Identification microbienne directe à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne pour faciliter la méthode RAST d’EUCAST sans spectrométrie de masse

Summary

EUCAST a développé un protocole de test direct de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour les hémocultures automatisées. Cependant, sa dépendance à l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse peut être évitée en utilisant un protocole de préparation directe de l’inoculum dans un système automatisé d’identification microbienne. Cette approche permet de fournir des rapports AST dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.

Abstract

Le sepsis à Gram négatif (GN) est une urgence médicale où la prise en charge dans des contextes à ressources limitées repose sur des techniques de culture microbiologique conventionnelles qui donnent des résultats en 3 à 4 jours. Reconnaissant ce délai d’exécution (TAT), EUCAST et CLSI ont développé des protocoles pour déterminer les résultats de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture automatisés (+aBC) signalés positivement. Le protocole EUCAST rapid AST (RAST) a été introduit pour la première fois en 2018, où les points de rupture du diamètre de zone pour quatre agents étiologiques courants du septicémie GN, à savoir Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et le complexe Acinetobacter baumannii peuvent être rapportés. Cependant, les laboratoires cliniques qui ont mis en œuvre cette méthode dans leur flux de travail de routine s’appuient sur l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse, qui n’est pas facilement disponible, ce qui empêche sa mise en œuvre dans des contextes aux ressources limitées. Pour contourner ce problème, nous avons évalué un protocole d’inoculum direct (DIP) à l’aide d’un système commercial automatisé d’identification microbienne et de test de sensibilité aux antimicrobiens (aMIAST) pour permettre une identification microbienne précoce dans les 8 heures suivant le signalement positif d’aBC. Nous avons évalué ce protocole de janvier à octobre 2023 afin d’identifier les quatre GN À DÉCLARATION RAST (RR-GN) dans l’aBC signalé positivement. Les résultats de l’identification microbienne dans le DIP ont été comparés au protocole standard de préparation de l’inoculum (SIP) dans l’aMIAST. Sur 204 +aBC avec GN monomorphe (+naBC), l’un des 4 RR-GN a été identifié dans 105 +naBC par SIP (E. coli : 50, K. pneumoniae : 20, P. aeruginosa : 9 et complexe A. baumannii : 26). De ce nombre, 94 % (98/105) ont été correctement identifiés par le DIP, tandis que les taux d’erreurs majeures et d’erreurs très importantes étaient de 6 % (7/105) et de 1,7 % (4/240), respectivement. Lorsque la DIP pour l’identification microbienne est effectuée à l’aide de la méthode EUCAST RAST, des rapports cliniques provisoires peuvent être fournis dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon. Cette approche a le potentiel de réduire considérablement le TAT, ce qui permettra l’instauration précoce d’un traitement antimicrobien approprié.

Introduction

La septicémie, un problème de santé mondial important, est définie comme un dysfonctionnement d’organe potentiellement mortel dû à une réponse déréglée de l’hôte à l’infection. L’étude sur la charge mondiale des maladies a estimé qu’il y avait 48,9 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à la septicémie dans le monde en 2017, ce qui représentait près de 20 % de tous les décès dans le monde¹. Environ 2/^{3 des infections} du sang (BSI) causant la mortalité sont dues à des agents pathogènes bactériens à Gram négatif². Les principales causes de mortalité chez les Gram négatifs (GN) sont Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, qui représentent environ 40 % des cas parmi 33 bactéries pathogènes².

Les hémocultures restent la référence pour diagnostiquer l’ISO, et l’identification microbienne rapide ainsi que les résultats des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) sont la clé de la prise en charge. On a estimé qu’il y a une augmentation de 9 % des risques de mortalité avec un retard d’une heure dans l’instauration d’antimicrobiens appropriés dans le sepsis³. Le délai d’exécution (TAT) des rapports d’hémoculture microbiologiquement positifs avec des résultats AST est d’environ 48 à 72 heures avec les outils microbiologiques disponibles dans les environnements à ressources limitées, même avec des systèmes automatisés. En raison de cette TAT médiocre, des antimicrobiens à large spectre sont utilisés empiriquement, ce qui contribue au problème croissant de la résistance aux antimicrobiens (RAM). Reconnaissant ce besoin urgent de réduire la TAT pour les techniques de culture microbiologique pour le sepsis, EUCAST et CLSI s’orientent vers la réalisation de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture signalés positivement (+aBC)^4,5.

