Enregistrement de l’activité musculaire des membres antérieurs chez des souris fixées à la tête avec des électrodes EMG implantées de manière chronique

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication à la main et l’implantation chirurgicale d’électrodes électromyographiques (EMG) dans les muscles des membres antérieurs de souris pour enregistrer l’activité musculaire pendant les expériences de comportement fixe de la tête.

Résumé

La recherche en neurosciences sur les systèmes de souris a permis aux chercheurs d’interroger le fonctionnement du système moteur avec une précision sans précédent chez des souris à tête fixe effectuant une variété de tâches. La petite taille de la souris rend difficile la mesure de la puissance motrice, car la méthode traditionnelle d’enregistrement électromyographique (EMG) de l’activité musculaire a été conçue pour les animaux plus grands comme les chats et les primates. En attendant la disponibilité commerciale d’électrodes EMG pour les souris, la méthode de référence actuelle pour enregistrer l’activité musculaire chez les souris consiste à fabriquer des jeux d’électrodes en interne. Cet article décrit un raffinement des procédures établies pour la fabrication manuelle d’un ensemble d’électrodes, l’implantation d’électrodes dans la même chirurgie que l’implantation de la plaque de tête, la fixation d’un connecteur sur la plaque de tête et les soins de récupération postopératoire. Après la récupération, des enregistrements EMG de résolution milliseconde peuvent être obtenus pendant un comportement fixe pendant plusieurs semaines sans changements notables de la qualité du signal. Ces enregistrements permettent une mesure précise de l’activité musculaire des membres antérieurs parallèlement à l’enregistrement neuronal in vivo et/ou à la perturbation pour sonder les mécanismes de contrôle moteur chez la souris.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les souris sont devenues un organisme modèle attrayant pour l’étude du système moteur des mammifères. Les approches expérimentales courantes impliquent des souris à tête fixe effectuant des tâches motrices parallèlement à la surveillance et/ou à la perturbation de l’activité neuronale 1,2,3,4,5. Les études du système moteur chez les espèces plus grandes (comme les chats et les primates) se sont traditionnellement appuyées sur l’électromyographie (EMG) pour mesurer directement la production motrice au cours de ces expériences^. Cependant, l’enregistrement de l’activité musculaire chez les souris est difficile car leur musculature est trop petite pour les électrodes EMG disponibles dans le commerce et utilisées dans les expériences sur les grands mammifères⁹. De nombreux chercheurs choisissent de suivre la cinématique des membres par le biais de vidéos ^4,10,11 et/ou de performances comportementales ^2,4,12 pour sonder indirectement la sortie motrice, mais ces méthodes n’ont pas la résolution nécessaire pour détecter l’influence de l’activité neuronale à l’échelle de la milliseconde et sa perturbation sur les muscles. Ainsi, l’enregistrement de l’EMG est souhaitable pour les chercheurs intéressés par le contrôle neuronal direct des muscles.

L’EMG consiste à mesurer la tension entre deux points, généralement séparés par une courte distance à peu près parallèle aux fibres du muscle enregistré. Les électrodes EMG sont disponibles en surface (ou « patch ») et intramusculaires (ou « aiguille »). Les électrodes de surface sont placées sur la peau ou superposées sur le tissu musculaire et fixées avec un adhésif ou une suture. En tant que telles, les électrodes de surface sont moins invasives que les électrodes intramusculaires et sont plus populaires auprès des humains, des chats et des primates en raison de leur relative facilité d’utilisation. Les électrodes de surface ont également été utilisées avec succès chez les rats et les souris^13,14 ; Cependant, ils doivent être fabriqués à la main et implantés chirurgicalement sous la peau en raison de la tendance des rongeurs à essayer d’éliminer les corps étrangers pendant le toilettage. Les électrodes EMG intramusculaires, quant à elles, sont implantées chirurgicalement dans le tissu musculaire. Parce qu’ils sont engloutis dans le tissu musculaire, ils offrent une haute résolution spatiale et restent fixes en position indéfiniment. Ainsi, les électrodes EMG intramusculaires implantées sont idéales sur les électrodes de surface pour des expériences à long terme sur des rongeurs. Pour enregistrer de manière fiable l’EMG intramusculaire chez la souris, les chercheurs ont mis au point une méthode de fabrication et d’implantation à la main d’électrodes EMG dans des muscles aussi petits que ceux de l’avant-bras d’une souris adulte. Ces électrodes permettent l’enregistrement musculaire chronique pendant le comportement moteur chez les rongeurs pendant plusieurs semaines.

Le protocole décrit ici est le résultat d’une décennie de perfectionnement des méthodes établies 15,16,17,18, qui a abouti à une procédure de fabrication, d’implantation et d’enregistrement à la main à partir d’électrodes EMG à fil implantées de manière chronique dans des paires de muscles fléchisseurs/extenseurs du coude et du poignet chez des souris se comportant. La première section décrit la fabrication à la main d’un jeu d’électrodes composé de quatre paires d’électrodes et d’un connecteur à 8 broches pour l’interface de l’étage principal. La section suivante détaille l’implantation chirurgicale des électrodes par voie intramusculaire dans les muscles du haut et de l’avant-bras dans la même chirurgie que l’implantation de la plaque de tête. Enfin, des enregistrements représentatifs de souris exécutant une variété de comportements sont discutés. Dans l’ensemble, cette méthode est un moyen rentable et personnalisable d’inclure des mesures d’activité musculaire dans des expériences de comportement à tête fixe, ce qui est idéal pour les laboratoires ayant une certaine expérience de la fabrication d’électrodes.

