

4. Imagerie à deux photons

REMARQUE : Un microscope vertical à platine fixe avec un objectif d’immersion dans l’eau à ouverture numérique (NA) 20x ou 25x >1,0 doit être utilisé pour la microscopie intravitale. Vous trouverez ci-dessous la configuration utilisée dans cette étude pour un B6 à B6. Transplantation de poumon gauche LysM-GFP avec marquage des vaisseaux sanguins à 655 nm q-dot. Lors de l’application de ce protocole, la configuration du microscope, des lasers et des filtres dichroïques peut être adaptée en fonction des besoins de l’expérience spécifique et des rapporteurs fluorescents utilisés.

  1. Placez toute la chambre d’imagerie avec la souris receveuse intubée (B6 poumon gauche transplanté dans B6. LysM-GFP avec points q-points de 655 nm) sur la platine du microscope (voir Figure 2A).
  2. Utilisez des filtres dichroïques de longueurs d’onde 480 nm, 560 nm et 635 nm, qui sépareront de manière appropriée les signaux du rapporteur GFP, des points q et du signal de génération de seconde harmonique (SHG) (445 nm) généré par le collagène. Ces filtres peuvent être adaptés en fonction de l’expérience spécifique.
    REMARQUE : Le signal SHG généré par le collagène délimite des structures sombres en forme de cratère, qui représentent des espaces aériens alvéolaires (voir les flèches blanches sur la figure 3).
  3. Réglez le laser pulsé femtoseconde titane-saphir à 890 nm (dans la gamme du proche infrarouge) pour l’excitation. Utilisez la puissance laser la plus faible possible pour obtenir un signal suffisant.
    REMARQUE : Les paramètres du laser doivent être ajustés pour l’expérience spécifique afin de maximiser la séparation des signaux.
  4. Appliquez ~1 mL d’eau pour couvrir complètement le verre de protection sur la plaque supérieure, qui sera maintenu en place par le joint torique et le joint de graisse sous vide du verre de couverture sur la plaque supérieure (voir Figure 1G et Figure 2C).
  5. Utilisez l’objectif d’immersion dans l’eau 20x >1.0 NA sur le microscope. Assurez-vous que l’objectif est adapté en fonction de l’expérience spécifique.
    REMARQUE : Une NA plus grande permet une plus grande collecte de lumière, un contraste plus élevé et des images plus détaillées. Les objectifs d’immersion dans l’eau sont préférés car l’eau ou le tampon est plus compatible avec les tissus biologiques.
  6. Abaissez l’objectif du microscope dans l’eau et concentrez-vous sur la surface du poumon.
  7. Activez le chauffage de la plaque de base et maintenez la température à 35-37 °C.
    REMARQUE : Si l’on craint que la température des tissus ne soit maintenue ou qu’une perfusion adéquate dans les poumons soit élevée, deux résistances supplémentaires peuvent être fixées pour réchauffer la plaque supérieure en plus de la plaque de base (voir la figure supplémentaire 1).
  8. Acquérez des piles d’images à l’aide du logiciel d’acquisition de votre choix.
    REMARQUE : Assurez-vous que la pièce est complètement sombre lors de l’acquisition, ce qui peut impliquer l’utilisation de rideaux/stores occultants et une couverture stratégique de toutes les sources lumineuses.

5. Acquisition vidéo

REMARQUE : Les paramètres suivants peuvent être adaptés en fonction de l’expérience spécifique. Les étapes 5.1 à 5.3 décrivent les paramètres spécifiques utilisés pour les B6 à B6. Lysm-GFP murin transplantation du poumon gauche, qui peut être utilisé comme guide de référence.

