Purification et caractérisation de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain

Résumé

Ce protocole décrit toutes les procédures, de la culture de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) et de la collecte du surnageant à l’extraction de vésicules extracellulaires (VE) par ultracentrifugation.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ADSC) peuvent favoriser la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes. Des recherches récentes suggèrent que leur fonction régénératrice peut être attribuée au contact cellule-cellule et aux effets paracrines cellulaires. L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, dans lesquelles les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle fonctionnel en tant que transporteurs. Il existe un potentiel important pour les VE ADSC en médecine régénérative. De nombreuses études ont fait état de l’efficacité de ces méthodes. Diverses méthodes d’extraction et d’isolement des VE sont actuellement décrites sur la base de principes tels que la centrifugation, la précipitation, la taille moléculaire, l’affinité et la microfluidique. L’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or pour l’isolation des VE. Néanmoins, un protocole méticuleux pour mettre en évidence les précautions lors de l’ultracentrifugation est toujours absent. Cette étude présente la méthodologie et les étapes cruciales impliquées dans la culture ADSC, la collecte de surnageants et l’ultracentrifugation des VE. Cependant, même si l’ultracentrifugation est rentable et ne nécessite aucun traitement supplémentaire, il existe tout de même quelques inconvénients inévitables, tels qu’un faible taux de récupération et une agrégation des VE.

Introduction

La plupart des ADSC sont dérivés du tissu adipeux et il a été démontré qu’ils favorisent la régénération et la reconstruction de divers tissus et organes, y compris le myocarde, les os et la peau¹. Des recherches récentes suggèrent que la fonction régénératrice des ADSC pourrait être due au contact intercellulaire et aux effets paracrines des cellules². L’effet paracrine est un moyen important pour les cellules d’interagir et de transférer des informations sur de courtes distances, et cette fonction est assurée par des vésicules extracellulaires (VE).

Les VE sont des structures membranaires à double couche produites par des cellules, d’un diamètre allant de 40 nm à 160 nm (avec une moyenne d’environ 100 nm). Ils affectent différentes fonctions cellulaires, telles que la production de cytokines, la prolifération cellulaire, l’apoptose et le métabolisme3,4. De nombreuses études ont été menées sur les fonctions des VE ADSC, notamment la promotion de la régénération osseuse, de la régénération du tissu de la muqueuse buccale, de la survie du tissu adipeux après une greffe de tissu et de la réparation des plaies cutanées 5,6,7,8. L’énorme potentiel des ADSC EV en médecine régénérative est évident. Diverses méthodes existent pour extraire et séparer les VE du surnageant, telles que les techniques basées sur la centrifugation, la précipitation, la taille moléculaire, l’affinité et la microfluidique. La méthode d’ultracentrifugation est largement considérée comme l’étalon-or pour l’isolation des VE⁹. Le principe fondamental de l’ultracentrifugation pour la séparation des EV est basé sur le fait que les particules dans l’échantillon ont des coefficients de sédimentation variables, ce qui entraîne leur sédimentation et leur agrégation en couches de séparation distinctes. Néanmoins, un protocole détaillé mettant l’accent sur les précautions lors de l’ultracentrifugation n’a pas encore été établi.

Par conséquent, cette étude décrit objectivement la culture ADSC, la collecte de surnageants et les procédures d’ultracentrifugation des VE, ainsi que les points clés, avec un flux logique d’informations et un langage clair et formel. Il s’agit d’une référence précieuse pour les expériences futures.

Protocole

La figure 1 présente une vue d’ensemble des étapes du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des supports

1. Préparez un milieu de culture pour l’ADSC sans exosomes en utilisant 450 ml de milieu de culture basal, 50 ml de sérum fœtal bovin sans exosomes et 5 ml de trithérapie.

2. Réanimation et culture des ADSC

REMARQUE : Réanimez les ADSC.

