Quantification non destructive basée sur SPE-UPLC des aflatoxines et des phytoalexines stilbénoïdes dans l’arachide simple (Arachis spp.) Graines

Résumé

Nous faisons la démonstration d’une méthode à débit moyen pour la quantification des aflatoxines et des phytoalexines stilbénoïdes dans des graines d’arachide simples à l’aide de la chromatographie liquide ultra performante. Cette méthode a été spécifiquement développée pour les analyses d’espèces sauvages d’Arachis défiées par les espèces aflatoxigènes d’Aspergillus .

Résumé

Les aflatoxines sont des métabolites secondaires hautement cancérigènes de certaines espèces fongiques, en particulier Aspergillus flavus. Les aflatoxines contaminent souvent des produits agricoles d’importance économique, notamment les arachides, ce qui pose un risque élevé pour la santé humaine et animale. En raison de leur base génétique étroite, les cultivars d’arachide présentent une résistance limitée aux agents pathogènes fongiques. Par conséquent, de nombreuses espèces d’arachides sauvages tolérantes à Aspergillus ont été largement considérées par les scientifiques comme sources de résistance aux maladies.

Il est difficile d’explorer le matériel génétique des plantes pour détecter la résistance aux aflatoxines, car l’accumulation d’aflatoxines ne suit pas une distribution normale, ce qui dicte la nécessité d’analyser des milliers de graines d’arachide uniques. Les graines d’arachide (Arachis spp.) suffisamment hydratées, lorsqu’elles sont infectées par des espèces d’Aspergillus , sont capables de produire des stilbènes biologiquement actifs (stilbénoïdes) qui sont considérés comme des phytoalexines défensives. Les stilbènes d’arachide inhibent le développement fongique et la production d’aflatoxines. Par conséquent, il est crucial d’analyser les mêmes graines pour les stilbénoïdes d’arachide afin d’expliquer la nature de la résistance et de la sensibilité des graines à l’invasion d’Aspergillus . Aucune des méthodes publiées n’offre d’analyses à graine unique pour les aflatoxines et/ou les phytoalexines de stilbène.

Nous avons tenté de répondre à la demande d’une méthode respectueuse de l’environnement, utilisant des consommables peu coûteux et sensible et sélective. De plus, la méthode est non destructive puisqu’elle n’utilise que la moitié de la graine et laisse intacte l’autre moitié contenant l’axe embryonnaire. Une telle technique permet la germination et la croissance de la plante d’arachide jusqu’à sa pleine maturité à partir de la même graine utilisée pour l’analyse de l’aflatoxine et des stilbénoïdes. La partie intégrée de cette méthode, le défi manuel des graines avec Aspergillus, est une étape limitante qui nécessite plus de temps et de travail par rapport aux autres étapes de la méthode. La méthode a été utilisée pour l’exploration du matériel génétique d’Arachis sauvage afin d’identifier les espèces résistantes à Aspergillus et de déterminer et de caractériser de nouvelles sources de résistance génétique à ce champignon pathogène.

Introduction

L’arachide (Arachis hypogaea L.) est l’une des principales cultures vivrières dans le monde. Il est cultivé dans plus de 100 pays avec une production totale dépassant 45 millions de tonnes¹. Les produits agricoles, tels que l’arachide, le maïs et les graines de coton, sont souvent envahis par des espèces d’Aspergillus, des champignons du sol qui produisent des aflatoxines². Ces produits sont particulièrement vulnérables à la contamination par l’aflatoxine avant la récolte lorsque les conditions environnementales sont caractérisées par des températures élevées et la sécheresse. Les aflatoxines sont parmi les cancérogènes les plus puissants connus³. Ils contaminent un quart des produits agricoles dans le monde⁴ , ce qui fait qu’environ la moitié de la population mondiale est exposée de manière chronique aux aflatoxines⁵. En raison de leur cancérogénicité et de leur toxicité élevées, la présence d’aflatoxines dans les aliments est réglementée aux limites les plus basses et pratiquement acceptables dans la plupart des pays du monde⁶.

L’Union européenne (UE) a légiféré pour fixer une teneur maximale de 2 ng/g pour l’aflatoxine B₁ et de 4 ng/g pour les aflatoxines totales (B₁, B₂, G₁ et G₂) dans les produits destinés à la consommation humaine⁷. Des limites aussi basses exercent une pression considérable sur l’agriculture et l’industrie alimentaire qui transforme des produits contaminés par des aflatoxines. La surveillance de l’aflatoxine et le retraitement des arachides contaminées peuvent être considérés comme une stratégie passive et coûteuse pour empêcher les aflatoxines d’entrer dans la chaîne alimentaire. C’est pourquoi tous les principaux segments de l’industrie de l’arachide subissent d’énormes pertes de profits en raison de la contamination par l’aflatoxine des cultivars d’arachide actuels qui démontrent souvent une résistance limitée aux maladies fongiques. Une approche prospective pour résoudre le problème de l’aflatoxine consiste à obtenir des cultivars d’arachide résistants aux champignons par introgression génétique, c’est-à-dire le transfert de l’information génétique d’espèces d’arachides sauvages résistantes à des cultivars élites. Au cours des dernières années ^8,9, les espèces d’arachides sauvages ont fait l’objet d’une considération importante en tant que sources de résistance aux maladies génétiques, car la base génétique étroite des arachides cultivées ne peut plus fournir le niveau nécessaire de caractères de résistance à la plante d’arachide^10,11. Pour réussir l’introgression à partir d’espèces d’arachides sauvages, il faut analyser des milliers de graines uniques, petites et rares (Figure 1A) ¹².