Protocole

Toutes les expériences et procédures ont été réalisées conformément aux directives du NIH et approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Northwestern. D’autres pays et/ou institutions peuvent avoir des réglementations différentes qui nécessitent des modifications de cette procédure. Les animaux inclus dans la présente étude étaient des mâles adultes C57BL6/J (voir le tableau des matériaux) âgés de 12 à 20 semaines et pesant au moins 20 g.

1. Fabrication d’un jeu d’électrodes

REMARQUE : Effectuez ces étapes sur une paillasse propre à l’aide d’un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de 10x à 40x et propres à mains nues. Voir la figure 1 pour des schémas détaillant le dénudage des fils d’électrode (figure 1A) et l’assemblage du connecteur (figure 1B).

1. Coupez les fils : Pour chaque paire d’électrodes, coupez deux morceaux de fil d’acier inoxydable tressé revêtu de PFA (7 brins, 0,0055" de diamètre) (voir le tableau des matériaux). Pour les muscles du bras, coupez chaque fil de 9,5 cm de long. Pour les muscles de l’avant-bras, coupez chaque fil de 10,5 cm de long.
2. Attachez les deux fils ensemble avec un seul nœud - cela deviendra le nœud situé juste à l’extérieur du site d’insertion (nœud proximal) lors de l’implantation. Les fils liés comprennent une paire d’électrodes.
   1. À l’aide d’une aiguille de 18 G insérée dans un morceau de carton ondulé, positionnez le nœud à 6 cm de l’extrémité d’insertion et serrez autour de l’aiguille en tirant les brins d’électrode contre le carton. L’extrémité d’insertion rétrécira à environ 5,5 cm, avec les 0,5 cm restants attachés dans le nœud.
   2. Retirez délicatement l’aiguille et tirez deux fois sur le nœud à mains nues pour le serrer davantage.
      REMARQUE : Le nœud ne doit pas être aussi serré que possible ; En resserrant de cette façon, vous obtiendrez un nœud proximal de la bonne taille pour ancrer les électrodes implantées dans les tissus.
   3. Pour les muscles du haut du bras, assurez-vous que les extrémités du connecteur mesurent 3,5 cm de long. Pour les muscles de l’avant-bras, assurez-vous que les extrémités du connecteur mesurent 4,5 cm de long.
3. Dénudez 0,5 mm d’isolant sur chaque fil : 1 à 1,5 mm du nœud sur un fil et 2 à 2,5 mm du nœud sur l’autre fil. La figure 1 illustre l’endroit où dénuder chaque fil.
   1. Collez l’électrode tendue contre un morceau de carton plat avec les deux fils d’extrémité du connecteur ensemble et les fils d’extrémité d’insertion écartés.
   2. À l’aide d’un scalpel, faites des entailles dans l’isolant, en marquant les extrémités où l’isolant sera retiré.
   3. À chaque entaille, faites une série de ~6 entailles avec une lame de scalpel à chaque entaille : ~2 en haut, ~2 sur le côté et ~2 en dessous du fil.
      REMARQUE : Il est essentiel d’éviter de trop couper le fil lui-même. Sinon, les brins peuvent se casser. Il faut s’entraîner pour obtenir la pression appropriée pour couper complètement l’isolant avec des dommages limités au fil.
   4. Faites pivoter la paire d’électrodes de 180 degrés et répétez les 6 coupes dans chaque entaille.
   5. Effectuez des coupes supplémentaires au besoin pour séparer les 0,5 mm d’isolant du fil sous-jacent. Le nombre de coupes nécessaires ici dépendra de la pression appliquée et de la netteté de la lame du scalpel.
   6. Inclinez la lame du scalpel pour couper le long de l’isolant desserré dans le sens de la longueur et retirez-la du fil à l’aide d’une pince.
   7. Inspectez le fil exposé pour détecter tout bris et/ou isolant effiloché qui pourrait causer des dommages lors de l’insertion dans les tissus.
4. Dénudez de 1 mm l’extrémité de chaque fil à l’extrémité du connecteur.
5. Dénudez l’extrémité de chaque fil à 5 mm à l’extrémité d’insertion.
6. Torsadez les segments du fil d’insertion ensemble et sertissez les extrémités exposées de 5 mm ensemble dans l’arbre d’un 0,5 po. Aiguille de 27 G. Des aiguilles hypodermiques typiques peuvent être utilisées après avoir retiré l’extrémité Luer Lock.
7. Répétez les étapes 1.1 à 1.6 pour chaque paire d’électrodes.
8. Assemblez le connecteur.
   1. Coupez l’extrémité femelle du connecteur à 12 broches (voir le tableau des matériaux) à la taille : # paires d’électrodes x 2 fentes à broches.
   2. Retirez délicatement les raccords en laiton de chaque port de connecteur (ceux-ci sont pré-fixés au connecteur à 12 broches) avec une pince. Conservez ces raccords pour l’étape suivante.
   3. Soudez chaque extrémité exposée de 1 mm de chaque fil à la surface extérieure de l’une des lames d’un raccord en laiton.
      ATTENTION : La soudure libère des fumées qui peuvent provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Portez des gants (ou lavez-vous les mains par la suite), utilisez des lunettes de protection et utilisez un dispositif d’extraction des fumées locales pour limiter l’exposition.
      1. Fixez le raccord en laiton dans une pince crocodile édentée fixée à un outil à main avec la surface extérieure de l’une de ses lames vers le haut.
      2. Placez le raccord sous le microscope pour permettre un contrôle visuel élevé pendant le soudage. À l’aide d’un trombone déplié ou d’un morceau de fil de ferrail, tamponnez une petite quantité de flux compatible avec l’acier inoxydable sur la surface de la lame.
      3. Appliquez suffisamment de soudure sur la lame pour couvrir les ~1,5 mm inférieurs de la lame en laiton à l’aide d’une pointe de soudure conique étroite.
         REMARQUE : Trop de soudure ici interférera avec l’assemblage du connecteur, tandis que trop peu de soudure pourrait laisser une connexion inadéquate. Ayez des raccords en laiton supplémentaires disponibles pour recommencer si nécessaire.
      4. Enduire généreusement la surface de la soudure sur la lame avec du flux compatible avec l’acier inoxydable, mais évitez que le flux ne s’égoutte dans l’espace entre les deux lames.
      5. Tenez le fil d’électrode exposé de 1 mm au ras de la soudure sur la lame et chauffez la soudure avec le fer pour fusionner la connexion.
      6. Inspectez la connexion : La majorité du fil exposé doit être immergée dans la soudure et le fil doit être fermement fixé au raccord en laiton. Assurez-vous qu’aucune soudure ne s’est retrouvée entre les deux lames du raccord en laiton - cela pourrait rendre difficile l’insertion ultérieure d’un connecteur mâle. Enfin, assurez-vous que la connexion affleure la lame en laiton pour permettre au raccord d’être réinséré dans le connecteur à l’étape suivante.
   4. À l’aide d’une pince droite, réinsérez chaque raccord en laiton soudé dans le connecteur, en vous assurant que les fils de chaque paire d’électrodes sont adjacents les uns aux autres et ne sont pas emmêlés avec d’autres paires d’électrodes. Voir la figure 1B pour visualiser l’orientation d’une seule paire d’électrodes dans le connecteur.
      REMARQUE : L’orientation idéale de gauche à droite est : biceps (3,5 mm à l’extrémité du connecteur), triceps (3,5 mm à l’extrémité du connecteur), extenseur du carpe radial (ECR ; 4,5 mm à l’extrémité du connecteur) et long palmaire (PL ; 4,5 mm à l’extrémité du connecteur). Marquez un côté avec un marqueur ou un voile blanc pour suivre l’orientation du connecteur lors de l’implantation.
   5. Coupez un connecteur mâle à 12 broches de la même taille (# paires d’électrodes x 2) que l’extrémité femelle et connectez-le au connecteur femelle. Si les raccords sont déplacés, ils peuvent être réinsérés à l’aide d’une pince droite une fois le connecteur mâle installé.
   6. Retirez les languettes émanant des raccords en laiton à l’aide d’une pince.
   7. Enduire les fentes des broches d’époxy, en vous assurant que tout le métal ou le fil près du connecteur sera isolé du tissu.
      ATTENTION : L’époxy peut provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires en cas d’exposition prolongée. Portez des gants, des lunettes de protection et n’utilisez de l’époxy que dans un endroit bien ventilé ou sous un dispositif d’extraction des fumées locales.
   8. Laissez le connecteur sécher à l’air libre pendant au moins 30 min.
9. Testez la résistance de chaque paire d’électrodes et étiquetez les aiguilles avec de petits segments colorés de thermorétractable pour une identification facile pendant l’opération.
   REMARQUE : La résistance doit être comprise entre 18 et 50 ohms. Une résistance plus faible peut indiquer une position courte. Une résistance plus élevée peut indiquer que les brins de fil sont trop endommagés. Cependant, une résistance élevée provient souvent d’une connexion imparfaite entre la tige de l’aiguille et le fil (réalisée à l’étape 1.6), qui peut être résolue par un sertissage supplémentaire à cette jonction.
10. Assurez-vous que le jeu d’électrodes est exempt de fibres et d’autres débris avant l’implantation. Un pulvérisateur peut être utilisé pour cela. L’inspection au microscope peut être utile pour vérifier.

2. Chirurgie d’implantation d’électrodes

REMARQUE : Cette section décrit une seule intervention chirurgicale pour implanter une plaque frontale et des électrodes fabriquées dans la section précédente dans les triceps, les biceps, l’extenseur radial du carpe (ECR) et le long palmaire (PL). Pour ces deux derniers muscles, il est très difficile d’implanter l’électrode exclusivement dans ces muscles individuels sans passer par les muscles synergistes voisins. Voir la discussion ci-dessous concernant les mises en garde concernant la tentative d’isoler des enregistrements de muscles individuels. Les plaques de tête sont généralement conçues et fabriquées sur mesure pour des expériences spécifiques. La présente étude a utilisé des plaques de tête RIVETS en plastique imprimées en^{3D 19}. De nombreux modèles de plaques de tête open source sont disponibles en ligne via Janelia, l’Institut Allen et des groupes de recherche indépendants. La procédure de plaque de tête décrite ici a été utilisée avec succès avec des plaques de tête en titane et en plastique. L’intervention chirurgicale doit être réalisée sur un instrument stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) avec un stéréomicroscope allant de 10 à 40x grossissement.

1. Stérilisez à froid les électrodes et la plaque frontale avec du glutaraldéhyde à 1,5 % pendant la nuit ou pendant 8 h. Rincer brièvement à l’eau stérile et laisser sécher complètement à l’air libre avant l’implantation.
   ATTENTION : Le glutaraldéhyde est nocif en cas d’ingestion et peut provoquer une irritation des yeux, de la peau et des voies respiratoires. Poignée avec des gants dans une hotte ventilée.
2. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane à 2-4 % dans de l’oxygène de qualité médicale dans une chambre d’induction jusqu’à la perte du réflexe de redressement (environ 3 min) selon les protocoles approuvés par l’établissement.
3. Transférez l’animal dans le cône nasal mobile pour continuer à recevoir l’anesthésie. Sous anesthésie avec 2 % d’isoflurane dans de l’oxygène de qualité médicale, rasez la tête, le cou et les membres de l’animal avant la chirurgie. Effectuez toutes les étapes restantes de cette section sous anesthésie. Ajustez la dose d’isoflurane au besoin pour maintenir une fréquence respiratoire de 1 Hz et l’absence de réflexe de pincement des orteils.
4. Appliquez du lubrifiant pour les yeux et réappliquez toutes les 1 h tout au long de la chirurgie.
5. Administrer des analgésiques injectables (comme le carprofène, 5 mg/kg) et des antibiotiques par voie sous-cutanée (comme l’enrofloxacine, 10 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) au début de la chirurgie.
6. Implantez la plaque frontale en suivant les étapes suivantes ou une autre méthode approuvée par l’établissement.
   1. Fixez la tête de l’animal dans les barres d’oreille de l’instrument stéréotaxique et administrez une anesthésie (isoflurane à 2 %) par le cône nasal fixé à l’instrument stéréotaxique. Ajoutez un champ stérile pour maintenir l’asepsie.
   2. Nettoyez la tête et le cou avec des tampons de préparation à la povidone iodée et des tampons de préparation à l’alcool stériles.
      Réappliquez du lubrifiant pour les yeux si nécessaire.
   3. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) (voir le tableau des matériaux) par voie sous-cutanée au site d’incision.
   4. Assurez-vous d’une induction anesthésique adéquate en effectuant un pincement des orteils. Si le réflexe de redressement est absent, faites une incision le long de la ligne médiane de la tête de l’animal, du bord caudal des yeux au bord caudal des oreilles.
   5. Clampez la peau à l’aide de pinces à tissu : deux sur le bord rostral de chaque côté juste derrière les yeux et deux sur le bord caudal juste derrière les oreilles.
   6. Nettoyez la surface du crâne en grattant doucement avec une lame de scalpel pour enlever le fascia séché.
   7. Appliquez une fine couche de ciment dentaire (voir Tableau des matériaux) à la surface du crâne et laissez-la sécher pendant 5 min.
   8. Positionnez la plaque frontale sur le crâne de l’animal. La manière et l’endroit où la plaque frontale est implantée varient selon la plaque frontale et la question de recherche.
   9. Utilisez du ciment dentaire pour faire adhérer la plaque de tête au crâne. Assurez-vous que le crâne est entièrement couvert. Laisser sécher le ciment dentaire pendant 10 min.
7. Transférez l’animal dans un cône nasal mobile en plastique pour fournir une anesthésie pour le reste de la chirurgie ; Cela permettra de repositionner l’animal régulièrement pendant la chirurgie pour accéder aux différents muscles tout en maintenant l’anesthésie.
8. Prolongez l’incision à l’arrière du cou (pratiquée lors de l’implantation de la plaque frontale) de manière à ce qu’elle atteigne 1 cm caudal jusqu’aux oreilles.
9. À l’aide d’un grattoir à os émoussé, séparez la peau sous l’incision du cou du tissu sous-jacent pour dégager un chemin de l’incision du cou au membre antérieur, où des électrodes seront implantées.
10. Fixez temporairement le connecteur EMG à la plaque frontale à l’aide d’un petit morceau de ruban adhésif pour le maintenir en place pendant l’implantation de l’électrode.
11. Nettoyez les membres antérieurs de l’animal avec des tampons de préparation à la povidone iodé et des tampons de préparation à l’alcool stériles.
12. Faites l’incision du triceps.
    1. Positionnez l’animal sur le côté, les triceps vers le haut.
    2. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) au site d’incision prévu. Cela soulagera la douleur locale et gardera les muscles humides pendant l’implantation.
       REMARQUE : Les muscles doivent rester humides mais pas dégoulinants tout au long de la chirurgie. Appliquez localement une solution saline stérile au besoin si les muscles ou la peau semblent secs.
    3. Coupez 7 mm sur le triceps parallèlement à l’os.
13. Séparez la peau entourant l’incision du tissu sous-jacent avec le grattoir à os émoussé. Passez le grattoir sous la peau et revenez à l’incision du cou pour dégager un chemin pour les électrodes.
14. Coupez tout fascia qui obscurcit le muscle.
15. Assurez-vous que le chemin du cou au triceps est suffisamment large en insérant des ciseaux fermés à travers l’incision du triceps et en poussant le trou du cou, en s’ouvrant légèrement après la sortie du trou.
16. Amenez l’électrode du triceps à l’incision du triceps : Insérez la pointe du grand tournevis à l’aiguille à travers l’incision du triceps et hors de l’incision du cou. Fixez le tourne-aiguille autour de l’aiguille de l’électrode dans le sens de la longueur et tirez jusqu’à l’incision du triceps.
17. Insertion de triceps : Suivez l’étape 3 « insertion d’électrodes dans les muscles ».
18. Faites l’incision distale du bras.
    1. Positionnez l’animal sur le dos.
    2. Collez le bras le long du côté de l’animal avec sa paume vers le bas.
    3. Injecter de la lidocaïne (4 mg/kg) au site d’incision prévu.
    4. Faites une incision de 1 cm au-dessus du biceps et de l’ECR du bas du deltoïde jusqu’au milieu de l’avant-bras, parallèlement à l’os. L’extrémité distale de l’incision doit être à ~2 mm au-dessus de l’extrémité des muscles de l’avant-bras.
19. Dégagez le fascia pour exposer le muscle biceps.
20. Dégagez un chemin entre l’incision distale du bras et l’incision du triceps au-dessus (proximal de) le gros vaisseau sanguin qui court sous la peau du haut du bras.
21. Enfilez l’électrode du biceps sous la peau à travers l’incision du cou jusqu’à l’incision du triceps, puis de l’incision du triceps à l’incision distale du bras.
22. Insertion du biceps : Suivez l’étape 3 « Insertion d’électrodes dans les muscles ».
    1. Recollez le bras de l’animal dans la même position, mais avec la paume vers le bas.
    2. Insérez le plus près possible de l’extrémité proximale du biceps exposé.
    3. Pour immerger au moins 3 mm de l’électrode dans le tissu musculaire, assurez-vous de l’insérer légèrement en diagonale par rapport aux fibres musculaires en fonction de la taille de la souris.
23. Dégagez un chemin entre l’incision du triceps et le site d’insertion du bras distal en dessous (distal) du gros vaisseau sanguin qui passe sous la peau du bras, créant ainsi un chemin distinct de celui de l’électrode du biceps.
24. Insertion ECR : Suivez l’étape 3 « Insertion d’électrodes dans les muscles ».
    1. Insérer dans la partie la plus proximale de l’ECR.
    2. Sortez dans le pli entre ECR et son antagoniste et faites le nœud dans ce pli.
25. Dégagez un chemin entre l’insertion du triceps et le site d’insertion du PL sous le coude.
26. Insertion PL : Suivre l’étape 3 « insertion d’électrodes dans les muscles ».
    1. Placez l’animal sur le dos et collez son bras sur sa tête avec la paume vers le haut.
    2. Insérez juste distal par rapport au coude.
    3. Sortie suffisamment proximale aux tendons du poignet pour que le nœud au site de sortie repose sur le muscle et non sur les tendons du poignet.
27. Repositionnez l’animal sur le côté et suturez l’incision du triceps à l’aide de sutures en soie 6-0.
28. Repositionnez l’animal sur le dos et suturez l’incision distale du bras à l’aide de sutures en soie 6-0.
29. Fixez le connecteur à l’arrière de la plaque frontale à l’aide de ciment dentaire.
30. Suturez l’incision du cou à l’aide de sutures en soie 6-0.
31. Appliquez une crème antibiotique topique sur les sites d’incision pour réduire l’inflammation.
32. Fixez un collier élisabéthain (voir le tableau des matériaux) sur l’animal pour éviter qu’il ne perturbe les sutures pendant la convalescence.

3. Insertion d’électrodes dans les muscles

1. Courbez légèrement l’aiguille (27 G, étape 1) en la pliant.
   1. Tenez l’aiguille avec le tourne-aiguille (voir le tableau des matériaux) et pressez-la contre la poignée d’une paire de pinces pour ajouter une courbure de 5 à 10 degrés.
   2. Ajoutez trois plis au total à différentes positions sur la longueur de l’aiguille.
2. Visualisez où entrer et sortir du muscle.
3. Enlevez la graisse et le fascia qui obstruent le site d’entrée et de sortie en coupant ou en tirant avec des pinces fines. Essayez d’éviter les lésions vasculaires pour limiter les saignements.
4. Visez 3 à 5 mm de fil immergé parallèle aux fibres musculaires. Cela garantira que les tronçons exposés du fil d’électrode sont immergés dans le muscle.
5. À l’aide du tourne-aiguille, insérez l’aiguille dans l’extrémité proximale du muscle tout en appliquant une contre-pression avec une pince incurvée émoussée dans votre autre main. Poussez l’aiguille à travers le muscle jusqu’au site de sortie.
6. Une fois que l’aiguille sort du muscle, saisissez la pointe avec une pince émoussée et tirez l’aiguille à travers. Continuez à tirer jusqu’à ce que le nœud proximal se trouve au sommet du site d’insertion.
7. Faites le nœud distal.
   1. À l’aide d’une pince, faites un nœud lâche distal au site de sortie. Serrez le nœud jusqu’à ce qu’il forme une boucle de 1 cm.
   2. Poussez la boucle avec une pince et positionnez-la sur le site de sortie.
   3. Visualisez l’endroit où le nœud distal doit être fermé avant d’être complètement serré, à environ 0,5 mm distal du site de sortie. Saisissez doucement la boucle avec la pince fine et pliée à cette position et tirez la boucle sur votre pince.
      REMARQUE : Ne serrez pas le nœud distal immédiatement sur le site de sortie dans cette étape, sinon le muscle sera serré lorsque le nœud est complètement serré à l’étape suivante.
   4. Retirez la pince fine du nœud et terminez de serrer le nœud en poussant le nœud vers le site de sortie avec la pince fine pliée et en tirant l’extrémité de l’aiguille avec les doigts. Assurez-vous que les nœuds proximaux et distaux sont correctement positionnés à l’extérieur des sites d’insertion et de sortie, respectivement, pour ancrer l’électrode insérée en place.
   5. Saisissez le nœud de sortie avec une pince droite et fine et enroulez fermement le fil distal autour de la pince pour plier le fil autour du nœud et vers le muscle/loin de la peau.
   6. Coupez le fil à 0,5 mm distal du nœud distal, en laissant un petit nœud enroulé autour du nœud.
      L’étape précédente permet de s’assurer que l’extrémité coupée du nœud ne pénètre pas dans la peau de l’animal, ce qui peut provoquer une irritation.

4. Soins postopératoires

1. Immédiatement après la chirurgie, effectuez les étapes suivantes.
   1. Abritez l’animal individuellement afin que ses compagnons de cage ne dérangent pas ses sutures.
   2. Placez l’animal dans une cage propre avec une litière basse. Retirez tout matériau de nidification et d’enrichissement qui pourrait interférer avec la mobilité de l’animal lorsqu’il porte le collier élisabéthain.
   3. Donnez à l’animal de l’eau et de la nourriture humide à laquelle il peut accéder pendant qu’il porte le collier.
2. Effectuez les étapes suivantes 24 h et 48 h après l’opération.
   1. Retirez le collier élisabéthain pour permettre à l’animal de se toiletter pendant 20 min.
   2. Induire une anesthésie avec de l’isoflurane, comme mentionné à l’étape 2.2 et à l’étape 2.3.
   3. Administrer des analgésiques et des antibiotiques injectables.
   4. Inspectez les sites d’incision pour détecter des sutures manquantes, des plaies ouvertes et des signes d’infection ou d’irritation. Remplacez les sutures et appliquez plus d’antibiotiques topiques si nécessaire.
   5. Remplacez la nourriture humide toutes les 48 h jusqu’à ce que le collier élisabéthain soit retiré.
3. Effectuez les étapes suivantes 6 jours après l’opération.
   1. Vérifiez que les plaies sont complètement cicatrisées.
   2. Si les plaies sont fermées, retirez les sutures. Si les plaies sont ouvertes, attendez deux jours de plus pour retirer les sutures. Retirez le collier élisabéthain lorsque les sutures sont retirées.
   3. Remettez la souris dans une nouvelle cage propre avec une litière complète et un enrichissement.
      REMARQUE : Les animaux peuvent procéder à l’expérimentation ou à la privation d’eau 7 jours après la chirurgie.

Résultats

Les figures 2, 3 et 4 montrent l’activité musculaire normalisée enregistrée à partir des muscles des membres antérieurs de souris effectuant différents comportements : marcher sur un tapis roulant sans fixation de la tête (Figure 2), grimper sur une roue rotative sous la fixation de la tête (Figure 3) et atteindre des gouttelettes d’eau sous la fixation de la tête (Figure 4). La figure 2 montre 1,5 s de locomotion sur tapis roulant avec un cycle de pas approximatif estimé à partir du temps entre deux activations des fléchisseurs du coude. La figure 3 montre 5 s de données EMG d’un animal dont l’électrode extensrice du poignet a échoué 6 semaines après l’implantation. Dans la figure 3A, les quatre électrodes produisent un signal EMG propre qui s’aligne avec la rotation de la roue (ce qui indique une montée). La figure 3B montre le signal des mêmes électrodes après défaillance : l’électrode extensrice du poignet produit un signal bruyant qui ne change pas avec le mouvement de l’animal. La figure 4 montre 1 s d’EMG des quatre groupes musculaires des membres antérieurs au cours d’une tâche au cours de laquelle la souris est passée de l’immobilité à la recherche d’une goutte d’eau.

Sur les figures 2, 3 et 4, les signaux de tension ont été amplifiés et filtrés (250-20 000 Hz) à l’aide d’un amplificateur différentiel. La tension brute a ensuite été sous-échantillonnée à 1 kHz et notée z pour comparaison entre les ensembles de données. Notons à nouveau que bien que des électrodes aient été implantées dans les quatre muscles spécifiés dans le protocole (biceps, triceps, ECR et PL), il n’est pas garanti que les muscles synergiques adjacents n’aient pas influencé le signal EMG ; Par conséquent, chaque enregistrement est attribué à son groupe de synergie (fléchisseur du coude, etc.) pour plus de précision. La vérification d’enregistrements isolés à partir de muscles uniques nécessiterait des enregistrements simultanés dans plusieurs synergistes pour tester la diaphonie entre les enregistrements musculaires, ce qui peut être extrêmement difficile, en particulier dans l’avant-bras des souris.

Figure 1 : Schéma de fabrication du jeu d’électrodes. (A) Schéma d’une seule paire d’électrodes. Les zones grises indiquent où se déshabiller. (B) Schéma de l’ensemble du connecteur avec une seule paire d’électrodes terminée insérée dans le connecteur. Le schéma en (B) n’est pas à l’échelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Enregistrement EMG représentatif de quatre muscles d’une souris se déplaçant librement (et non la tête fixe) marchant sur un tapis roulant. La durée totale est de 1,5 s. Le cycle de pas a été estimé à partir du temps entre les activations séquentielles des extenseurs du coude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Enregistrement EMG représentatif de quatre muscles d’une souris à tête fixe effectuant un comportement d’escalade naturaliste. La 5^ème rangée montre la position de la roue de montée lue par un encodeur rotatif ; Les changements de cette valeur indiquent que la roue tourne et que l’animal grimpe activement. La durée totale est de 5 s. (A) Enregistrement 36 jours après l’implantation pendant l’escalade. (B) Enregistrement 72 jours après l’implantation chez la même souris après la défaillance de l’électrode de l’extenseur du poignet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Enregistrement EMG représentatif de quatre muscles d’une souris à tête fixe passant de l’immobilité à l’exécution d’un mouvement d’étirement. La durée totale est de 1 s. Cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole permet d’enregistrer de manière stable l’activité musculaire de souris à tête fixe effectuant divers comportements pendant plusieurs semaines. Récemment, cette méthode a été utilisée pour examiner le contrôle neuronal de la musculature des membres lors de comportements tels que la locomotion sur tapis roulant^18,20, une tâche de traction de joystick¹⁸ et une tâche de co-contraction²¹. Bien que le protocole décrit ici soit spécifique aux muscles du coude et du poignet de la souris, il est facilement modifiable pour enregistrer à partir de différents muscles ou d’un nombre différent de muscles en modifiant la longueur et/ou le nombre total de paires d’électrodes. La méthode décrite ici a été adaptée de celles utilisées précédemment pour enregistrer l’activité musculaire des membres antérieurs et postérieurs chez des souris sans appuie-tête 15,16,17.

La fabrication d’électrodes nécessite une pratique importante pour être maîtrisée. Une pratique quotidienne pendant 1 à 2 h est recommandée pendant l’apprentissage. Le dénudage des électrodes est l’étape la plus difficile en raison du niveau précis de force requis pour couper l’isolant sans endommager le fil sous-jacent. Ce niveau de force dépend de la netteté de la lame, de sorte que le remplacement fréquent de la lame du scalpel peut aider à assurer la reproductibilité pendant l’apprentissage. La soudure des fils aux lames en laiton du connecteur peut également être difficile car l’acier inoxydable ne se soude pas facilement. L’application d’une quantité généreuse de flux compatible avec l’acier inoxydable aide à favoriser la connexion.

Le principal défi lors de la chirurgie d’implantation est de faire le nœud distal sans perturber le fil implanté ou le nœud proximal. Le nœud proximal doit être suffisamment grand pour résister à la glisse dans le muscle au site d’insertion - évitez donc de faire le nœud trop serré à l’étape 2 de la fabrication du jeu d’électrodes. Si le nœud proximal migre après l’implantation, utilisez une pince à pointe de fibre de carbone pour le repositionner soigneusement. Serrez lentement le nœud distal tout en maintenant une prise ferme sur le fil avec une pince pour éviter de tirer toute l’électrode à travers. Cette étape est essentielle pour assurer la longévité des électrodes implantées : une tension trop importante placée sur l’électrode peut provoquer sa rupture lorsque l’animal se déplace, tandis qu’une électrode lâche peut se déplacer pendant la récupération et perdre le contact avec son muscle associé à mesure que le tissu guérit.

Les animaux se remettent remarquablement bien de la chirurgie, bien qu’il y ait des complications potentielles à noter. Tout d’abord, les souris mâcheront leurs sutures et leurs électrodes si on leur en donne l’occasion. Bien que le collier élisabéthain empêche cela, il empêche également l’animal de se toiletter. Certaines souris développent une accumulation semblable à celle d’une glaire autour de leurs yeux. De temps en temps, les souris mâles, en particulier les plus âgées, présentent des blocages de l’urètre qui peuvent être pénibles pour l’animal. Laisser l’animal se toiletter pendant 20 minutes chaque jour avant d’inspecter les sutures devrait lui donner suffisamment de temps pour prévenir ces problèmes.

Il y a des limites importantes de cette méthode à noter. Tout d’abord, ces électrodes personnalisées ne peuvent généralement pas résoudre l’activité d’une seule unité motrice. De plus, il n’est pas garanti que le signal électrique émane exclusivement d’un muscle spécifique (c’est-à-dire le biceps), car il est difficile d’exclure la diaphonie de l’activité des muscles synergistes voisins. Par conséquent, dans les publications, les chercheurs se réfèrent couramment aux muscles enregistrés par leur groupe de synergie (c’est-à-dire le fléchisseur du coude). Il est recommandé d’effectuer des dissections post-mortem après chaque expérience pour vérifier la position de chaque électrode, car elles pourraient se déplacer dans le tissu pendant la récupération.

Les chercheurs intéressés par l’activité d’une unité motrice unique devraient envisager d’essayer les électrodes EMG nouvellement développées par le Center for Advanced Motor Bioengineering Research (CAMBER) de l’Université Emory. Ces électrodes sont encore en cours de développement, mais CAMBER fournira la dernière conception d’électrodes. Le principal inconvénient de ces électrodes est la longévité : les électrodes fabriquées à la main décrites dans ce protocole permettent généralement des enregistrements pendant plusieurs semaines, tandis que les électrodes CAMBER fonctionnent mieux pour les expériences à court terme. Les chercheurs qui choisissent une méthode d’enregistrement EMG peuvent contacter directement CAMBER pour déterminer si leurs électrodes conviendront à une expérience donnée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#11 Scalpel Blades	World Precision Instruments	504170	Pour la fabrication d’électrodes EMG
#3 Poignée de scalpel	Fine Science Tools	10003-12	Pour la fabrication d’électrodes EMG
Seringue 1 mL Sub-Q (paquet de 100)  ;	Becton Dickinson	309597	Pour l’administration de médicaments injectables
Connecteur à 12 broches	Newark	33AC2371	Connecteur à 12 broches avec raccords en laiton ; pour la fabrication d’électrodes EMG
18 G Aiguilles	Exel International	26419	Pour la fabrication d’électrodes EMG
27 G Aiguilles  ;	Exel International	26426	Pour la fabrication d’électrodes EMG
3 M Transpore Surgical Tape	3M	1527-0	Pour coller les membres de l’animal pendant la chirurgie
6-0 sutures en soie	Henry Schein	101-2636	Ces sutures fonctionnent bien avec la peau délicate autour des poignets.
C& B Metabond Kit complet	Pearson Dental	P16-0126	Ciment dentaire à fixer le connecteur sur la plaque de tête
C57BL6/J Mice  ;	Jackson Laboratories	#000664	Souris de type sauvage  ;
Pince à épiler Carbofib 5-CF (2)	Outils Aven	18762	Pince à pointe en fibre de carbone, utilisée pour manipuler des pièces délicates d’électrode (sections dénudées ou insérées)  ;
Carprodyl (Carprofène) 50 mg/mL Injection	Ceva Animal Health, LLC	G43010B	Analgésique injectable pour la gestion de la douleur pendant et après l’intervention chirurgicale
Castroviejo Micro Porte-aiguille	Outils scientifiques fins	12060-01	Pour la suture
Porte-aiguille Castroviejo (grand)	Outils scientifiques fins	12565-14	Pour insérer l’aiguille dans le muscle  ;
Grattoir d’os délicat	Outils scientifiques fins	10075-16	Pour séparer la peau des tissus sous-jacents  ;
Dietgel 76A Complément alimentaire	Clear H2O	72-07-5022	Pour les soins postopératoires
Dumont #5/45 Forceps	Outils scientifiques fins	11251-35	Pour enlever le muscle sus-jacent du fascia.
Collier élisabéthain pour souris	Kent Scientific Corporation	EC201V-10	Pour les soins postopératoires
Enrofloxacine 2.27 %	Covetrus	#074743	Antibiotique injectable à utiliser pendant et après la chirurgie
Gel époxy	Devcon	14265	Pour la fabrication d’électrodes EMG
Hopkins Bulldog Clamp (4)	Stoelting	10-000-481	Pinces tissulaires pour plaque de tête
implantation Isoflurane Solution	Covetrus	11695067771	Anesthésie inhalable
Chlorhydrate de lidocaïne injectable - 2 %	Covetrus	#002468	Analgésique topique pour la gestion de la douleur pendant la chirurgie
Oxygène de qualité médicale	Airgas	OX USP200	Pour l’administration d’isoflurane pendant la chirurgie
MetriCide 1 gallon	Metrex	10-1400	Solution de glutaraldéhyde pour la stérilisation à froid de la plaque frontale et des électrodes  ;
MetriTest Strips 1.5 %	Metrex	10-303	Bandelettes de test pour la surveillance de la solution de glutaraldéhyde (recommandé)
Modèle 900LS Small Animal Stereotaxic	Instrument Kopf Instruments  ;	900LS	Stereotax avec fonction lazy susan qui permet la rotation de la plate-forme pendant l’opération  ;
Fil d’acier inoxydable tressé de 0,0055 po revêtu de PFA  ;	Systèmes A-M  ;	793200	Pour la fabrication d’électrodes EMG
Tampons de préparation à la povidone iodée	Dynarex	1108	Pour le nettoyage de la peau  ;
Puralube Pommade vétérinaire  ;	Dechra	37327	Pommade pour les yeux pour la chirurgie  ;
Tampons de préparation à l’alcool stériles	Dynarex	1113	Pour le nettoyage de la peau  ;
Pince droite fine #5	Outils scientifiques fins	11295-10	Pour boucler le fil après insertion  ;
Ciseaux fins droits	Outils scientifiques fins	14060-11	Pour couper le fil  ;
Ciseaux à ressort Vannas d’étudiant	Outils scientifiques fins	91500-09	Pour faire des incisions, couper la graisse et le fascia, et suturer  ;
Technik Pince à épiler 7B-SA (2)	Aven tools	18074USA	Pince émoussée incurvée, pour utilisation générale pendant la chirurgie
Triple Pommade antibiotique	Walgreens	975863	Antibiotique topique pour la chirurgie
V-1 Système d’anesthésie pour animaux de laboratoire de table	VetEquip	901806	Contient tout l’équipement nécessaire pour l’induction et le nettoyage de l’anesthésie, y compris le vaporisateur, la chambre d’induction, le cône de nez mobile en plastique et le tube.