1. Allumez au préalable le rayonnement UV de la table ultra-propre et désinfectez-la pendant 30 min.
2. Préchauffez au préalable le milieu dans un bain-marie à 37 °C.
3. Récupérez 2 tubes d’ADSC congelés (P3) à partir d’azote liquide et agitez-les dans un bain-marie à 37 °C à température constante jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
   REMARQUE : L’ouverture du tube de congélation ne doit pas être en contact avec l’eau pour éviter toute contamination.
4. Désinfectez le tube de cryoconservation avec de l’alcool à 75 %, puis déplacez-le sur la table ultra-propre. Aspirez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette et placez-la dans un tube à centrifuger de 15 ml.
5. Placez le tube de centrifugation dans une centrifugeuse à basse vitesse et centrifugez-le à 250 x g pendant 5 min à 4 °C.
6. Préparez quatre plats de culture de 10 cm et mettez 9 ml de milieu dans chaque plat. Marquez le nom, le type de cellule, la génération et la date d’expérience, puis préchauffez-les dans un incubateur thermostatique à 37 °C.
7. Désinfectez le tube à centrifuger et déplacez-le sur la table ultra-propre. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
8. Ajouter 4 mL de milieu et agiter doucement la solution (1 x 10⁵ cellules/mL) jusqu’à ce qu’elle soit uniformément dispersée.
   REMARQUE : Veillez à ne pas éliminer la pastille cellulaire lors de l’extraction du surnageant.
9. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire dans chaque plat. Secouez les plats avec une méthode croisée.
   REMARQUE : Positionnez la plaque sur une surface plane et agitez-la en croix (en la déplaçant vers le haut, le bas, la gauche et la droite) pendant 5-6 répétitions. Évitez les mouvements circulaires, car ils peuvent provoquer une accumulation de cellules au centre.
10. Observez les cellules à un grossissement de 40x avec le microscope optique, puis placez les plats dans l’incubateur.
    REMARQUE : Le but principal de l’observation des cellules est de déterminer si elles sont uniformément réparties, car une distribution inégale affectera la croissance ultérieure.
11. Préparez le milieu d’échange pour les cellules.
    1. Allumez au préalable le rayonnement UV de la table ultra-propre et désinfectez-la pendant 30 min.
    2. Préchauffez au préalable le milieu dans un bain-marie à 37 °C.
    3. Observez l’état cellulaire au microscope optique à un grossissement de 40x. Le niveau de confluence est d’environ 50 %.
       REMARQUE : Le niveau de confluence est calculé comme le rapport entre la surface occupée par les cellules et la surface de la boîte de Pétri après que les cellules adhèrent à la paroi et s’étirent complètement.
    4. Transférez la boîte de culture sur la table ultra-propre (niveau de biosécurité 2) après la désinfection et retirez le milieu.
    5. Rincer doucement chaque plat de culture deux fois avec 2 ml de solution de PBS.
    6. Ajouter 10 ml de produit moyen dans chaque plat. Transférez les plats dans l’incubateur.