  1. À l’aide d’un scanner bidirectionnel à débit vidéo, définissez les dimensions de balayage x-y sur 512 x 512 pixels.
  2. À l’aide d’une unité pas à pas xyz, acquérez des enregistrements en accéléré d’une pile z de 21 étapes avec une moyenne de 10 images par étape. L’acquisition de chaque pile prend environ 20 s, ce qui comprend le temps nécessaire au calcul de la moyenne d’images, le moteur pas à pas pour se déplacer et vérifier sa position, et un délai de 100 ms.
    REMARQUE : Le scanner bidirectionnel du microscope utilisé dans cette étude fonctionne à une fréquence vidéo de 30 images/s. Cela peut différer en fonction de la configuration spécifique du microscope.
  3. Acquérez 80 piles z consécutives pour obtenir une imagerie en accéléré de la migration des leucocytes dans le parenchyme tissulaire. Cela prend environ ~27 min à 20 s/pile.
    REMARQUE : La taille de la pile, la moyenne d’images, la puissance laser et la durée totale de l’enregistrement en accéléré doivent être minimisées pour éviter une exposition excessive au laser sur les tissus. Si les rapporteurs fluorescents utilisés sont brillants (c’est-à-dire GFP) et que la puissance laser est faible, la souris tolère bien la répétition d’un empilement z en 21 étapes avec une moyenne de 10 images, un balayage de 512 x 512 pixels, à des intervalles de 20 s pendant ~27 min. Si des périodes d’imagerie plus longues sont souhaitées, le temps d’acquisition par pile doit être augmenté pour maintenir l’exposition laser totale la même (c’est-à-dire 1 min par pile sur ~1,5 h). Ces paramètres devront être optimisés en fonction des rapporteurs fluorescents utilisés.
  4. Euthanasier la souris à la fin de l’acquisition de l’image. Pour euthanasier, anesthésez la souris avec de la kétamine (80 à 100 mg / kg) et de la xylazine (8 à 10 mg / kg), suivie d’une luxation cervicale ultérieure. Les préparations d’imagerie typiques maintiendront facilement la viabilité de la souris jusqu’à 2 h.
    REMARQUE : Pour prolonger cette période, une supplémentation hydrique supplémentaire, une anesthésie à l’isoflurane et une attention à la régulation de la température peuvent être nécessaires.
  5. Rendu vidéo complet avec Imaris. D’autres logiciels d’imagerie (tels que ImageJ) peuvent également être utilisés.
    REMARQUE : Les images peuvent être traitées après l’acquisition à l’aide de l’amélioration du contraste, du lissage et de l’arithmétique des canaux pour supprimer la diaphonie des canaux.

Résultats

Après 1 h de stockage ischémique à froid à 4 °C, nous avons transplanté orthotopiquement le poumon gauche d’une souris B6 dans une souris B6. LysM-GFPsouris 4, puis une imagerie intravitale à deux photons a été réalisée, comme décrit ci-dessus. Nous avons effectué l’imagerie à deux moments après la greffe - 2 h (Figure 3A) et 24 h (Figure 3B). Les vaisseaux sanguins sont marqués en rouge par les points q injectés immédiatement avant l’imagerie. De plus, nous pouvons visualiser les monocytes qui ont pris des q-points à 24 h4. Des neutrophiles dérivés du receveur étiquetés en vert peuvent être vus en train de s’infiltrer dans le greffon pulmonaire dans la vidéo correspondante 24 h après la greffe (vidéo supplémentaire 1). Les alvéoles peuvent être visualisées comme des cratères sombres dus au SHG du collagène (flèches blanches sur la figure 3). On observe qu’à 24 h après la greffe, il y a plus de neutrophiles dans le poumon qu’à 2 h après la greffe (Figure 3).