En 2018, EUCAST a introduit pour la première fois la méthode AST rapide (RAST) pour déterminer l’AST par la méthode de diffusion sur disque Kirby-Bauer à des temps d’incubation courts, c’est-à-dire 4 h, 6 h et 8 h, directement à partir de +aBC ^6,7. La méthode est actuellement validée pour déterminer l’AST pour les +aBC contenant l’une des 8 causes les plus courantes de BSI, à savoir E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et le complexe A. baumannii parmi les gram-négatifs et Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium et Streptococcus pneumoniae parmi les gram-positifs⁸. Les points de rupture pour la détermination de l’AST à divers intervalles de temps sont fournis en fonction des espèces microbiennes énumérées ci-dessus. Par conséquent, avant une interprétation catégorique des résultats de l’AST, l’identification microbienne est nécessaire. Cependant, la norme RAST ne spécifie pas la méthode permettant l’identification microbienne dans ce laps de temps.

La majorité des études évaluant la méthode RAST d’EUCAST dans leur contexte ont utilisé l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse après une courte incubation sur des milieux plaqués^pour identifier les micro-organismes 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Cependant, les instruments de spectrométrie de masse ne sont pas largement disponibles, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI), ce qui limite considérablement l’utilité potentielle de cette méthode. Peu d’études ont rapporté la mise en œuvre de cette méthode dans leurs centres sans utiliser la spectrométrie de masse 18,19,20. Tayşi et ^al.18 ont signalé une large catégorisation de la GN parmi les Enterobacterales, les Pseudomonas et les Acinetobacter spp., sur la base de la morphologie de la coloration de Gram et du test d’oxydase avant d’interpréter les résultats de l’AST. Dans d’autres études menées par ce centre, par Gupta et ^al.19 et Siddiqui et ^al.20, l’identification microbienne au niveau de l’espèce a été effectuée en préparant une pastille bactérienne à partir du mélange de sang et de bouillon signalé positivement et en l’inoculant sur les tests biochimiques conventionnels. Bien que Tayşi et ^coll.18 n’aient pas commenté l’exactitude de l’identification microbienne avec leur approche, Gupta et ^coll.19 ont signalé qu’avec leur approche dans 165/176 cas (94 %), un Gram négatif à déclaration obligatoire RAST (RR-GN), c’est-à-dire l’un ou l’autre des E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii complexe. Cependant, avec cette dernière approche, la lecture des résultats RAST a été effectuée rétrospectivement en utilisant des points de rupture de diamètre de zone de 8 h seulement après l’incubation complète des résultats biochimiques conventionnels, c’est-à-dire 18 à 24 heures après l’inoculation, et le délai moyen de déclaration était d’environ 2 jours.

Afin de réduire davantage le TAT des rapports cliniques, nous proposons une méthodologie alternative pour permettre l’identification précoce des GN présents dans les +aBC à l’aide d’aMIAST. Avant l’introduction des systèmes d’identification microbienne basés sur la spectrométrie de masse, ces systèmes d’identification automatisés étaient considérés comme la norme de soins pour l’identification microbienne, où l’identification était rendue possible par des changements colorimétriques et/ou fluorométriques induits par les bactéries d’essai lorsqu’elles étaient inoculées dans des tests biochimiques miniaturisés hébergés dans une cassette et faisant correspondre les résultats avec leur base de données d’isolats. Le temps moyen d’identification dans ces systèmes est d’environ 4 h à 8 h, cependant, ils sont limités par le fait que les fabricants recommandent la croissance nocturne des microbes avant que leurs cartes d’identification respectives puissent être inoculées. Cette exigence limite considérablement leur utilité pour réduire le temps consacré aux rapports.