3. Collecte du surnageant ADSC et extraction des VE

1. Allumez au préalable le rayonnement UV de la table ultra-propre et désinfectez-la pendant 30 min.
2. Observez l’état cellulaire au microscope. Le niveau de confluence est d’environ 80 %.
3. Transférez le plat sur la table ultra-propre après la désinfection. Prélever soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et le placer dans un tube à centrifuger de 50 ml.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être gelées ou jetées. Si la stérilité n’est pas requise, les étapes suivantes peuvent être effectuées sur la table d’opération. À ce stade, l’expérience peut être mise en pause, puis redémarrée plus tard. Si l’expérience est interrompue, conserver le surnageant dans un réfrigérateur à 4 °C pendant au plus une semaine. Le stockage à long terme n’est pas recommandé car il peut affecter l’activité des VE. L’approche optimale consiste à extraire immédiatement les VE.
4. Centrifugeuse (300 x g, 10 min, à température ambiante) pour éliminer les cellules en suspension. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Ne versez pas. Laissez un peu de surnageant pour éviter que la pastille ne soit aspirée.
5. Centrifuger pour éliminer les débris cellulaires (2000 x g, 10 min, 4 °C), puis continuer à collecter le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Les points clés sont les mêmes qu’à l’étape 3.4.
6. Filtrez le surnageant à l’aide d’une membrane de 0,22 μm pour éliminer les grosses particules et les débris cellulaires.
   REMARQUE : Filtrez le surnageant avec 2 mL de PBS stérile pour humidifier la membrane filtrante avant la filtration.
7. Centrifugeuse dans l’ultracentrifugeuse (10 000 x g, 30 min, 4 °C).
8. Ensuite, centrifuger à 1,00,000 x g pendant 70 min à 4 °C pour retirer la pastille et recueillir le surnageant.
   REMARQUE : Les VE obtenus ont été purifiés par centrifugation plusieurs fois pour augmenter leur pureté. La pastille peut ne pas être visible à l’œil nu. Par conséquent, il est crucial d’actionner la pipette en douceur et de laisser un peu de surnageant au fond pour éviter l’accumulation de granulés.
9. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre le granulé en suspension avec du PBS et centrifuger (1,00,000 x g, 70 min, 4 °C).
   REMARQUE : La pastille peut ne pas être visible à l’œil nu. Par conséquent, lors de l’aspiration du surnageant à l’aide d’une pipette, il est essentiel de retirer doucement et complètement le surnageant pour maximiser la pureté des VE.
10. Retirez le surnageant et obtenez la pastille EVs. Remettez-le en suspension avec 1 mL de PBS, transférez-le dans un tube à centrifuger de 1 mL et conservez-le dans un réfrigérateur à 4 °C pour une détection ultérieure.
    REMARQUE : La pastille peut ne pas être visible à l’œil nu. Par conséquent, lors de l’aspiration du surnageant à l’aide d’une pipette, il est crucial de retirer doucement et soigneusement le surnageant pour maximiser la pureté des VE. Si les échantillons ne sont pas nécessaires pendant une période prolongée, conservez-les dans un réfrigérateur à -80 °C.

Résultats

Tout d’abord, les ADSC ont été caractérisées et identifiées, y compris leur morphologie¹⁰ et leurs anticorps de surface. D’après la figure 2A, il est évident que les ADSC sont disposés en forme de fuseau et forment un vortex après une croissance dense. Les cellules cultivées ont été différenciées en cellules adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques et colorées avec du rouge d’huile O, du rouge d’alizarine et du bleu d’alcian¹¹. L’expérience de différenciation induite et la cytométrie en flux ont confirmé qu’il s’agit bien d’ADSC avec un potentiel de différenciation multidirectionnelle. Cependant, 22 % des cellules sont CD45 positives dans les résultats, ce qui n’affectera pas la conclusion car suffisamment d’anticorps positifs et négatifs la soutiennent (Figure 2A,B).

Ensuite, l’identification des VE extraits est essentielle. Il comprend principalement trois aspects : la morphologie, la taille des particules et les protéines marqueurs. Les résultats de la MET révèlent clairement la structure EV en forme de coupe avec une membrane bicouche¹² (Figure 3A). NTA indique que les VE ont une distribution granulométrique d’environ 50-150 nm, avec une concentration d’environ 1,6 x^{10 10} particules/mL (Figure 3B). L’analyse par Western Blot montre également que les protéines marqueurs des VE, notamment CD9, CD63 et TSG101¹³, sont exprimées de manière régulière (Figure 3C).