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Figure 1 : Préparation de la souris pour l’imagerie à deux photons. (A) Réouverture de la peau sur la thoracotomie gauche. (B) Peau et tissus mous excisés sur le thorax gauche. (C, D) Nervures serrées pendant 10 s avant de se diviser. (E) Gauche 3rd-5 e côtes réséquées pour créer une fenêtre mesurant ~0,8 cm cranio-caudalement x 1,0 cm antéropostérieurement. (F) Poumon gauche élevé hors de la poitrine gauche et placé sur une bande de gaze. (G) Une chambre d’imagerie avec une fenêtre d’imagerie recouvre le poumon gauche. (H) La chambre d’imagerie placée sur la platine du microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Configuration de la chambre d’imagerie. (A) La chambre d’imagerie placée sur la platine du microscope. (B) Vue agrandie du mécanisme de boulon à ressort pour fixer la plaque supérieure sur le poumon gauche. (C) Avant et arrière de la plaque supérieure avec joint torique et verre de protection appliqués. Les lignes blanches représentent la zone où la graisse sous vide est appliquée pour faire adhérer le verre de protection à la plaque supérieure. Le cercle gris représente un anneau de colle à appliquer sur le verre de protection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Imagerie intravitale à deux photons d’une greffe de poumon gauche de souris de B6 à B6. Souris LysM-GFP avec 1 h de stockage ischémique à froid. L’imagerie est réalisée (A) 2 h et (B) 24 h après la transplantation. Le rouge représente les q-dots. Le vert représente les neutrophiles de B6. Bénéficiaire du LysM-GFP. Le bleu représente le SHG d’alvéoles riches en collagène. Les flèches blanches indiquent les espaces aériens alvéolaires. La barre d’échelle représente 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Plaque supérieure avec deux résistances fixées pour fournir un chauffage supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Imagerie à deux photons en accéléré du poumon gauche d’une souris transplantée de B6 à B6. Souris LysM-GFP avec 1 h de stockage ischémique à froid, réalisée à 24 h après la transplantation. Le rouge représente les q-dots. Le vert représente les neutrophiles du receveur de LysM-GFP. Le bleu représente la deuxième génération harmonique des alvéoles riches en collagène. La barre d’échelle représente 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’excitation à deux photons a été décrite pour la première fois dans sa thèse de doctorat par Maria Göppert-Mayer en 1931, qui a ensuite remporté le prix Nobel de physique pour avoir décrit la structure de la coquille nucléaire22,23. La microscopie à fluorescence traditionnelle repose sur l’excitation d’un seul photon, avec des longueurs d’onde d’excitation plus courtes et une énergie plus élevée que les longueurs d’onde d’émission. Contrairement à la microscopie monophotonique, la microscopie à deux photons implique une excitation simultanée par deux photons, chacun ayant des longueurs d’onde plus longues que celle du signal de fluorescence émis 24,25,26. Étant donné que deux photons individuels doivent co-localiser pour exciter un seul point focal dans le tissu, l’excitation à deux photons se fait spatialement à un petit volume d’échantillon, ce qui permet une section optique 24,25,26 et il y a moins de photoblanchiment au-dessus et en dessous du plan contenant le point focal 27. La probabilité d’excitation simultanée par deux photons est très faible, de sorte qu’un laser pulsé femtoseconde est nécessaire pour atteindre l’intensité d’excitation requise pour un signal d’émission de fluorescence 25,26,27. Le laser d’excitation se situe dans le proche infrarouge (700-1100 nm), ce qui présente l’avantage d’être moins diffusé, ce qui permet à la lumière de pénétrer plus profondément dans le tissu28. La profondeur de l’imagerie dépend de la vitesse d’oscillation et de la puissance du laser24. Dans le poumon, des profondeurs d’imagerie de ~500-600 μm peuvent être atteintes17. Ainsi, la combinaison de la profondeur d’imagerie et du faible photoblanchiment rend la microscopie à deux photons parfaitement adaptée à l’imagerie intravitale des organes.

La microscopie à deux photons a été utilisée dans plusieurs tissus et sites anatomiques différents, tels que la peau12,13, les ganglions lymphatiques29, l’endothélium veineux30, le cortex cérébral10,11, le rein14,15 et le foie31,32. Par exemple, dans le derme de souris, l’imagerie intravitale à deux photons a été utilisée pour décrire l’essaimage des neutrophiles à la suite d’une lésion physique stérile12. Dans un modèle de thrombose veineuse, des monocytes sanguins et des neutrophiles ont été visualisés rampant le long de l’endothélium de la veine cave inférieure30. Des microglies humaines ont été imagées avec succès in vivo après avoir été xénotransplantées dans un modèle d’organoïde du cerveau humain33. Grâce aux progrès continus de la microscopie à deux photons, l’imagerie intravitale est possible à de plus grandes profondeurs et même dans des organes non statiques. Par exemple, des profondeurs allant jusqu’à 1000 μm ont été imagées dans le néocortex chez la souris à l’aide d’un amplificateur régénératif Ti :Al2O3 34.

L’un des défis de l’imagerie intravitale dans les organes thoraciques est la stabilisation de l’image. En raison du mouvement des battements du cœur et des respirations pulmonaires, les artefacts de mouvement peuvent réduire considérablement la qualité de l’image. Plusieurs méthodes de stabilisation pour l’imagerie cardiaque et pulmonaire ont été développées, notamment le collage de l’organe 4,7, l’aspiration-stabilisation 19,35,36,37 et la correction de mouvement a posteriori38. Notre technique d’imagerie du poumon repose sur le collage de la surface pulmonaire sur un verre de protection stabilisé. Nous gardons le poumon perfusé, ventilé et normothermique, ce qui simule les conditions trouvées in vivo. Par rapport à la méthode d’aspiration-stabilisation décrite par Looney et al.19, ce protocole présente plusieurs avantages. Tout d’abord, nous n’exigeons pas la création d’un appareil d’aspiration spécialisé. Au lieu de cela, notre chambre d’imagerie et notre plaque supérieure peuvent être construites avec des matériaux facilement disponibles dans un laboratoire de microscopie. De plus, par rapport au dispositif d’aspiration (qui a un diamètre intérieur de 4 mm), la technique de collage utilisée dans cette étude permet d’obtenir une plus grande surface d’imagerie (jusqu’à 10 mm). Avec le collage circonférentiel, la zone du poumon à l’intérieur du cercle de colle est correctement contrainte et le mouvement ventilatoire est minimisé. Par rapport à la technique d’aspiration, l’approche du verre de couverture empêche la déformation convexe de la surface pulmonaire, ce qui pourrait affecter le flux sanguin capillaire sous-pleural. Les inconvénients de notre système incluent l’impossibilité de retirer la lamelle sans compromettre la jonction pleuropararymateuse. Ainsi, il n’est pas possible d’imager une seconde fois le poumon avec la technique de la colle utilisée ici, alors que la technique d’aspiration permet une imagerie en série. De plus, l’utilisation d’une thoracotomie nécessite la perte de la pression intrathoracique négative normale, qui, combinée à une ventilation à pression positive, n’est pas physiologique. D’autres limitations et limitations de l’imagerie à deux photons sont abordées ci-dessous.

Bien que la poitrine soit ouverte pendant l’imagerie intravitale, il est essentiel de rester aussi proche que possible d’un environnement physiologique. La plaque de base sur laquelle repose la souris est maintenue à une température de 35-37 °C. Avec seulement la plaque de base chauffée, nous avons constaté que la température centrale de la souris (mesurée par une sonde rectale) est bien régulée sur plusieurs heures. D’après notre expérience, la motilité et le comportement des cellules ne sont visiblement affectés que lorsque la température descend en dessous de 32 °C, ce qui est peu probable dans cette configuration. S’il y a une difficulté à maintenir la normothermie tissulaire ou la perfusion pulmonaire lors de la configuration initiale de cette chambre d’imagerie, deux résistances supplémentaires peuvent être fixées pour réchauffer la plaque supérieure en plus de la plaque de base (Figure supplémentaire 1). Une fois la chambre d’imagerie optimisée, il n’est pas nécessaire de surveiller régulièrement la température interne de la souris lors de chaque expérience d’imagerie. De plus, nous avons constaté que la combinaison de gaze imbibée de sérum physiologique placée sur la cavité thoracique ouverte et de l’anneau occlusif de colle autour de la zone du poumon à imager est efficace pour minimiser les pertes de liquide pendant l’imagerie.

Une considération technique importante est l’obtention d’une bonne hémostase lors de la résection des côtes lors de la création de la fenêtre d’imagerie thoracique. Des parties de la 3eà la 5ecôte gauche sont réséquées, et l’hémorragie en cours de ces côtes coupées compromettra la survie de la souris pendant l’imagerie. Pour lutter contre cela, nous recommandons d’abord de serrer les côtes en proximal à l’endroit où elles doivent être réséquées pendant 10 secondes pour thrombose la microvascularisation (voir Figure 1C,D). Ensuite, après la résection des côtes, les bords coupés des côtes doivent être généreusement coagulés par électrocautérisation. Enfin, il est essentiel de placer le poumon gauche sur la bande de gaze imbibée de sérum physiologique (voir Figure 1F) pendant l’imagerie pour éviter que les bords tranchants des côtes ne perforent le poumon. Grâce à cette combinaison de considérations techniques, nous pouvons capturer des vidéos claires du trafic de cellules immunitaires dans le parenchyme pulmonaire avec un artefact de mouvement minimal pendant plusieurs heures sans lésion pulmonaire ni perte des schémas de perfusion normaux.

La microscopie à deux photons a été utilisée dans les poumons pour étudier des modèles de maladies infectieuses et d’inflammation stérile. Un groupe a utilisé l’imagerie à deux photons pour étudier la motilité et la migration des lymphocytes B mémoires résidents à la suite de tests répétés de pneumologie de souris avec le virus de la grippe39. De plus, la microscopie à deux photons a été utilisée dans la transplantation de la peau, des reins et des îlots pancréatiques 40,41,42,43. Avec un modèle de greffe, le donneur et le receveur peuvent être modifiés génétiquement pour étudier leurs populations cellulaires respectives. À notre connaissance, notre groupe a été le premier à réaliser une imagerie intravitale à deux photons dans des greffes de poumons murins4. Nous avons observé un recrutement et un regroupement rapides des neutrophiles après une lésion d’ischémie-reperfusion médiée par la greffe, qui a été réduite avec la déplétion pharmacologique des monocytes sanguins4. Dans des travaux ultérieurs, nous avons montré que les monocytes dérivés de la rate du receveur facilitent l’extravasation des neutrophiles par la production d’IL-1B44. L’imagerie intravitale dans ces études nous a permis de découvrir les régulateurs en amont de l’extravasation des neutrophiles comme cibles thérapeutiques possibles pour réduire la réponse inflammatoire post-transplantation45. De plus, nous avons également effectué une imagerie intravitale dans des cœurs de souris battants après une transplantation hétérotopique16. Nous avons visualisé le recrutement des neutrophiles dans le myocarde et avons constaté que la mort cellulaire ferroptotique des cellules cardiaques greffées déclenche l’inflammation après une transplantation cardiaque46. Nous avons appliqué une technique de stabilisation similaire à des arcs aortiques transplantés pour visualiser le trafic monocytaire dans les plaques d’athérosclérose47. Ces études ont démontré la faisabilité et l’utilité de l’imagerie intravitale d’organes thoraciques transplantés non statiques.

Enfin, il convient de discuter des méthodes permettant de visualiser les différents types de cellules et le parenchyme pulmonaire. Deux méthodes principales sont utilisées pour marquer les cellules : 1) des souches de souris transgéniques présentant des mutations knock-in de protéines fluorescentes et 2) des anticorps marqués par fluorescence pour colorer les cellules. Les souches de souris transgéniques couramment utilisées pour identifier les cellules immunitaires par microscopie à deux photons comprennent LysM-GFP pour les neutrophiles48, CX3Cr1-GFP pour diverses populations de macrophages interstitiels49,50, CCR2-GFP pour les monocytes classiques51, CD19-tdTomato pour les lymphocytes B52 et Foxp3-GFP pour les lymphocytes T régulateurs5. Notamment, CX3Cr1 seul n’est pas suffisant pour identifier sans ambiguïté les cellules, mais cela peut être facilité par la morphologie et l’emplacement des cellules compatibles avec ceux des macrophages interstitiels. Les macrophages alvéolaires peuvent être imagés sans marquage en raison de leur autofluorescence 53,54, de leur morphologie distinctive et de leur comportement (c’est-à-dire l’absence de motilité à la résolution temporelle des enregistrements en accéléré). Par rapport aux éosinophiles, qui sont également autofluorescents, les macrophages alvéolaires sont plus grands et considérablement plus brillants avec une excitation de 890 nm54. Alternativement, les macrophages alvéolaires peuvent également être marqués en fonction de leur fonction phagocytaire par l’administration intrapulmonaire d’agrégats de colorants54.

La visualisation des cellules immunitaires chez les receveurs de greffe peut également être réalisée par transfert adoptif intravasculaire de cellules marquées par fluorescence ou par injection d’anticorps marqués par fluorescence contre des marqueurs de surface spécifiques aux cellules18,55. Un autre avantage inhérent à la microscopie à deux photons est le SHG par certaines structures biréfringentes dans les tissus, telles que le collagène56. Ce phénomène est particulièrement utile pour l’imagerie pulmonaire en raison de la teneur élevée en collagène dans les sacs alvéolaires, qui agit comme un indicateur intrinsèque de la structure alvéolaire sans colorants fluorescents supplémentaires. De plus, les alvéoles sont également circonscrites par des capillaires alvéolaires marqués par des points q de 655 nm. Enfin, les vaisseaux sanguins peuvent être marqués par injection intraveineuse de q-dots (comme décrit dans ce protocole) ou de rhodamine B dextran. Lors de la conception d’une expérience de microscopie intravitale à deux photons, nous recommandons de ne pas utiliser plus de quatre canaux d’émission différents afin de minimiser le risque de fuite et de mauvaise différenciation entre les canaux.

L’une des principales limites de notre technique de stabilisation de la colle décrite est l’incapacité de retirer le verre de protection du poumon sans dommages tissulaires potentiels et sans colle résiduelle à la surface du poumon. Ainsi, le poumon ne peut être imagé qu’une seule fois plutôt qu’à plusieurs moments sur une période de plusieurs jours. Pour remédier à cette limitation, un groupe a décrit une fenêtre d’imagerie thoracique semi-permanente, qui permet une imagerie en série du poumon57. Cependant, d’après notre expérience, cette approche ne permet pas une stabilisation pulmonaire adéquate pendant des périodes prolongées d’imagerie. Cette technique permet d’imager le poumon pendant plusieurs heures, ce qui fournit des informations clés sur les réponses immunitaires innées et adaptatives après la transplantation.

Parmi les autres limites de l’imagerie à deux photons, citons le coût initial élevé de l’installation et l’expertise requise pour entretenir le système. Les champs de balayage sont relativement petits par rapport à l’imagerie immunofluorescente. Les dommages thermiques et photoélectriques peuvent être importants sans une optimisation minutieuse des paramètres d’acquisition. La fonction d’étalement du point d’excitation à deux photons est large, ce qui limite quelque peu la résolution, en particulier dans la dimension z. De plus, l’imagerie à deux photons nécessite que les cellules d’intérêt soient marquées par fluorescence, et certaines cellules ne peuvent pas être marquées sans ambiguïté avec un seul marqueur cellulaire. Le nombre de signaux pouvant être imagés simultanément est souvent limité à quatre ou moins. Enfin, l’anesthésie, la chirurgie et l’imagerie peuvent induire une inflammation supplémentaire et des changements physiologiques en plus de la greffe de poumon, ce qui peut fausser les résultats et les interprétations expérimentales malgré tous les efforts déployés pour maintenir un environnement physiologique. Les orientations futures comprennent le développement de méthodes peu invasives d’imagerie intravitale (comme par une thoracotomie plus petite ou une approche bronchoscopique).

En conclusion, la microscopie intravitale à deux photons est un outil inestimable dans l’étude de plusieurs processus pathologiques. Ici, nous décrivons une technique fiable d’immobilisation pulmonaire et d’imagerie à deux photons, qui permet l’observation intravitale du trafic cellulaire et des interactions dynamiques entre différentes populations cellulaires après une transplantation pulmonaire murine. Cette technique a élargi notre compréhension du paysage immunitaire post-transplantation et continuera d’être un outil indispensable dans l’étude de la transplantation pulmonaire et d’autres processus de maladies pulmonaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucune divulgation pertinente.

Remerciements

Ce travail est soutenu par des subventions du NIH 1P01AI11650 et de la Fondation pour l’hôpital juif Barnes. Nous remercions le Centre d’imagerie in vivo de la Faculté de médecine de l’Université de Washington.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,75 % povidone iodeAplicareNDC 52380-0126-2Pour désinfectant
Cathéter IV 1 pouce 20GTerumoSROX2025CAPour tube endotrachéal (ETT)
Ruban de soie 1 pouceDurapore3M ID 7100057168Pour fixer la souris en position
Lentille longue objectif longue immersion dans l’eau 20xOlympusN20X-PFH
3M ColleVetbondMedi-Vet.com10872Pour coller le verre de protection sur le poumon
655 nm points quantiques non ciblésThermoFisherQ21021MPPour l’étiquetage des vaisseaux sanguins
70 % d’éthanolSigma AldrichEX0281Pour désinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black Oy-joint (2 cm)QuincaillerieN/APour l’imagerie sur mesure chambre
Boulon (2)QuincaillerieN/APour chambre d’imagerie sur mesure
Écrou à oreilles en laiton (2)QuincaillerieN/APour chambre d’imagerie sur mesure
Buprénorphine 1,3 mg/mLFidelis Santé animaleNDC 86084-100-30Pour le contrôle de la douleur
Caméléon titane-saphir Laser pulsé femtoseconde CohérentN/A
Verre de protection (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Pour chambre d’imagerie sur mesure
Pince anti-moustique incurvée (1)Fine Science Tools13009-12
Contrôleur de chauffage à deux canauxWarner InstrumentsTC-344B
Ciseaux fins (1)Fine Science Tools15040-11
Microscope vertical à platine fixeOlympusBX51WI
Gaze (coupée à 1 cm x 3 cm)McKesson476709À placer sous le poumon gauche
Graisse sous vide pousséDow CorningN/APour coller le verre de protection sur la plaque supérieure
Isoflurane 1 %Sigma Aldrich26675-46-7Pour l’anesthésie Chlorhydrate
kétamine 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Pour l’anesthésie
Tôle (3 cm x 7 cm)QuincaillerieN/APour une chambre d’imagerie sur mesure
Applicateurs pointus en cotonSolon56225Pour manipuler les poumons et pour la dissection contondante
Power Pro Ultraclipper Oster078400-020-001
Puralube Vet pommade pour les yeuxMedi-Vet.com11897Pour prévenir la dessiccation oculaire
Ventilateur pour petits animauxHarvard Appareil55-0000
Pince droite (1)Fine Science Tools91113-10
Pilote d’obturateur à trois canauxUniblitzVMM-D3Scanner résonnant
x.y.z Moteur pas à pas optiquePrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20Pour le contrôle de la douleur
de

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