Peu d’études ont évalué les méthodes permettant d’identifier directement les microbes des +aBC à l’aide de ces systèmes automatisés 21,22,23,24,25,26,27. Dans le cas des +aBC contenant du GN monomorphe, la majorité des études ont montré une excellente concordance entre l’inoculation directe à partir de granules bactériennes fabriquées à partir d’un mélange sanguin-bouillon positif et l’incubation standard en colonie. Cependant, dans le cas des Gram positifs, les taux de concordance étaient sous-optimaux. Comme le temps moyen de positivité des +aBCs est compris entre 8 h et 16 h et que l’identification des GN prend ~4 h à 8 h dans un système d’identification microbienne automatisé, nous émettons l’hypothèse qu’en utilisant un protocole d’inoculation directe dans l’identification microbienne automatisée, nous pouvons compléter le rapport clinique des +aBCs avec GN ayant un RR-GN dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon.

Cadre de l’étude
La présente étude a été menée dans le laboratoire de bactériologie clinique d’un institut universitaire de soins tertiaires d’importance nationale (INI) de 950 lits dans le centre de l’Inde de janvier à octobre 2023. Le laboratoire est équipé d’un système de surveillance continue des hémocultures (CBCMS) et d’aMIAST. Le laboratoire de bactériologie fonctionne 24 heures sur 24 et des techniciens et des microbiologistes sont disponibles pour traiter et signaler tout flacon d’hémoculture signalé positivement (+BCa).

Méthodes microbiennes utilisées ici
Le déroulement de l’étude est illustré à la figure 1. Les +aBC présentant des GN monomorphes (+naBC) ont été traités par inoculation directe des cartes d’identification correspondantes pour permettre l’identification et l’AST à l’aide du protocole EUCAST RAST. Ces résultats ont été comparés à la méthode standard de soins (SoC) pour les +aBC, c’est-à-dire la sous-culture sur des milieux conventionnels à l’aide d’une gélose au sang de mouton (SBA), d’une gélose au chocolat (CA) et d’une gélose MacConkey (MA), incubée en aérobie pendant 16 à 24 h, suivie d’une identification et de cartes AST données par l’aMIAST lorsque des colonies isolées apparaissent. Les hémocultures montrant des cocci à Gram positif, des bacilles à Gram positif, des cellules de levure en herbe et ≥2 micro-organismes différents sur des supports de coloration de Gram initiaux ou en plaques ont été exclues de l’étude.

Protocol

L’étude, financée par la subvention de recherche intra-muros accordée au Dr Ayush Gupta par l’AIIMS Bhopal, a été approuvée par le Comité d’éthique humaine institutionnelle (IHEC) sous la lettre n° : IHEC- LOP/2022/IL072.

REMARQUE : Un volume d’échantillon de 5 ml a été utilisé d’après les études réalisées par Quesada et ^coll.25 et Munoz-Davila et ^coll.27.

1. Protocole d’inoculum standard (SIP) pour l’identification bactérienne à l’aide de l’aMIAST

1. Portez des gants propres et, à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité (ESB) de classe IIa, désinfectez le septum de +naBC à l’aide d’un écouvillon contenant 70 % d’alcool isopropylique.
2. Prélever environ 1 mL du mélange sang-bouillon à l’aide d’une seringue stérile munie d’une aiguille de 21 g.
3. Versez 1 grosse goutte du mélange sang-bouillon de l’aiguille sur la surface du support plaqué, à savoir SBA, CA et MA. Striez les plaques et incubez les plaques de culture dans un incubateur à 37 °C ± 2 °C dans des conditions aérobies pendant 18 à 24 h.
4. Après l’incubation, examiner les plaques pour détecter l’apparition de colonies isolées dans une ESB et poursuivre l’identification et l’AST par aMIAST.
5. Pour chaque isolat, placez un tube en polystyrène aMIAST dans le support de tube aMIAST et ajoutez-y 3 ml de solution saline stérile à l’aide d’un distributeur fixé au flacon de solution saline.
6. Touchez trois à cinq colonies morphologiquement similaires avec un fil d’inoculation droit stérile et transférez l’inoculum bactérien dans le premier tube.
7. Ajustez la turbidité à l’aide d’une solution saline stérile dans le tube inoculé entre 0,47 et 0,63 McFarland à l’aide d’un densitomètre.
8. Placez la fixation capillaire de la carte d’identification aMIAST à Gram négatif dans le premier tube.
9. Placez les cartes sélectionnées dans une position appropriée sur la cassette. L’inoculum dans la cassette est prêt et arrive à l’aMIAST dans la section de remplissage.
   ATTENTION : L’âge de suspension ne doit pas excéder 30 min avant l’inoculation des cartes.
10. Chargez la cassette dans sa position dans la chambre de remplissage avec le code-barres de l’échantillon vers l’intérieur.
11. Fermez la porte et appuyez sur Remplir sur l’écran de l’interface utilisateur. Le remplissage est un cycle de 70 s. Une fois le cycle terminé, le voyant bleu du système clignote. En plaçant les cartes dans le système aMIAST, l’inoculum est distribué dans les petites chambres des cartes par la machine.
12. Retirez la cassette de la chambre de remplissage, fermez la porte et placez-la dans la chambre de chargement. Les codes-barres sont automatiquement scannés et vérifiés par rapport à la liste de travail électronique de la cassette virtuelle. Les pailles sont automatiquement scellées et les cartes sont automatiquement chargées dans le carrousel. La flèche bleue clignotante sur l’aMIAST indique que le chargement est terminé.
13. Retirez les déchets de cassette lorsque vous avez terminé. Voir la procédure d’élimination des déchets dans la documentation du produit ou suivre d’autres pratiques standard. Utiliser le reste de la suspension dans les tubes pour la sous-culture sur la gélose CLED pour le contrôle de la pureté des isolats.
14. Lisez les résultats une fois l’analyse terminée par l’instrument.

2. Protocole d’inoculum direct (DIP) pour l’identification bactérienne à l’aide d’aMIAST

1. Portez des gants stériles et, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, nettoyez le septum de +naBC avec un écouvillon contenant de l’alcool isopropylique à 70 %.
2. À l’aide d’une seringue stérile munie d’une aiguille de 21 g, prélever 5 mL d’aliquote du mélange sang-bouillon de +naBC et les transférer dans un tube séparateur de sérum (TSM) après avoir désinfecté le septum en caoutchouc avec de l’alcool isopropylique à 70 % (figure 2A).
3. Centrifuger cette aliquote pendant 10 min à 160 x g pour fixer les cellules sanguines dans le mélange sang-bouillon. Après la première centrifugation, observez le surnageant dans lequel les cellules sanguines vont se déposer.
4. Ouvrez le capuchon du flacon à l’intérieur d’une armoire de biosécurité et, à l’aide d’une pointe stérile et d’une pipette, retirez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un nouveau flacon de prélèvement de sang ordinaire (en rouge) en retirant son haut.
5. Placez le bouchon sur le flacon et centrifugez-le à nouveau pendant 10 min à 2000 x g. Après la deuxième centrifugation, une pastille bactérienne se formera au fond.
6. Aspirez le surnageant et jetez-le à l’aide d’une pipette stérile et d’une pointe. La pastille bactérienne restera au fond du tube et sera utilisée pour inoculer la carte d’identification aMIAST.
   REMARQUE : Un tube séparateur de sérum a été utilisé lors de la première centrifugation à 160 x g. Cette étude était basée sur des études réalisées par Quesada et ^al.25 et Munoz-Davila et ^al.27_, où la première étape de centrifugation a été effectuée à environ 30 x g et 60 x g, respectivement. Le mélange sang-bouillon d’un +aBC a d’abord été centrifugé à basse vitesse dans un SST pour éliminer les cellules sanguines.
7. Placez un tube en polystyrène aMIAST dans le support de tube aMIAST et ajoutez-y 3 ml de solution saline stérile à l’aide d’un distributeur fixé au flacon de solution saline.
8. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélevez la pastille bactérienne au fond du flacon et inoculez-la dans le tube aMIAST
9. Répétez les étapes 1.7 à 1.14.