Figure 1 : Vue d’ensemble des étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation des ADSC. (A) La morphologie des ADSC est fusiforme. Les ADSC ont été cultivées dans le milieu pour la différenciation adipogénique, ostéogénique et chondrogénique, respectivement. La différenciation adipogénique a été identifiée par coloration au rouge d’huile O. La différenciation ostéogénique et chondrogénique a été confirmée par la coloration au rouge d’alizarine et la coloration au bleu d’alcian, respectivement. Barre d’échelle : 100 μm. (B) Analyse par cytométrie en flux des ADSC pour les marqueurs de surface MSC (CD90, CD105, CD29 et CD73) et les marqueurs spécifiques des cellules hématopoïétiques (CD31, CD34, CD45 et HLA-DR). La stratégie de contrôle : encerclez d’abord le groupe vide. Sur cette base, cerclez successivement CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 et HLA-DR en fonction des anticorps marqués de chaque groupe. Cette figure est adaptée de Han, Y. D. et ^al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation des VE. (A) Les résultats de la TEM révèlent clairement la structure en forme de coupe de la membrane bicouche. Barre d’échelle : 200 nm. (B) NTA indique que les VE ont une distribution granulométrique d’environ 50-150 nm, avec une concentration d’environ 1,6 x^{10 10} particules/mL. (C) Détection des expressions de TSG101, CD9 et CD63 dans les exosomes par Western blot. Cette figure est adaptée de Han, Y. D. et ^al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Au cours du processus expérimental formel, plusieurs points sont cruciaux pour obtenir les meilleurs résultats expérimentaux. Sur la base de notre expérience précédente, il est recommandé d’opter pour les ADSC de passage 3 à 6, car ils assurent le meilleur état cellulaire possible. Avant la P3, les globules rouges, les cellules endothéliales et d’autres cellules diverses n’ont peut-être pas été éliminés. Après P6, les cellules peuvent vieillir progressivement, ce qui peut affecter l’état des VE sécrétés. Deuxièmement, le surnageant doit être collecté lorsque le degré de confluence cellulaire est compris entre 80 % et 90 % pour assurer une sécrétion suffisante d’autant de VE que possible. Pour maintenir la pureté maximale des VE, les chercheurs doivent être prudents lors des trois premières centrifugations et s’assurer qu’aucun résidu liquide ne reste pour éviter l’aspiration d’impuretés et de granulés. Lors des deux dernières centrifugations, assurez-vous que le surnageant est complètement éliminé tout en protégeant la pastille.

L’ultracentrifugation est rentable et ne nécessite aucun traitement supplémentaire. Cette technique a été largement utilisée dans les études sur les VE et a démontré une efficacité satisfaisante dans l’obtention des VE, comme le confirment les expériences de caractérisation. Néanmoins, il y a quelques inconvénients inévitables. Tout d’abord, le taux de récupération des VE est faible. Deuxièmement, les VE ont parfois tendance à s’agréger. De plus, les composants non cellulaires peuvent être isolés, et certains VE peuvent se rompre au cours du processus, entraînant une accumulation de débris 14,15,16. Pour remédier à ces défauts, la plupart des recherches se concentrent sur la purification des VE^12,13. Cependant, ce protocole couvre l’ensemble du processus, de la culture cellulaire à la purification des exosomes, car nous pensons que l’ensemble du processus a un impact sur l’état et la pureté des VE finaux extraits. Il est crucial de respecter les directives susmentionnées pendant le fonctionnement. De plus, la collecte de plus de surnageant et la mise en œuvre de la culture cellulaire 3D peuvent être bénéfiques, car de nombreuses études ont démontré que la culture 3D est plus efficace pour stimuler la sécrétion de VE par rapport à la culture 2D^17,18.

Ce protocole décrit le processus d’extraction des VE des ADSC à l’aide de l’ultracentrifugation. Il fournit des conseils pratiques et permet aux expérimentateurs d’éviter autant que possible les détails pendant l’opération. En résumé, le protocole aide les expérimentateurs à améliorer la qualité des échantillons et rappelle que nous ne devons pas seulement nous concentrer sur les détails de chaque étape, mais aussi considérer l’expérience dans son ensemble.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à aiguilles Acrodisc de la membrane Supor	Acros Organics	4652	0.22 &mu ; m
Milieu basal pour la culture cellulaire	OriCell	BHDM-03011
Sérum de veau fœtal sans EXO + Supplément de culture (pour les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain)	OriCell	HUXMD-05002
Microscope inversé	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Centrifugeuse à basse vitesse	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Ultracentrifugeuse de table	Beckman Coulter	393315
Pénicilline-Streptomycine-Gentamicine Solution (100x)	Solarbio	P1410