Figure 1 : Organigramme d’analyse d’une seule graine. (A) Taille comparative de différents cultivars d’arachide de type commercial par rapport à Arachis spp. sauvages (1) Virginie ; (2) coureur ; 3) espagnol ; (4) Arachis spp. sauvages (B) Arachis spp. sauvages (planche A, graine 4) coupés en trois sections, (5) demi-graine à axe embryonnaire ; cette partie de la graine est utilisée pour faire pousser une plante (E). (C) Les pièces (6) et (7) sont percées à l’aide d’un trépan et (D) inoculées avec des spores fongiques. Après une incubation de 72 h à 30 °C, l’une des parties de la graine, (6) ou (7) est utilisée pour les analyses d’aflatoxine et de phytoalexine, et une autre est utilisée pour le séquençage de l’ARN/transcriptome. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La résistance de l’arachide aux agents pathogènes fongiques est fortement associée aux phytoalexines 13,14,15,16,17. Les phytoalexines d’arachide sont représentées par des stilbénoïdes antimicrobiens qui sont biosynthétisés et accumulés dans les tissus végétaux après exposition à des stimuli exogènes, en particulier à l’invasion fongique 16,17,18. L’accumulation rapide de concentrations suffisantes de phytoalexines sur le site de l’invasion fongique est inhibitrice de la croissance fongique et est essentielle à la défense des plantes 19,20,21. L’agent pathogène cesse de se développer lorsque les phytoalexines s’accumulent à des concentrations inhibitrices^16,22. Le rôle des stilbénoïdes en tant que composés défensifs contre les champignons aflatoxigènes dans l’arachide a été évalué il y a plus de 30 ans dans des expériences sur le terrain¹³. Ces expériences ont clairement soutenu l’hypothèse selon laquelle les stilbénoïdes d’arachide sont un facteur de résistance crucial dans la contamination par l’aflatoxine avant la récolte. Ces preuves sont fondées sur le fait que les stilbènes sont naturellement produits dans les arachides endommagées sur le terrain ; les stilbènes présentent une activité biologique appréciable contre les champignons aflatoxigènes ; et la contamination des graines par l’aflatoxine n’a été détectée que lorsque les arachides ont perdu la capacité de synthèse de la phytoalexine en raison de la déshydratation des graines induite par la sécheresse. Une autre série d’expériences sur le terrain a confirmé l’association entre la production de phytoalexine et la résistance du génotype de l’arachide aux maladies de l’arachide importantes pour l’agriculture¹⁷.

Une meilleure compréhension du mécanisme naturel de résistance des arachides à l’invasion fongique à base de phytoalexines est une stratégie prometteuse pour le contrôle de la contamination par l’aflatoxine^15,17.Par conséquent, en plus des analyses d’aflatoxines, il est important d’analyser quantitativement les mêmes graines pour les phytoalexines. Bien que ce mécanisme de résistance ne soit pas entièrement étudié et compris, il est crucial pour la sélection et la modification génétique des plants d’arachide pour de nouveaux cultivars résistants aux champignons²³. Malgré l’existence de diverses procédures analytiques pour la détermination de l’aflatoxine dans différents produits, il est toujours nécessaire de disposer de méthodes simples pour des recherches spécifiques, en particulier lorsque les méthodes traditionnelles ne satisfont pas aux exigences analytiques et rentables. La plupart des méthodes de nettoyage modernes utilisées par l’industrie de l’arachide, l’agriculture et les laboratoires privés sont des dispositifs à base d’anticorps²⁴ et d’immunodosage^{25, 26, 27}. Ils sont sélectifs et sensibles, mais nettement plus coûteux que les mini-colonnes remplies d’adsorbants courants. De plus, aucune de ces méthodes n’a été conçue pour l’analyse d’échantillons de quelques milligrammes. Sur la base de nos recherches antérieures sur l’utilisation analytique de mini-colonnes²⁸ remplies de gel de silice de magnésium (Florisil), nous avons modifié cette procédure pour répondre aux besoins des programmes de présélection et de sélection en cours et futurs.

L’objectif de ce travail était de mettre au point une méthode non destructive, à débit moyen et respectueuse de l’environnement pour la détermination quantitative des aflatoxines et des phytoalexines dans les graines d’arachide. Une telle méthode a été développée. Ses avantages par rapport aux méthodes publiées sont une sensibilité plus élevée, la possibilité d’analyser les aflatoxines et les phytoalexines dans un extrait de graine unique, l’absence de pesée des échantillons et un coût inférieur grâce à de plus petits volumes de consommables. L’organigramme de la méthode intégrée est illustré à la figure 1. Les analyses génétiques et les autres étapes sont mentionnées dans ce texte et démontrées dans la figure pour montrer l’importance de la méthode suggérée et comment elle est intégrée à l’ensemble de la procédure.

Protocole

1. Préparation des graines pour le défi fongique

1. Incuber l’aflatoxigène Aspergillus flavus NRRL 3357 sur une couche oblique de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) dans un tube à essai pendant 6 jours à 30 °C. Récoltez les spores fongiques dans le tube à essai avec 10 mL d’eau avec Tween 20 (100 μL de Tween dans 1 L d’eau distillée stérile), filtrez-les à travers de la laine de verre placée dans un entonnoir et comptez les spores avec un hémocytomètre en vous référant au manuel d’utilisation.
2. Diluer la suspension de spores avec de l’eau stérile à une concentration de 1 000 spores/μL. Confirmez la concentration à l’aide d’un hémocytomètre.
   REMARQUE : Préparez la suspension de spores au plus tôt 2 h avant les expériences difficiles.
3. Cassez doucement les gousses de cacahuètes et retirez les coques. Placez les graines dans un bécher stérile de manière à ce que le volume des graines ne dépasse pas 1/5 du volume du bécher, ajoutez une solution de peroxyde d’hydrogène à 0,05 % à environ 70 % du volume du bécher et laissez les graines s’imprégner d’eau pendant 3 h.
4. Décantez la solution de peroxyde d’hydrogène des graines et ajoutez environ 3 fois la quantité de mélange éthanol-eau à 80 % (v/v) dans le bécher pour couvrir les graines. Laisser reposer 1 min, puis rincer les graines 2x avec des volumes égaux d’eau distillée stérile.
5. Ajoutez un volume 5 fois plus élevé de peroxyde d’hydrogène à 3 % dans le bécher avec les graines stérilisées à l’éthanol et laissez reposer pendant 5 minutes, puis décantez le liquide et rincez les graines deux fois avec des volumes égaux d’eau stérile (figure 2A).

Figure 2 : Préparation des graines d’arachide pour l’inoculation, l’incubation et l’extraction des fractions d’aflatoxine et de phytoalexine. (A) Stérilisation des graines imbibées de peroxyde d’hydrogène à 3 % ; (B) l’élimination des testa (peau) des graines ; (C) couper la partie axiale embryonnaire ; (D,E) perçage d’une cavité dans un demi-cotylédon à l’aide d’un trépan ; (F) placer les parties semées des graines sur de l’agar ; (G) l’application de spores fongiques dans la cavité percée. (H) Boîte de Pétri avec graines après incubation ; (I) placer les graines simples incubées (photo des échantillons de contrôle) dans des tubes à billes renforcés ; (J) l’ajout du volume mesuré de solvant d’extraction ; (K) pulvérisation d’échantillons dans un rupteur à billes ; (L) centrifugation de boue pulvérisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Placez les graines sur une serviette en papier stérile, retirez le testa de la graine à l’aide d’une pince et coupez environ 1/3 de la graine contenant l’axe embryonnaire à l’aide d’un scalpel (Figure 2B,C).
7. Jetez cette partie de la graine ou utilisez-la pour faire pousser une plante dans un tube à essai avec un milieu de croissance (Figure 1B,E).
8. Divisez la partie restante de la graine en deux cotylédons, placez-les dans une boîte de Pétri, couvrez les parties de la graine avec du papier filtre stérile humide, remettez le couvercle pour éviter la déshydratation et passez rapidement à l’étape d’inoculation.
9. Avant d’effectuer les expériences difficiles, préparez un nombre suffisant de boîtes de Pétri avec un milieu d’incubation des graines en versant 26 ml de gélose stérile à 1,5 % dans de l’eau dans les boîtes de 100 x 15 mm et laissez-les se solidifier pendant la nuit.
10. Au milieu de la face externe de chaque cotylédon restant, faites une cavité de 1,5 à 2 mm de profondeur en forant manuellement la graine à l’aide d’un foret stérile tranchant de 1,6 à 2,34 mm de diamètre. Il faut ~2-5 s pour faire une cavité (Figure 2D,E).
11. Placez 4 à 6 morceaux de graines « percés » dans une boîte de Pétri avec de la gélose et appliquez 2 μL de la suspension de 1 000 spores/μL dans la cavité percée de chaque demi-cotylédon avec une pipette de 10 μL. Au lieu de la suspension de spores, appliquez de l’eau stérile sur les graines témoins (figures 2F, G).
12. Couvrez toutes les boîtes de Pétri avec des couvercles et incubez à 30 °C sans lumière pendant 72 h.

2. Échantillonnage et préparation des plantons incubés pour l’analyse de l’aflatoxine et de la phytoalexine

1. Recueillir les semences à 72 h en les retirant de la gélose à l’aide d’une pince et en les plaçant dans des flacons de billes de 7 mL marqués avec 13 billes de céramique de zirconium (12 de 2,8 mm de diamètre et 1 de 6,5 mm de diamètre) (figure 2H,I).
   REMARQUE : À ce stade, s’ils ne sont pas traités immédiatement, les flacons peuvent être placés dans un congélateur à -80 °C et conservés jusqu’à 2 mois avant d’être traités ultérieurement.
2. Les phytoalexines et les aflatoxines sont déterminées dans le même extrait de graine. Pour l’extraction, en fonction de la taille visuelle des graines (petite, moyenne ou grande), ajoutez 2 ou 4 mL de mélange méthanol-eau mesuré avec précision (90:10, v/v) dans les flacons de billes et pulvérisez à 5,5 m/s pendant 45 s. Placer les flacons contenant les graines pulvérisées dans une centrifugeuse et centrifuger à 1 860 × g pendant 3 min (Figure 2J - L).
   REMARQUE : Les dérivés importants de stilbénoïdes^17,22 suivants sont déterminés (tous en transconfiguration) : resvératrol, arachidine-1, arachidine-2, arachidine-3, 3'-isopentadiényl-3,5,4'-trihydroxystilbène (IPD) et SB-1.
3. Pour les analyses d’aflatoxines, avant d’exécuter les expériences difficiles, préparez un nombre suffisant de colonnes de nettoyage comme suit. Placez une fritte de polyéthylène poreuse (20 μL) dans une colonne de polypropylène de 1,5 mL à l’aide d’une tige de verre coupée à un angle de 90^O . Placez 50 mg de gel de silice de magnésium (100-200 mesh) dans la colonne à l’aide d’une cuillère sur mesure et recouvrez la colonne avec une fritte identique en la poussant vers le bas avec une tige de verre (Figure 3A - E).
   REMARQUE : Cette quantité de gel de silice de magnésium occupe un volume de 75 μL et la hauteur de la couche adsorbante est de 3 mm.

Figure 3 : Préparation des colonnes de nettoyage et des filtres. (A,B) Mise en place d’une fritte poreuse dans le baril ; (C,D) remplissage du baril avec du gel de silice de magnésium ; (E) en tapotant l’adsorbant et en insérant une fritte poreuse supérieure dans le baril. (F) Placer un cercle en fibre de verre de 11,5 mm de diamètre sur une pipette Pasteur. (G,H) En poussant le centre du cercle avec une tige en plastique ou en bois jusqu’au fond du corps de la pipette Pasteur et en compactant fermement la fibre de verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. À ce stade, préparez un nombre correspondant de filtres personnalisés, comme illustré à la figure 3F - H.
5. Pour les analyses d’aflatoxines, mesurer avec précision jusqu’à 0,5 mL d’aliquote du surnageant (obtenue comme décrit à l’étape 2.2), le transférer dans la mini-colonne emballée sur mesure et laisser l’extrait s’écouler par gravité dans un flacon en verre de 4 mL. Transférez 1,0 mL de mélange méthanol-eau (90:10, v/v) dans la colonne pour éliminer les impuretés par gravité dans le même flacon de 4 mL (figure 4A).

Figure 4 : Purification des extraits de graines et préparation des analyses UPLC. (A) Rack avec colonnes garnies. (B) Solvant d’évaporation avec du gaz_N2 à partir de six flacons de 4 mL avec extrait purifié élué des colonnes de nettoyage. (C) Amener les flacons et les filtres à une température inférieure à zéro dans des contenants en mousse (1 et 2) avec de la glace avant et après l’ajout du solvant d’injection (MeOH-H₂O 9:1, v/v) aux flacons de 4 mL. (D) Filtration de l’extrait refroidi d’un flacon de 4 mL dans un flacon d’échantillonneur automatique de 400 μL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Jeter les éluats combinés. Éluer la fraction d’aflatoxine par gravité de la colonne dans un flacon en verre propre de 4 mL avec un mélange d’acétone-acétonitrile-eau-acide formique à 88 % (65:31:3.5:0.5, v/v) (figure 4A).
7. On peut aussi éluer les aflatoxines de la colonne avec 2,0 mL de mélange d’acétonitrile-eau-acide formique à 88 % (96:3,5:0,5, v/v), et injecter une aliquote de l’éluat, jusqu’à 2 μL, directement dans le système de chromatographie liquide à ultra performance (UPLC) (sans évaporation du solvant avec N₂).
   REMARQUE : Dans ce cas, attendez-vous à une limite de quantification jusqu’à 10 fois inférieure pour les aflatoxines ; Dans la majorité des cas, une telle baisse de sensibilité est acceptable car les concentrations d’aflatoxine dans les graines contestées sont souvent élevées.
8. Retirer le solvant des flacons en un jet de N₂ dans un bloc chauffé à 45 °C. Boucher le flacon et le placer dans un récipient avec de la glace pilée pendant 30-45 s pour minimiser l’évaporation du solvant ajouté à l’étape suivante. Placez les filtres fabriqués sur mesure dans des tubes à essai jetables et insérez-les dans de la glace dans un autre récipient pour minimiser l’évaporation du solvant lors de la filtration (figures 4B et C).
9. Après évaporation du solvant, dissoudre le résidu sec dans 0,25 à 1,0 mL de mélange méthanol-eau mesuré avec précision (90:10, v/v) et tourbillonner pendant 1 à 2 s. Placez les flacons contenant des extraits purifiés dans l’échantillonneur automatique UPLC et injectez 0,1 à 3,0 μL dans le système UPLC (Figure 5A,B).
   REMARQUE : Si l’on soupçonne que la solution après vortex contient des particules en suspension, filtrez la solution à travers le filtre refroidi (Figure 4D).

Figure 5 : Le processus et les résultats des analyses UPLC d’extraits purifiés. (A) Placement d’un rack contenant des extraits d’échantillons purifiés dans un passeur d’échantillons UPLC. (B) Effectuer les analyses instrumentales, obtenir des données et interpréter les résultats. (C) UPLC de quatre aflatoxines majeures ; les principaux pics d’intérêt, les aflatoxines B₁ et B₂ représentent respectivement 0,04 et 0,004 ng. (D) UPLC des aflatoxines B₁ et B₂ ; le pic 2 représente l’aflatoxine B₁ à un niveau de 2 pg (avec une cellule d’écoulement de 8 μL). (E) UPLC d’extrait purifié d’une graine récoltée dans un champ d’arachide local avec une espèce sauvage d’Arachis. (F) UPLC de l’extrait d’une graine d’arachide contestée purifiée avec une mini-colonne basique d’oxyde d’aluminium. (G) UPLC de l’extrait de graine d’arachide contestée purifiée avec une colonne Florisil ; le chromatogramme bleu présente les impuretés qui sont lavées de la colonne avec 1 mL de mélange méthanol-eau (90:10 v/v) ; Le chromatogramme noir montre des pics d’aflatoxines M₁ et B₁. Le taux d’aflatoxine_B1 est de 48 ng/g. (H) Un chromatogramme typique des stilbénoïdes d’arachide à partir d’une graine contestée ; abréviation : IPD = 3′-isopentadiényl-3,5,4′-trihydroxystilbène. Remarque : Tous les stilbénoïdes contenus dans les extraits de graines sont en transconfiguration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

10. Pour les analyses de phytoalexine, à partir de chaque flacon de billes, transférez 200 μL de surnageant dans le filtre à pipette Pasteur ci-dessus. Utilisez du gaz N₂ provenant d’un réservoir d’azote comprimé pour accélérer la filtration dans un flacon d’échantillonneur automatique UPLC de 400 μL et bouchez le flacon avec un capuchon assorti d’un septum en PTFE (figure 4D).

3. Analyses de l’aflatoxine

1. Pour la séparation des aflatoxines dans les extraits de graines, utilisez un système UPLC équipé d’un échantillonneur automatique, d’une pompe quaternaire, d’un détecteur fluorescent, d’une colonne UPLC BEH C18 de 3,0 mm x 100 mm avec une précolonne correspondante et d’un réacteur photochimique post-colonne (PHRED) avec une bobine de PTFE tricotée standard de 0,25 de diamètre interne coupée à 25 % de sa longueur d’origine.
   REMARQUE : L’instrument UPLC et l’équipement associé utilisés par les auteurs sont répertoriés dans la table des matériaux.
2. Utilisez de l’eau (A), du méthanol (B) et de l’acétonitrile (C) dans le gradient suivant : conditions initiales, 62,7 % A, 24 % B, 13,3 % C, changé linéairement à 30 % A, 45 % B, 25 % C en 3,75 min, changé à 0 % A, 64,4 % B, 35,6 % C en 3,751 min, maintenu isocratique pendant 3,249 min, puis passé aux conditions initiales en 0,01 min et maintenu isocratique pendant 2,499 min avant l’injection suivante. Réglez le débit à 0,45 ml/min et le temps de fonctionnement à 9,5 min. Maintenez la colonne à 40 °C dans le réchauffeur de colonne du système. Utilisez 362 nm et 440 nm comme longueurs d’onde d’excitation et d’émission, respectivement, pour la quantification des aflatoxines B₁, B₂, G₁, G₂ et M₁ . Les structures des principales aflatoxines sont illustrées à la figure 6A.
   REMARQUE : Dans les conditions expérimentales, seules les aflatoxines B₁ et B₂ devraient être produites par A. flavus NRRL 3357 ; si une souche d’A. parasiticus est utilisée pour la production de graines, on s’attend à ce qu’elle produise des aflatoxines B₁, B₂, G₁ et G₂ .
3. Déterminer les concentrations d’aflatoxines par rapport aux zones de pic des étalons authentiques correspondants (courbe d’étalonnage) comme décrit dans le manuel d’utilisation du logiciel.
   REMARQUE : Étant donné que la procédure UPLC présente un bruit de base aux paramètres de sensibilité élevés pour le détecteur fluorescent, la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) pour les aflatoxines sont évaluées à l’aide du rapport signal/bruit largement accepté de 3:1 pour LOD et de 10:1 pour LOQ. Dans le dispositif expérimental de routine pour l’analyse des graines d’arachide, décrit aux sections 2 et 3, les limites de quantification pour les aflatoxines G₁ et B₁ devraient être inférieures ou égales à 0,8 et 0,08 ng/g pour les aflatoxines G₂ et B₂, respectivement.

4. Analyses de phytoalexine stilbénoïde

1. Pour la séparation des stilbénoïdes, utiliser de l’eau (A), du méthanol (B) et de l’acide formique à 88 % (C) dans le gradient suivant : conditions initiales, 53 % A, 42 % B, 5 % C, changé linéairement à 35 % A, 60 % B, 5 % C en 2,0 min, maintenu isocratique pendant 4 min, changé à 0 % A, 95 % B, 5 % C en 0,5 min, maintenu isocratique pendant 2,5 min, puis est passé aux conditions initiales en 0,1 min et a été maintenu isocratique pendant 2,9 min avant l’injection suivante. Réglez le débit à 0,5 mL/min et le temps de fonctionnement à 12,0 min.
2. Déterminer les concentrations de stilbénoïdes par référence aux aires de pic des étalons authentiques correspondants (courbe d’étalonnage) et/ou aux coefficients publiés d’extinction molaire, comme décrit dans le manuel d’utilisation du logiciel. Les structures des principales phytoalexines dérivées du stilbène sont illustrées à la figure 6B.
   REMARQUE : La séparation des phytoalexines est réalisée à l’aide du même système, mais sans détecteur fluorescent ni réacteur PHRED. Au lieu de cela, un détecteur à barrettes de diodes est utilisé pour la détection et la quantification des stilbénoïdes d’arachide. La limite de quantification (LQ) pour les principales phytoalexines stilbénoïdes n’a pas de signification pratique, car les concentrations de stilbénoïdes dépassent les concentrations d’aflatoxines dans le même extrait de plusieurs ordres de grandeur ; Après 3 jours d’incubation, les stilbénoïdes sont quantifiés de manière fiable.

Résultats

La méthode mise au point pour la quantification de l’aflatoxine dans les graines est au cœur de toute la procédure d’évaluation de la résistance à l’accumulation d’aflatoxine des espèces d’arachide sauvage. Les mini-colonnes et les filtres emballés sur mesure permettent de réaliser des économies substantielles et simplifient la procédure globale en raison de l’absence de grands volumes de solvants, de filtres commerciaux coûteux et inutiles de 0,22 ou 0,45 μm et de dispositifs de pompage. La méthode d’analyse des aflatoxines permet d’obtenir des taux de récupération élevés, une exactitude et une précision dans la plage testée de 1,0 à 50,0 ng/g d’aflatoxines à partir de graines moulues, comme le montre le tableau 1. Les échantillons fortement contaminés ont été dilués à la valeur d’essai linéaire. La figure 5C montre une séparation de base de quatre aflatoxines principales, B₁, B₂, G₁ et G₂ en 5 minutes de temps d’élution, ce qui est acceptable puisque la provocation fongique des graines d’arachide est l’étape limitante de la procédure et non les analyses UPLC.

La méthode proposée est suffisamment sensible avec une limite de quantification de 2 pg pour l’aflatoxine_B1 (figure 5D). La grande pureté des extraits permet une quantification sans ambiguïté des aflatoxines, comme le montre une UPLC (Figure 5E) d’extrait purifié de graines récoltées dans un champ avec une espèce sauvage d’Arachis . Une méthode de mini-colonne publiée antérieurement²⁹ n’est pas en mesure d’obtenir une pureté satisfaisante pour les graines d’arachide déficientes (figure 5F) par rapport à la méthode proposée (figure 5G). D’après la figure 5F , il est évident que les aflatoxines B₂, G₁ et G₂ ne peuvent pas être détectées et quantifiées de manière fiable en raison de la présence de fortes concentrations d’impuretés interférentes, dont beaucoup, éluées après les aflatoxines, sont des phytoalexines stilbénoïdes et des métabolites fongiques. En revanche, la figure 5G démontre la grande efficacité de la colonne de gel de silice de magnésium pour éliminer les impuretés de la fraction d’aflatoxine. Le chromatogramme bleu présente des impuretés interférentes qui sont lavées de la colonne avec 1 mL de mélange méthanol-eau (90:10) ; Le chromatogramme noir montre des pics non obscurcis d’aflatoxines M₁ et B₁. Ce chromatogramme représente l’extrait d’une graine d’une espèce sauvage contestée. Le taux d’aflatoxine_B1 est de 48 ng/g.

La quantification des phytoalexines d’arachide est un ajout précieux aux analyses des aflatoxines dans la même graine, qui peut être une graine naturelle d’un champ ou une graine contaminée par des champignons. La figure 5H montre un chromatogramme typique de stilbénoïdes défensifs d’arachide à partir d’une graine contestée. La séparation des composés est réalisée à l’aide de la même colonne analytique que celle utilisée pour les analyses d’aflatoxines. La colonne et les conditions chromatographiques choisies permettent une séparation satisfaisante des pics, permettant une quantification fiable des stilbénoïdes. L’évaluation de la relation aflatoxine-phytoalexine dans les graines contestées dépasse le cadre de cette présentation et la méthode est suggérée ici comme un outil de recherche potentiel, qui a été utilisé dans le laboratoire des auteurs pendant plusieurs années et s’est avéré utile.

Figure 6 : Structures des principales aflatoxines et des phytoalexines d’arachide dérivées du stilbène. (A) Structures des principales aflatoxines : 1, B₁ ; 2, B₂ ; 3, G₁ ; 4, G₂. (B) Structures des principaux phytoalexines d’arachide dérivées du stilbène : 6, resvératrol ; 7, arachidine-1 ; 8, arachidine-2 ; 9, arachidine-3 ; 10, PI (3′-isopentadiényl-3,5,4′-trihydroxystilbène) ; 11, SB-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Pointe de niveaua (ng/g)	Aflatoxines
	B1	B2	G1	G2
50	85.87 (0.97)	82.33 (0.67)	86.63 (2.89)	84.01 (0.86)
5	91.43 (2.76)	87.32 (0.47)	88.08 (2.08)	87.73 (0.77)
1	81.21 (3.16)	85.33 (1.98)	81.76 (4.66)	88.46 (3.24)

Tableau 1 : Récupération des aflatoxines à partir des graines d’arachide à l’aide de la colonne Florisil et de 1,2 mL du mélange d’élution de fraction d’aflatoxine. [moyenne (écart-type), % ; n = 5]. Des échantillons de sol sans aflatoxine (50 g) de cultivar d’arachide Georgia 06G ont été uniformément enrichis à l’aide d’une micro-seringue avec une solution mère d’aflatoxine à 50, 5 ou 1 ng/g, et laissés à température ambiante pendant 16 h. ^a Les niveaux de pointe sont indiqués pour les aflatoxines B₁ et G₁ ; pour les aflatoxines B₂ et G₂ , le facteur multiplicateur de 0,33 doit être utilisé.

Discussion

Sur la base de notre expérience antérieure²⁸, nous avons mis au point une procédure chimique simple, peu coûteuse et respectueuse de l’environnement adaptée à l’exploration des collections de matériel génétique d’Arachis sauvage afin d’identifier les espèces résistantes à Aspergillus et de déterminer et de caractériser de nouvelles sources de résistance génétique à ce champignon opportuniste. Cette méthode est basée sur la purification de l’extrait de graine par une technique d’extraction en phase solide (SPE) et la quantification de l’aflatoxine par chromatographie liquide ultra performante (UPLC) et se caractérise par une récupération, une précision et une exactitude suffisamment élevées. La méthode « Florisil » proposée est une modification de la procédure de nettoyage d’une seule minicolonne qui est basée sur la propriété unique de Florisil (gel de silice de magnésium) de retenir fortement et sélectivement les aflatoxines²⁸. Comme dans la méthode originale, les échantillons de graines ont été extraits avec un mélange MeOH-H₂O, mais à une proportion différente de 90:10 (v/v) par rapport à la proportion publiée de 80:20 (v/v). Ce changement a permis de multiplier par 2,5 le débit de solvants à travers la colonne de nettoyage avec le même taux de récupération de l’aflatoxine. Ce mélange méthanol-eau à 90:10 (v/v) a permis une récupération de près de 100 % des étalons d’aflatoxines B₁, B₂, G₁ et G₂ ajoutés à l’extraction du solvant à des niveaux de pointe équivalents à 5 à 50 ng de concentrations d’aflatoxine dans 1 g de substrat, ainsi que des taux de récupération suffisamment élevés à partir des échantillons de graines d’arachide enrichies (tableau 1).

Il a été démontré que les aflatoxines ne peuvent être éluées de l’adsorbant Florisil qu’avec de grands volumes d’acétone³⁰, d’acétone-méthanol ^31,32 et de mélanges acétone-eau 33,34,35,36. Au cours de la présente recherche, nous avons découvert que l’acétonitrile acidifié se comporte de manière similaire à l’acétone dans sa capacité à éluer les aflatoxines de Florisil. À notre connaissance, cette propriété de l’acétonitrile n’a pas été rapportée dans la littérature. La découverte de cette propriété permet d’injecter l’extrait purifié directement dans le système UPLC en omettant l’étape d’évaporation du solvant, ce qui réduit considérablement le temps de préparation. Même lorsque l’acétonitrile était mélangé à de l’acétone (acétone-acétonitrile-eau-acide formique à 88 % (65:31:3.5:0.5, v/v)), il permettait une élimination douce, complète et rapide de l’eau des éluats purifiés, réduisant considérablement le temps d’évaporation du solvant. La présence d’acétonitrile a permis d’utiliser un seul solvant, un mélange méthanol-eau (90:10, v/v) pour éliminer efficacement les impuretés de la colonne Florisil, par rapport à une méthode publiée, où deux solvants de lavage supplémentaires, le méthanol et le mélange chloroforme-méthanol, étaient nécessaires. ²⁸

En moyenne, la récupération standard de l’aflatoxine B₁ était de ~98% lors de l’utilisation de 1,2 mL pour l’élution des aflatoxines. La quantité de 50 mg de Florisil a été choisie de manière à ce que 1,2 mL du solvant d’élution remplisse la minicolonne jusqu’au sommet du baril et, en même temps, fournisse une récupération satisfaisante (tableau 1). Cette approche accélère la procédure de nettoyage, car le baril de la colonne ne doit être rempli qu’une seule fois. Au début de ce projet, il n’était pas clair si une fraction commerciale de Florisil avec une taille de particule relativement grande, de 100 à 200 mailles, serait appropriée pour une petite colonne contenant seulement une couche de 3 mm de l’adsorbant. Par conséquent, nous avons exploré différentes fractions de Florisil obtenues à partir d’un produit commercial de 100-200 mailles à l’aide de tamis d’essai standard américains 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 et >400 mailles. Toutes ces fractions ont fourni des résultats reproductibles, presque identiques, avec une récupération satisfaisante. Bien que des fractions de particules plus petites aient montré des bandes d’aflatoxine plus étroites dans la colonne sous la lumière UV, ces fractions n’étaient en aucun cas supérieures à celles du produit commercial à mailles 100-200. De plus, la fraction de 100-200 mailles a montré les temps d’élution les plus courts (8-12 min) pour l’ensemble de la procédure.

L’administration de solvant UPLC à gradient a permis une séparation satisfaisante des aflatoxines ainsi qu’une élimination complète des impuretés non polaires de la colonne (Figure 5G). Cette approche a permis un fonctionnement sans faille de la colonne et des résultats reproductibles de l’analyse de centaines d’échantillons. L’identité des aflatoxines éluées dans la colonne de Florisil a été confirmée comme décrit précédemment. ²⁸ La colonne analytique UPLC de 3 mm de diamètre utilisée ici a démontré une sélectivité plus élevée et une séparation plus fiable des aflatoxines B₁, B₂, G₁ et G₂ à des concentrations plus élevées par rapport à la colonne de 2,1 mm de diamètre de la même chimie. De plus, la longévité de la colonne de 3 mm (plus de 1 200 injections) était nettement supérieure à celle de la colonne de 2,1 mm (jusqu’à 800 injections). Même si la colonne de 3 mm nécessitait un taux plus élevé de la phase mobile (40% de plus), cet inconvénient a été surpassé par les avantages ci-dessus de la colonne.

La minicolonne Florisil s’est avérée efficace pour la purification d’extraits de graines d’arachide fortement contaminées par les métabolites d’Aspergillus (Figure 5G) ; Ces graines contenaient également des niveaux élevés de phytoalexines stilbénoïdes qui ont été produites par les graines en réponse à l’invasion fongique. Toutes ces impuretés peuvent dépasser la concentration d’aflatoxine dans les graines jusqu’à 10^{fois 6} fois²², ce qui rend ces graines difficiles à analyser pour l’aflatoxine. La figure 5G montre l’absence de pics interférents dans le chromatogramme pendant les temps de rétention de l’aflatoxine, ce qui a permis de détecter et de quantifier l’aflatoxine sans compromis à tous les niveaux testés (tableau 1). Comme le montre le tableau 1, l’exactitude et la précision de la méthode étaient suffisamment élevées dans la plage testée de 1,0 à 50,0 ng/g, qui est également la plage la plus critique pour la détection de l’aflatoxine. Les taux de récupération à différents niveaux pour divers génotypes d’arachides sauvages étaient uniformes et les écarts-types pour cinq extractions différentes étaient essentiellement faibles.

La méthode a également été testée sur des graines d’arachide, de coton, de maïs et de riz naturellement contaminées de zéro à des niveaux extrêmement élevés, soit plus de 10 000 ng/g d’aflatoxines totales. La récupération des aflatoxines B₁, B₂, G₁ et G₂ à partir du maïs, des graines de coton et du riz à la dose de 5 ng/g a varié de 76,1 % à 93,7 %, de 77,1 % à 86,6 % et de 90,5 % à 96,2 %, respectivement. La récupération la plus élevée d’aflatoxines à partir du riz s’accompagnait de la « pureté » de l’éluant, c’est-à-dire pratiquement de l’absence de toute impureté. De plus, le riz représentait le plus petit objet testé, en moyenne, 19 mg/graine.

Le temps total de préparation d’une seule graine d’arachide (y compris le décorticage, la pesée, l’extraction, la centrifugation et la purification) à l’aide d’une colonne Florisil n’a pas dépassé 20 min. Le coût de la mini-colonne Florisil est >10 fois inférieur à celui des colonnes de nettoyage commerciales. Des économies supplémentaires découlent de l’utilisation de volumes plus faibles d’adsorbants, de solvants et d’azote gazeux par rapport à la procédure publiée²⁸. La minicolonne ne nécessite pas de dispositifs de pompage ou de vide pour fonctionner et a une durée de conservation indéfinie.

L’exploration de la résistance du matériel génétique végétal aux aflatoxines est exceptionnellement difficile car l’accumulation de mycotoxines ne suit pas une distribution normale^37,38 ; Un grand nombre d’analyses d’aflatoxines dans les graines uniques est nécessaire pour surmonter ce phénomène. En plus de la teneur en aflatoxines, les informations sur la composition quantitative en phytoalexine sont très précieuses à la lumière d’un grand nombre d’informations qui peuvent être obtenues à partir d’une seule graine (Figure 1A) et suivies jusqu’à une plante spécifique (Figure 1E). La méthode a été utilisée avec succès pour le criblage de centaines d’accessions, y compris des variétés locales, des lignées de sélection avancées et des variétés d’arachide d’élite. Cette méthode est proposée pour les programmes de recherche sur la présélection et la sélection des arachides et pourrait aider à caractériser les gènes de résistance fongique des arachides.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acétonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2,1 x 5mm Van-Guard pré-colonne	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm	colonne Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2,1 x 100mm	colonne Waters Corporation
Aflatoxines B1, B2, G1 et G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Dissoudre le contenu du flacon commercial dans 5 mL de méthanol pour obtenir 5 µ ; g/mL pour les aflatoxines B1 et G1 et 1,5 & micro ; g/mL pour B2 et G2
Aflatoxine B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxine B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxine G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxine G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxine M1 (10 µ ; g)	CRM46319		Sigma-Aldrich
, granulée (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Oxyde d’alumine basique (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Moyenne basale	Murashige et Skoog	M5519
Bead Ruptor 24  ;	Omni International	19-042E
Bécher (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Bécher (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Bécher (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Bécher (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Lame, scalpel	Feather	#10
Centrifugeuse (LSE Compact)	Corning	Modèle : 6755
Centrifugeuse, micro	Corning	Modèle : 6770
Billes en céramique (2,8 mm)	Omni International	19-646
Billes en céramique (6,5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Foret	Kyocera	07896	Mèche 1,6 mm
	Kyocera	07357	Mèche 2,0 mm
	Kyocera	07985	2,34 mm
Éthanol (200 proof)	Decon Labs	2805M
Évaporateur,	organimation	d’azote 11106	6 positions
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Papier filtre (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Coupe-papier filtre, acier inoxydable (ID 11.5mm)	Inconnu
Papier filtre, fibre de verre	Cytiva Whatman	934-AH
Flacon (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Pince	Integra Lifescience ( Miltex)	PM-0300
Acide formique (88 %, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Congélateur (-80oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Entonnoir (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (moyen)	Caisson Labs  ;	G024
Tige de verre (sur mesure)	sur
	Corning (Pyrex)	3950
Poignée, scalpel  ;	Feather	#7
Hémocytomètre	Hausser Scientific	3100
Peroxyde d’hydrogène	Fisher Scientific	H325-4	30 %, Certifié ACS
Seau à glace, rond avec couvercle	Corning	432122
Incubateur	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Marque Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Marque Kimwipes	Kimtech	34256	16.4 » x 14.43
Blouse de laboratoire	Cenmed	B113660SBXL
Méthanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini support de colonne (personnalisé)	sur
, tactile (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (modèle 231)
Gants en nitrile  ;	Microflex	XC310M
Azote gazeux, comprimé (ultra haute pureté)	Jones Welding
Serviette en papier	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH-mètre	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
Électrode pH/ATC	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Réacteur	photochimiqueWaters (Vicam)	600001222
Pipette, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	Pipette 9"
(1 mL) (Référence 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 &mu ; L) (Référence)	Eppendorf	022470051D
Pointes de pipette : 10 &mu ; L, 200 &mu ; L, 1 mL	Pipette F144054M		Eppendorf
(200 & micro ; L)(Ergofit)  ;	Fisher Scientific	12-146-679
Planques, petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Gélose pomme de terre au dextrose (500g)	Becton Dickinson  ;   ;
Tube à billes renforcé (2 mL)	Omni International	19-660
Tube à billes renforcé (7 mL)	Omni International	19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL)	Brandtech	4701141
Resvératrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (sur mesure)	Sur
pot à bouchon à vis (250 mL)  ;	Corning (Pyrex)	1395250
Gel de silice, sphérique (200-400 mesh)  ;	Supelco	97727-U	100 g
d’hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	S318-500
SPE propre 1,5 mL colonne de polypropylène.	American Chromotography Supplies	SP-5122382
Extrait SPE de frittes de PP propres (pour mini-colonne de 1,5 ml)	American Chromotography Supplies	SP-3119414
Spectrophotomètre, UV-visible	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Tube à essai	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Tube à essai (jetable)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Tube à essai (jetable)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish pompe quaternaire F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polysorbate 20) (qualité enzymatique)	Fisher Scientific	BP337-500
Bouchons de flacons (4 ml)	Fisher Scientific	C4015-75A
Bouchons de flacons (passeur d’échantillons)	Fisher Scientific	C4010-60A
Flacons et bouchons (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
Flacons, verre (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
Flacons, polypropylène (passeur d’échantillons) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Eau, Optima  ;	Fisher Scientific	W6-4