3. AST par EUCAST Protocole RAST⁴

1. Conservez des plaques de gélose Mueller-Hinton (MHA) circulaires de 90 mm non inoculées prêtes dans l’enceinte de biosécurité.
2. Portez des gants stériles et, à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, nettoyez le septum de +naBC avec un écouvillon contenant de l’alcool isopropylique à 70 %.
3. À l’aide d’une seringue stérile, aspirer 125 μL ± 25 μL de mélange de bouillon de sang non dilué de +naBC et les ajouter à chaque plaque MHA au centre.
4. Répartissez doucement le bouillon sur les assiettes à l’aide d’un coton-tige stérile dans trois directions et appliquez ≤ 6 disques antimicrobiens sur chaque assiette.
5. Incuber les plaques dans un incubateur aérobie à 35 °C± 1 °C pendant 8 h. Une fois l’incubation terminée, observez la pureté de l’isolat.
6. Lire les zones d’inhibition à 8 h ± 5 min. Interpréter les résultats à l’aide de la table de points de rupture RAST pour une incubation courte après avoir vérifié les résultats de l’identification bactérienne dans l’aMIAST.
7. Ne rapportez les résultats de l’AST que si l’isolat est identifié comme l’un des RR-GN et que les plaques MHA et CLED développent un seul morphotype.

4. Contrôle de la qualité

1. Effectuer un contrôle qualité interne pour le protocole SIP d’aMIAST conformément aux instructions du fabricant en utilisant les souches de référence recommandées.
2. Effectuer un contrôle interne de la qualité de la méthode RAST chaque semaine en utilisant la souche de référence recommandée d’E. coli , comme décrit ci-dessous.
   1. Disposez 4 tubes de verre stériles dans un support de tube. Distribuer 3 ml de solution saline stérile dans le premier tube et 990 μL de solution saline stérile dans chacun des deuxième, troisième et quatrième tubes.
   2. Faire une suspension McFarland de 0,5 de la souche QC à partir des colonies isolées d’une culture d’une nuit sur un milieu plaqué.
   3. À l’aide d’une pipette stérile et d’un embout, transférez 10 μL de suspension du premier tube au deuxième tube.
   4. Après le mélange, transférez 10 μL de suspension du deuxième au troisième tube, puis au dernier tube.
   5. À partir du dernier tube, prélever 1 mL de l’inoculum à l’aide d’une seringue stérile munie d’une aiguille et l’ajouter à un caBC non inoculé.
   6. Ajoutez simultanément 5 ml de sang de mouton stérile dans l’aBC à l’aide d’une seringue stérile avec une aiguille et incubez-le dans le CBCMS jusqu’à ce qu’il soit positif en raison du changement de couleur du capteur d’émulsion liquide à la base de l’aBC.
   7. Répétez les étapes comme expliqué aux étapes 1 à 3 pour l’identification par SIP, DIP et RAST, respectivement. Les résultats attendus sont que la souche de CQ doit être identifiée correctement par les deux protocoles d’identification de l’aMIAST et que les diamètres de zone dans les plaques RAST doivent se situer dans la plage spécifiée^{de 28}.

5. Analyse statistique

1. Considérez l’identification microbienne à l’aide du SIP comme étalon-or et si la même identification est obtenue par DIP, considérez-la comme concordante.
2. Si un RR-GN, c’est-à-dire l’un des complexes E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii identifié à l’aide du SIP, est discordant dans le DIP, considérez cela comme une erreur majeure (EM) tandis que l’inverse est considéré comme une erreur très majeure (VME) car il a le potentiel d’émettre un rapport avec une identification erronée.
3. Calculer le taux de concordance pour RR-GN comme étant le rapport entre le nombre total de RR-GN concordants et le nombre total de RR-GN identifiés par SIP multiplié par 100.
4. Calculer le taux ME comme étant le rapport entre le nombre de +naBC identifiés comme ayant un non-RR-GN et le nombre total de +naBC avec RR-GN identifié par SIP multiplié par 100.
5. Calculer le taux VME comme le rapport entre le nombre de +naBC identifiés à tort comme ayant un RR-GN en DIP et le nombre total de no. de +naBCs testés par DIP multiplié par 100.
6. Calculer le temps nécessaire à l’identification de l’isolat (ITT) comme étant le temps nécessaire à l’identification de l’isolat par les deux protocoles à partir du moment où l’hémoculture est signalée par le CBCMS.
7. Calculez les différences entre le DIP et le SIP en tant que réduction de l’ITT. Calculez cela uniquement pour les +naBC concordants ayant un RR-GN. Notez les points temporels respectifs des horloges de CBCMS et d’aMIAST.
8. