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Évaluation des mesures de résultats de la connectivité des unités motrices du diaphragme du rat en tant que biomarqueurs quantitatifs de la dégénérescence et de la compensation des motoneurones phréniques

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DOI :

10.3791/66568

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19 avril 2024

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1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous présentons une méthode in vivo d’estimation du nombre et de la taille de l’unité motrice afin de quantifier la connectivité de l’unité motrice à diaphragme de rat. Une approche étape par étape de ces techniques est décrite.

Résumé

La perte de la fonction du muscle ventilatoire est une conséquence d’une lésion des motoneurones et de la neurodégénérescence (par exemple, une lésion de la moelle épinière cervicale et une sclérose latérale amyotrophique, respectivement). Les motoneurones phréniques sont le lien final entre le système nerveux central et le muscle, et leurs unités motrices respectives (groupes de fibres musculaires innervées par un seul motoneurone) représentent la plus petite unité fonctionnelle du système ventilatoire neuromusculaire. Le potentiel d’action musculaire composé (CMAP), le potentiel d’unité motrice unique (SMUP) et l’estimation du nombre d’unités motrices (MUNE) sont des approches électrophysiologiques établies qui permettent l’évaluation longitudinale de l’intégrité des unités motrices dans des modèles animaux au fil du temps, mais ont principalement été appliquées aux muscles des membres. Par conséquent, les objectifs de cette étude sont de décrire une approche dans les études précliniques sur les rongeurs qui peut être utilisée longitudinalement pour quantifier la MUNE phrénique, la taille de l’unité motrice (représentée par SMUP) et la CMAP, puis de démontrer l’utilité de ces approches dans un modèle de perte de motoneurones. Des biomarqueurs sensibles, objectifs et pertinents sur le plan translationnel pour les lésions neuronales, la dégénérescence et la régénération dans les lésions et les maladies des motoneurones peuvent considérablement aider et accélérer les découvertes de la recherche expérimentale jusqu’aux tests cliniques.

Introduction

Les motoneurones phréniques (MN), s’étendant des niveaux de myotome C3 à C6, forment le lien final entre le système nerveux central (SNC) et le muscle du diaphragme1. Les unités motrices phréniques (UM) sont composées d’une seule MN spinale et de ses fibres musculaires diaphragmales innervées, formant la plus petite unité fonctionnelle du système neuromusculaire respiratoire. La fonction ventilatoire nécessite une contraction adéquate du muscle du diaphragme obtenue par l’activation coordonnée de la piscine phrénique MU 2,3. De nombreuses maladies neurologiques, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA), entraînent une insuffisance ventilatoire sévère, contribuant finalement à la cause du décès4.

Plusieurs approches électrophysiologiques peuvent être utilisées pour évaluer et surveiller l’intégrité du pool d’unités motrices (UM) in vivo. Le potentiel d’action musculaire composé (CMAP) reflète la dépolarisation totale de toutes les fibres musculaires d’un muscle ou d’un groupe musculaire spécifique après une stimulation nerveuse périphérique et est sensible à une gamme d’affections neuromusculaires, y compris la SLA 5,6 et l’amyotrophie spinale (SMA)7,8,9. Une limite de l’évaluation CMAP est que la germination collatérale peut conduire au maintien de l’amplitude et de la surface du CMAP même en présence d’une perte MU10. Pour surmonter cette limitation, des modifications ont été apportées à la technique CMAP afin d’évaluer à la fois le nombre d’unités motrices et la taille11. De plus, une étude in vivo portant sur l’évaluation fonctionnelle du CMAP du diaphragme par un système électrophysiologique a suggéré qu’il pourrait également être possible d’utiliser la technique d’enregistrement du CMAP du diaphragme décrite pour l’estimation du nombre d’unités motrices12.

La technique d’estimation incrémentielle du nombre d’unités motrices (MUNE) a été initialement introduite au début des années 1970 par McComas et al. pour le muscle extenseur digitorum brevis chez l’homme13. L’approche MUNE incrémentielle était une modification de la technique d’enregistrement CMAP traditionnelle au cours de laquelle une stimulation progressivement croissante était délivrée pour enregistrer des incréments sous-maximaux quantiques, tout ou rien, comme indices des réponses d’une seule unité motrice. Les incréments additionnés et moyennés ont été utilisés pour calculer une estimation de la taille du potentiel d’une seule unité motrice (SMUP). Cette taille calculée a ensuite été divisée en amplitude CMAP pour estimer le nombre d’UM innervant le muscle examiné11. MUNE fait preuve d’une grande sensibilité dans la détection et la surveillance de la perte d’unité motrice, ce qui permet d’identifier le dysfonctionnement de l’unité motrice avant les changements observables dans des mesures telles que l’amplitude CMAP ou l’aire14,15. Chez les patients atteints de SLA, MUNE s’est avéré exceptionnellement sensible, servant de biomarqueur important pour l’apparition, la progression et le pronostic de la maladie16,17.

De nombreuses adaptations de MUNE ont été développées et largement utilisées pour évaluer la fonction de l’UM dans des conditions telles que la neurodégénérescence, les lésions neuronales et le processus de vieillissement naturel 18,19,20,21. Depuis la description initiale, diverses adaptations utilisant à la fois des réponses électrophysiologiques et des mesures de force incrémentielle (mécaniques) ont été employées dans des études humaines et des modèles animaux22. MUNE fournit une évaluation fonctionnelle non invasive de la connectivité des motoneurones avec le muscle. L’application longitudinale de MUNE permet de comprendre la progression de la maladie ou du phénotype induit et d’évaluer les effets protecteurs ou régénératifs des interventions thérapeutiques, tant dans des contextes cliniques que précliniques. Indépendamment de l’efficacité de la reproductibilité des mesures MUNE et de la pertinence clinique de la technique pour les flaques d’UM dans la majeure partie du corps humain, les efforts se sont largement concentrés sur les muscles des membres dans les muscles des rongeurs 10,23,24,25.

Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient de décrire une approche pour obtenir le potentiel d’action musculaire composé (CMAP), le SMUP et le nombre d’unités motrices phréniques (MUNE) en tant qu’évaluations in vivo qui peuvent être utilisées longitudinalement dans les études précliniques sur les rongeurs pour quantifier le MUNE, la taille de l’unité motrice (représentée par SMUP) et le CMAP. De plus, nous présentons des données représentatives qui mettent en évidence la perte du nombre de MU du diaphragme suite à l’administration intrapleurale d’un agent dégénératif phrénique MN, un fragment de toxine B du choléra conjugué à la saporine (CTB-SAP).

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées et menées conformément aux directives établies par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri. Les expériences ont été réalisées sur des rats Sprague-Dawley mâles adultes, âgés de 11 à 15 semaines. Ces rats ont été logés par paires et gardés sous un cycle lumière-obscurité de 12:12, avec un accès à de la nourriture commerciale standard en granulés et à de l’eau traitée au HCl disponible en tout temps.

1. Préparation de l’animal et administration de l’anesthésie

  1. Portez un équipement de protection individuelle approprié lorsque vous manipulez des rats.
  2. Administrer un anesthésique par inhalation avec 3 à 5 % d’isoflurane, en assurant une bonne induction. Une fois que le rat est correctement anesthésié, placez-le en position couchée et maintenez l’anesthésie avec 1 à 3% d’isoflurane inhalé. Vérifiez la suffisance de la profondeur de l’anesthésie en appliquant doucement une pression sur le coussinet du pied postérieur à l’aide d’une pince pour s’assurer qu’il n’y a pas de réponse de retrait.
    REMARQUE : En fonction de la taille et du poids du rat, surveillez la profondeur de l’anesthésie et ajustez la concentration d’isoflurane en conséquence.
  3. Maintenez la température de 37 °C à l’aide d’une plaque chauffante thermostatique pour éviter les variations de température qui peuvent affecter l’amplitude et la latence du CMAP.
  4. Appliquez une pommade vétérinaire à base de pétrole sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Surveillez la profondeur de l’anesthésie en observant la fréquence respiratoire et en vérifiant les réponses de retrait lors de l’application d’une pression sur le repose-pieds à l’aide d’une pince.
  5. Retirez les poils du tiers inférieur de la poitrine et du cou à étudier à l’aide d’une tondeuse. Surveillez la respiration du rat pendant toute la durée de l’expérience.
    REMARQUE : Après les enregistrements CMAP et MUNE et l’arrêt de l’anesthésie, ne laissez pas le rat sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment de conscience. Ne retournez pas l’animal dans la cage familiale avant d’être complètement rétabli.

2. Placement et configuration des électrodes

  1. Placez une paire d’électrodes-aiguilles monopolaires de 28 G pour enregistrer le CMAP, le SMUP et le MUNE comme illustré à la figure 1.
    1. Placez l’électrode de l’aiguille active (E1) par voie sous-cutanée sur la ligne claviculaire médiane inférieure au dernier bord de la côte, et l’électrode de l’aiguille de référence (E2) par voie sous-cutanée dans l’angle entre l’apophyse xyphoïde et le dernier cartilage sternocostal.
      REMARQUE : Les électrodes de l’aiguille ne doivent pas être insérées dans le muscle du diaphragme ; Au lieu de cela, ils doivent être positionnés dans la zone sous-cutanée.
  2. Pour la stimulation du nerf phrénique au niveau de la feuille carotidienne, utilisez une paire d’électrodes à aiguille monopolaires de 28 G comme cathode et anode pour la stimulation nerveuse et placées sous-cutanéement sur le cou latéral entre les muscles scalènes antérieur et moyen, séparés d’environ 1 cm. Assurez-vous que le placement des aiguilles de stimulation se fait au niveau inférieur à la quatrième vertèbre cervicale (C4).
    REMARQUE : Évitez d’insérer les électrodes de stimulation trop profondément pour éviter de blesser le nerf phrénique ou une autre structure. La figure 1 illustre le placement des électrodes.
  3. Pour l’électrode de terre, placez une électrode de surface jetable sur la queue.

3. Acquisition de données

  1. Phrénique CMAP
    1. Enregistrez les réponses CMAP phréniques en appliquant des impulsions cathodiques monophasiques à ondes carrées d’une durée de 0,1 ms et d’une intensité allant de 60 à 100 mA pour stimuler le nerf phrénique.
    2. Obtenir des réponses CMAP tout en augmentant progressivement l’intensité du stimulus jusqu’à ce que l’amplitude de la réponse cesse de montrer une augmentation supplémentaire. Pour assurer une stimulation supramaximale, augmentez l’intensité du stimulus à environ 120 % du niveau utilisé pour provoquer une réponse maximale et enregistrez une réponse supplémentaire. Si la taille du CMAP n’augmente plus, considérez cette réponse comme le CMAP maximal.
      REMARQUE : Il est préférable de fournir une stimulation pendant l’expiration pour minimiser le bruit de l’activité musculaire simultanée pendant l’enregistrement CMAP.
    3. Mesurez et documentez les amplitudes crête à crête du CMAP en millivolts (mV) (Figure 2).
      REMARQUE : L’amplitude CMAP peut être évaluée de base à crête et de crête à crête. Les systèmes d’électrodiagnostic clinique sont souvent conçus par défaut pour évaluer la base au pic, qui est calculée à partir de la ligne de base isoélectrique jusqu’au pic négatif initial.
  2. Taille moyenne du potentiel d’unité de moteur unique (SMUP) et calcul de MUNE
    1. Calculez la taille moyenne du SMUP à l’aide d’une technique de stimulation incrémentale.
      1. Pour susciter des réponses incrémentielles, administrez une stimulation sous-maximale d’une durée de 0,1 ms à une fréquence de 1 Hz, en augmentant progressivement l’intensité par incréments de 0,03 mA jusqu’à ce qu’une réponse minimale tout ou rien soit obtenue. Acquérez la réponse initiale avec une intensité de stimulus comprise entre 2 mA et 10 mA.
      2. Si la réponse initiale ne se produit pas avec une intensité de stimulus comprise entre 2 mA et 10 mA, modifiez la position de la cathode de stimulation, soit en la rapprochant, soit en l’éloignant du nerf phrénique dans le cou, pour diminuer ou augmenter l’intensité du stimulus nécessaire, respectivement.
      3. Si la première réponse incrémentielle est obtenue avec une intensité de stimulus allant de 2 mA à 10 mA, enregistrez la première réponse et acquérez des incréments supplémentaires avec des intensités de stimulus progressivement plus élevées, en ajustant par incréments de 0,03 mA, pour obtenir un total de 9 incréments supplémentaires qui satisfont aux critères suivants à l’étape 3.2.2.
        REMARQUE : Chaque SMUP est quantifié en soustrayant chaque incrément de l’incrément précédent.
    2. Lorsque vous mesurez les réponses incrémentielles, assurez-vous que chaque incrément répond aux critères suivants :
      1. Assurez-vous que le pic négatif initial des réponses incrémentielles s’aligne temporellement sur le pic négatif de la réponse CMAP maximale.
        REMARQUE : Les légers mouvements observés en raison du bruit de fond des cycles respiratoires sont inhérents à la nature de l’expérience. Cependant, la présence constante de SMUP pendant l’observation en direct confirme leur identité pour ce CMAP spécifique.
      2. Comme le diaphragme est un muscle dynamique impliqué dans la respiration, chaque cycle respiratoire peut induire un mouvement de base. Ainsi, vérifiez la stabilité et l’absence de fractionnement dans chaque réponse incrémentielle en confirmant la cohérence entre trois réponses dupliquées.
        REMARQUE : Pour distinguer les potentiels évoqués de faible amplitude, en particulier le premier SMUP, du bruit de fond dû à l’activité respiratoire, il est important de rester vigilant et d’observer pendant 3 à 4 cycles respiratoires. Assurez-vous également de l’alignement des pics avec ceux du CMAP pour plus de précision.
      3. Assurez-vous que chaque incrément est distinct et plus grand que le précédent. Par conséquent, distinguez visuellement les réponses incrémentielles en temps réel, en les observant lorsqu’elles se superposent aux incréments précédemment enregistrés.
        REMARQUE : Plusieurs répétitions du stimulus à chaque amplitude peuvent être effectuées pour assurer l’uniformité des incréments et la conformité aux critères prédéfinis.
      4. Après avoir vérifié visuellement chaque incrément à l’aide des critères susmentionnés, confirmez que l’amplitude d’incrément est d’au moins 25 μV. Si l’incrément est inférieur à 25 μV, écartez la mesure et réévaluez la réponse.
      5. Après l’enregistrement de 10 réponses incrémentielles, vérifiez que l’amplitude de chaque réponse d’incrément n’est pas supérieure au tiers de l’amplitude combinée des 10 incréments, représentant l’amplitude totale de la réponse finale. Si ce critère n’est pas satisfait, répétez la mesure des 10 réponses incrémentielles.
        REMARQUE : Le seuil d’un tiers est basé sur l’hypothèse que chaque réponse incrémentielle représente l’activation d’une seule unité motrice. Si l’amplitude d’une réponse incrémentielle dépasse un tiers de l’amplitude combinée des dix incréments, cela suggère que la réponse peut ne pas être uniquement attribuable à l’activation d’une seule unité motrice. Au lieu de cela, il pourrait être influencé par le recrutement d’unités motrices supplémentaires ou la présence d’activités non spécifiques, telles que le bruit électrique ou des artefacts22,26.
      6. Pour estimer l’amplitude moyenne des SMUP, faites la moyenne des valeurs des 10 incréments. Une autre méthode pour mesurer l’amplitude moyenne du SMUP consiste à diviser l’amplitude totale de la réponse incrémentielle finale par le nombre total d’incréments11.
    3. Déterminez MUNE en divisant l’amplitude maximale du CMAP (crête à crête) par l’amplitude moyenne du SMUP (crête à crête). Dans certains systèmes électrophysiologiques, les SMUP sont enregistrés en microvolts (μV), tandis que le CMAP est généralement exprimé en millivolts (mV). Si nécessaire, convertissez les mesures CMAP et SMUP dans les mêmes unités avant de calculer MUNE.
      REMARQUE : Les CMAP de crête à crête, les SMUP moyens et les MUNE sont généralement calculés automatiquement par les systèmes d’électromyographie des cliniques) :
      figure-protocol-1
      CMAP = Potentiel d’action musculaire composé
      SMUP = Potentiel d’unité de moteur unique
      MUNE = Estimation du nombre d’unités motrices

Résultats

Les techniques CMAP, SMUP et MUNE décrites dans ce rapport permettent d’enregistrer la fonction neuromusculaire dans le muscle du diaphragme en utilisant le placement d’électrodes peu invasif (Figure 1). Les paramètres d’amplitude et de surface peuvent être utilisés pour caractériser la taille supramaximale du CMAP, fournissant une mesure globale de la production du groupe musculaire (Figure 2). Cependant, dans nos méthodes actuelles, nous nous appuyons sur l’amplitude pour quantifier les tailles CMAP et SMUP. CMAP, SMUP et MUNE peuvent être utilisés pour mesurer la fonction neuromusculaire dans divers modèles de maladies neuromusculaires chez le rat. Pour mettre en évidence la perte d’UM dans le contexte de la dégénérescence des MN, les rats ont reçu une injection intrapleurale bilatérale de CTB-SAP (25 μg) pour cibler les MN phréniques et les CTB supplémentaires (25 μg), et les rats témoins ont reçu des CTB non conjugués (25 μg) et SAP (25 μg)1,27.

La figure 3 compare les résultats observés chez un rat témoin adulte et un rat adulte (12 semaines) sept jours après l’injection intrapleurale de CTB-SAP. Après l’injection intrapleurale de CTB-SAP, MUNE est réduit à 60 unités motrices fonctionnelles estimées par rapport aux résultats normaux de 74 unités motrices fonctionnelles chez le rat témoin. Cependant, l’amplitude CMAP chez le rat CTB-SAP (14,25 mV crête à crête) a montré des changements minimes par rapport au témoin (14,5 mV crête à crête), probablement en raison de la germination collatérale. Dans la figure 4, le CMAP, le SMUP et le MUNE du diaphragme ont été acquis bilatéralement et moyennés au départ/avant l’injection (n = 14), ainsi que 7 (n = 14), 14 (n = 14), 21 (n = 6) et 28 (n = 14) jours après l’injection. Dans la figure 4, aucune différence de base entre les groupes n’a été observée. MUNE a montré un changement significatif pour le temps (p < 0,05), CTB-SAP (p < 0,001) et le temps d’interaction x CTB-SAP (p < 0,01) avec une réduction de ~40% de MUNE chez les rats CTB-SAP. Le SMUP moyen des rats CTB-SAP a montré un changement significatif avec le temps (p < 0,05) et le CTB-SAP (p < 0,01), mais aucune interaction significative avec une augmentation de ~50-60% de l’amplitude du SMUP. Le CMAP n’a montré aucun changement significatif.

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Figure 1 : Placement de l’électrode. La cathode de stimulation (A) et l’anode (B) sont insérées par voie sous-cutanée dans le cou latéral entre les muscles scalènes antérieur et moyen à environ 1 cm l’un de l’autre. L’électrode « active » (C) (E1) et l’électrode d’enregistrement « de référence » (E2) sont positionnées sur la ligne médio-claviculaire inférieure au dernier bord de la côte, en suivant l’angle entre l’apophyse xiphoïde et le dernier cartilage costosternel. De plus, (E) une électrode de disque jetable est située sur la queue comme masse pour minimiser les artefacts. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Potentiel d’action musculaire composé. Une illustration d’une réponse CMAP représentative enregistrée à partir du muscle de l’hémidiaphragme gauche. L’amplitude crête à crête CMAP est déterminée à partir d’une tension de crête négative à une tension de crête positive. Abréviation : CMAP = Compound muscle action potential. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Deux enregistrements représentatifs de CMAP et MUNE d’un rat témoin et d’un rat adulte sept jours après l’injection intrapleurale de CTB-SAP. (A) Potentiel d’action musculaire composé phrénique gauche (CMAP) chez un rat adulte témoin (âgé de 12 semaines) avec une amplitude de crête à crête de 14,5 mV. Sensibilité de l’écran = 1 mV/division et durée de l’écran 1 ms/division. (B) Dix réponses incrémentielles ultérieures d’une amplitude totale de 1,940 mV sont divisées par 10 pour déterminer la taille moyenne du SMUP (0,194 mV). Sensibilité de l’écran = 0,2 mV/division et vitesse de balayage de 1 ms/division. MUNE calculée = 74 (MUNE = CMAP/SMUP moyen (14,5 mV/ 0,194 mV)) (C) CMAP phrénique sept jours après l’injection de CTB-SAP montrant presque aucun changement de l’amplitude crête à crête du CMAP 14,25 mV. Sensibilité de l’écran = 1 mV/division et vitesse de balayage de 1 ms/division. (D) Dix réponses incrémentielles ultérieures avec une amplitude totale crête à crête de 2,360 mV divisée par 10 pour obtenir une taille moyenne de SMUP de 0,236 mV. Sensibilité de l’écran = 0,2 mV/division et une vitesse de balayage de 1 ms/division. Ainsi, la MUNE calculée était de 60. Abréviations : CMAP = potentiel d’action musculaire composé ; MUNE = estimation du nombre d’unités motrices ; CTB-SAP = fragment de toxine B cholérique conjugué à la saporine ; SMUP = potentiel d’unité de moteur unique. *Illustre l’artefact causé par la stimulation électrique ; il est important de noter qu’en raison du contraste entre l’amplitude du stimulus électrique et le CMAP, ainsi que des réponses incrémentielles, nous n’avons représenté graphiquement qu’une partie du stimulus. Des couleurs vives de couleur aveugle ont été utilisées pour améliorer la visualisation des réponses incrémentielles afin d’améliorer l’accessibilité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Évaluation électrophysiologique de CMAP, SMUP et MUNE après CTB-SAP. Aucune différence de base entre les groupes n’a été observée (sept rats mâles de 11 semaines dans les groupes CTB-SAP et témoins). (A) Le CMAP n’a montré aucun changement significatif. (B) Le SMUP moyen des rats CTB-SAP a montré un changement significatif au fil du temps (p < 0,05) et avec le CTB-SAP (p < 0,01), sans interaction significative, indiquant une augmentation de 50 à 60 % de l’amplitude du SMUP. (C) Sept jours après l’injection de CTB-SAP, la MUNE moyenne a diminué de 27,07 %, passant de 102,58 ± 20,54 à 72,43 ± 15,59 unités motrices fonctionnelles estimées (moyenne ± écart-type). Cette réduction s’est poursuivie, avec une baisse supplémentaire de 11,75 % à 28 jours (MUNE : 60,64 ± 11,33, p < 0,01). Toutes les mesures au départ, 7, 14 et 28 jours après l’injection, ont été obtenues chez 14 rats, avec n = 7 rats injectés avec CTB-SAP conjugué et n = 7 rats recevant des CTB et des SAP non conjugués comme groupe témoin. Six rats ont été utilisés le 21e jour. Les données CMAP, SMUP et MUNE sont présentées sous forme de moyennes, et les comparaisons ont été effectuées à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs. Les astérisques indiquent des différences à différents moments : *p < 0,05 et **p < 0,01. Abréviations : CMAP = potentiel d’action musculaire composé ; MUNE = estimation du nombre d’unités motrices ; CTB-SAP = fragment de toxine B cholérique conjugué à la saporine ; SMUP = potentiel d’unité de moteur unique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans les maladies dégénératives MN, telles que la SLA, il est crucial d’évaluer les MU impliquées dans la ventilation28. Malgré l’apparition d’une dégénérescence respiratoire de la MN chez les patients atteints de SLA, l’apparition et la progression spécifiques de la mort par MN restent incomplètement comprises 29,30,31. Reconnaissant l’importance de cet aspect, divers modèles, à la fois génétiques (par exemple, SOD1 2,32) et non génétiques (par exemple, injection intrapleurale CTB-SAP 3,27,33), ont été utilisés pour imiter l’insuffisance respiratoire dans des modèles animaux de maladies neurodégénératives. Par conséquent, l’identification d’un biomarqueur pour le diagnostic, la surveillance et l’évaluation des effets potentiels du traitement est avantageuse pour ces modèles. De plus, les biomarqueurs peuvent faciliter l’application clinique des résultats de la recherche préclinique.

Pour quantifier le nombre de MN innervants dans les modèles dégénératifs de rongeurs, différentes techniques de marquage, y compris les traceurs rétrogrades et les adénovirus, ont été utilisées 25,34,35,36. Auparavant, l’immunohistochimie a été utilisée pour marquer les motoneurones phréniques dans la corne antérieure de la moelle épinière cervicale 2,3,33. Les techniques d’étiquetage, bien qu’utiles pour les évaluations des MN, ont des limites dans l’évaluation de la fonctionnalité des MU et ne conviennent pas aux évaluations longitudinales37. Des évaluations électrophysiologiques objectives sont cruciales pour une traduction réussie entre espèces, en particulier si l’on considère les différences structurelles prononcées dans les caractéristiques fonctionnelles et anatomiques des systèmes moteurs entre les humains et les rongeurs38,39. L’intégration des différences neurobiologiques présente un défi pour traduire les résultats des modèles de rongeurs aux patients. MUNE surmonte ces obstacles en servant de mesure électrophysiologique objective de la fonction MN, permettant l’évaluation de la connectivité fonctionnelle de MU en tant que biomarqueur dans les expériences de modèles dégénératifs de MN 3,40.

CMAP, SMUP et MUNE sont couramment utilisés dans les études de recherche et pour évaluer les patients atteints de troubles neuromusculaires 9,10,11. Ces biomarqueurs potentiels sont peu invasifs, ce qui permet une évaluation longitudinale de la fonction chez le même individu au fil du temps. Il est important de noter que, bien qu’ils n’évaluent pas directement l’activation ou le recrutement de l’UM par les MN corticaux, ils fournissent une estimation cliniquement pertinente de l’intégrité de la MN et de son homologue fonctionnel, l’UM. Les modèles de rongeurs de maladies dégénératives MN sont cruciaux pour comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux maladies humaines et pour l’avancement préclinique de traitements efficaces. Le développement de mesures de résultats et de biomarqueurs transposables à toutes les espèces peut rationaliser et accélérer la traduction des résultats précliniques prometteurs en essais cliniques11. Compte tenu de la relative complexité des mesures, nous avons adapté et affiné ces techniques des membres du rat au muscle du diaphragme. Cette traduction a été présentée dans un format visuel pour faciliter une utilisation et une mise en œuvre plus larges dans les études sur les rats.

D’après notre expérience, les systèmes d’électrodiagnostic clinique sont bien adaptés aux études décrites dans ce contexte. Cette aptitude découle d’une meilleure ergonomie de l’interface entre l’examinateur et le système d’électrodiagnostic, ce qui facilite le contrôle. Dans notre groupe de laboratoire, nous utilisons un système à deux canaux avec deux canaux d’amplification non commutés. Ces canaux sont équipés d’un convertisseur analogique-numérique 24 bits et fonctionnent à une fréquence d’échantillonnage de 48 kHz par canal. Le gain matériel est réglable dans une plage de 10nV à 100 mV par division. Nous avons utilisé un filtre basse fréquence avec une plage allant de 0,2 Hz à 5 kHz, et les paramètres du filtre haute fréquence couvraient une plage de 30 Hz à 10 kHz. De plus, nous avons utilisé un stimulateur à courant constant avec une intensité réglable allant de 0 à 100 mA et une durée de 0,02 à 1 ms. La majorité des systèmes cliniques offrent des fonctionnalités comparables qui conviennent à l’enregistrement des réponses CMAP, SMUP et MUNE. Ces systèmes peuvent être ajustés en conséquence pour assurer un enregistrement précis des données souhaitées. Par exemple, l’amplitude CMAP peut être évaluée de base à crête et de crête à crête. Les systèmes d’électrodiagnostic clinique sont souvent conçus par défaut pour évaluer la base au pic, qui est calculée à partir de la ligne de base isoélectrique jusqu’au pic négatif initial.

Le processus d’obtention des réponses CMAP, SMUP et MUNE du diaphragme implique plusieurs étapes cruciales. Un placement cohérent et précis des électrodes, ainsi qu’une profondeur d’électrode adéquate, sont essentiels pour mesurer de manière fiable les amplitudes et minimiser les bruits de fond pendant l’enregistrement. Un mauvais placement des électrodes de stimulation peut entraîner des conséquences inattendues. Placer des électrodes de stimulation trop en arrière peut entraîner des contractions musculaires exagérées des membres antérieurs à l’excitation du plexus brachial, tandis qu’un placement supérieur au niveau C4 peut rendre la stimulation du nerf phrénique plus difficile. Un placement plus profond comporte le risque de blesser l’artère carotide ou d’évoquer le nerf vague, ce qui peut causer des problèmes de conductivité cardiaque. En plaçant les électrodes d’enregistrement plus haut ou plus bas que la dernière côte, des mesures de stimulation intercostale ou de stimulation du droit de l’abdomen peuvent être effectuées, respectivement. Pour éviter d’enregistrer à partir d’autres muscles, notez que le pic négatif du diaphragme de la latence CMAP est généralement de 1,5 à 3,5 ms, et sa forme caractéristique est illustrée à la figure 2. Nos observations ont indiqué que les électrodes à aiguille produisent des enregistrements CMAP, SMUP et MUNE plus cohérents que les électrodes en forme de disque pour le muscle du diaphragme. Cette consistance accrue est attribuée à la forme en dôme du muscle du diaphragme et à la présence d’autres muscles à proximité, tels que les muscles intercostaux et droits de l’abdomen. De plus, le placement flexible des électrodes à aiguille est un autre facteur avantageux. En ce qui concerne l’intensité de la stimulation électrique, nous avons utilisé une plage de 60 à 100 mA pour stimuler le nerf phrénique, ce qui dépasse les plages rapportées pour les autres systèmes moteurs. Cette différence provient de l’emplacement plus profond du nerf phrénique dans le cou par rapport aux emplacements plus superficiels du nerf sciatique et du plexus brachial dans les membres postérieurs et antérieurs, respectivement.

L’obtention du SMUP moyen pose des défis techniques plus importants par rapport au CMAP. La taille plus petite de la réponse, de l’ordre du microvolt plutôt que du millivolt, rend l’impact du bruit de fond plus prononcé. Pour atténuer le bruit de fond, envisagez d’optimiser le placement des électrodes en ajustant l’électrode de terre, la cathode et l’anode. De plus, assurez-vous qu’il y a un minimum d’interférences provenant d’appareils électriques à proximité dans la configuration expérimentale. Une cage de Faraday, couramment utilisée dans les applications d’électrophysiologie intracellulaire, n’est pas nécessaire pour cette configuration. L’identification visuelle des réponses individuelles SMUP est une compétence difficile qui nécessite de la pratique pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Comme le diaphragme est un muscle dynamique, la ligne de base peut se déplacer à chaque cycle de ventilation. Être attentif aux augmentations du SMUP pour assurer l’alignement avec le SMUP précédent est un facteur essentiel pour surmonter ce défi. De plus, il est important de s’assurer que les SMUP se lancent dans le délai de latence du CMAP maximal pour des enregistrements précis.

Un autre défi de l’enregistrement du diaphragme est la nature asymétrique de ce muscle, caractérisé par des épaisseurs variables de gauche à droite et influencé par la pression exercée par le foie du côté droit41. Pour résoudre ce problème, nous avons effectué des mesures électrophysiologiques séparément sur les hémidiaphragmes gauche et droit. Ensuite, nous avons calculé séparément les moyennes des réponses CMAP, SMUP et MUNE.

Étant donné que la réponse CMAP reflète la dépolarisation collective des fibres musculaires dans un muscle spécifique, toute pathologie affectant le MN phrénique à la fibre musculaire du diaphragme peut entraîner une réduction de la taille du CMAP. Par conséquent, le calcul du CMAP moyen à partir d’hémidiaphragmes bilatéraux offre une excellente évaluation de l’état fonctionnel global du système neuromusculaire respiratoire. Des modifications compensatoires, telles que la germination collatérale, peuvent conduire à la préservation de la taille du CMAP même en présence de MN ou de perte axonale motrice11. L’enregistrement des incréments individuels permet d’estimer la production moyenne d’UM uniques (taille SMUP), ce qui donne un aperçu plus détaillé de l’état fonctionnel des UM du système respiratoire. Par conséquent, la technique MUNE devient essentielle pour évaluer l’entrée des MN phréniques ou axones dans le diaphragme. L’application de ces biomarqueurs dans des expériences précliniques de thérapies pour l’étude des maladies MN a le potentiel d’améliorer l’application aux essais cliniques.

Déclarations de divulgation

WDA a reçu des fonds de recherche de NMD Pharma, Avidity Biosciences et des honoraires de consultation de NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals et Novartis.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention du programme de recherche sur les lésions et les maladies de la moelle épinière du programme de recherche sur les lésions et les maladies de la moelle épinière du Missouri (NLN et WDA).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue en verre de 2 mLKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, modèle 705 RN SeringueHamilton Company7637-01Utilisée pour effectuer une injection intrapleurale
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Aiguilles autoclavables de 26 g (26S RN 9,52 mm 40 °Hamilton Company7804-04Utilisé pour effectuer une injection intrapleurale
Sous-unité B de la toxine cholérique (CTB)MilliporeSigmaC9903Utilisé pour l’injection intrapleurale pour marquer les motoneurones survivants Toxine
cholérique B sous-unité conjuguée à la saporine (CTB-SAP)Advanced Targeting SystemsIT-14Utilisé pour l’injection intrapleurale pour provoquer la mort des motoneurones
Câble détachableTechnomed202845-0000pour connecter l’électrode de l’enregistreur à l’appareil d’électrodiagnostic
Électrode à disque jetable 2 » x 2 » avec filsCadwell302290-000électrode de masse
aiguilles monopolaires jetables 28 GTechnomed202270-000électrodes de stimulation de cathode et d’anode - électrodes d’enregistrement
Câble d’aiguille EMG (boîtier de commutation Amp/stim)Cadwell190266-200pour connecter des électrodes monopolaires à un stimulateur d’électrodiagnostic
Pince crocodile Helping Hands avec base en ferRadio Shack64-079Maintien du placement des électrodes d’enregistrement  ;
Isoflurane (flacon de 250 ml)Piramal Healthcare
seringue d’irrigation à embout incurvé monojectCovidien81412012utilisé pour l’application de gel d’électrodes
Système de surveillance physiologique PhysioSuite avec réchauffement homéothermique RightTempKent Scientific CorporationPS-RTComprend un coussin chauffant infrarouge, une sonde rectale et une sonde de température
pour tampon Pro trimmer Pet Kit de toilettageOster078577-010-003tondeuse pour l’épilation
Saporin (SAP)Advanced Targeting SystemsPR-01Utilisé pour l’injection intrapleurale (agent de contrôle lorsqu’il est injecté seul)
Système EMG Sierra SummitCadwell Industries, Inc., Kennewick, WASystème d’électrodiagnostic
portable SomnoSuite Système d’anesthésie numérique à faible débitKent Scientific CorporationSOMNOComprend un adaptateur anti-déversement et anti-vapeur pour bouteille ; Tube adaptateur en Y ; filtre de récupération au charbon de bois
Rat Sprague-DawleyColonie Envigo 208a, Indianapolis, IN
Pommade ophtalmique vétérinaire à base de pétrole  ;Puralube26870appliqué pendant l’anesthésie pour éviter les lésions cornéennes
)

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Motoneurones phr niquesunit s motrices du diaphragmeestimation du nombre d unit s motricespotentiel d action musculaire compospotentiel d unit motrice uniquevaluation lectrophysiologiquefonction neuromusculairebourgeonnement collat ralmod le de neurod g n rescence chez le ratbiomarqueurs longitudinaux
Évaluation des mesures de résultats de la connectivité des unités motrices du diaphragme du rat en tant que biomarqueurs quantitatifs de la dégénérescence et de la compensation des motoneurones phréniques
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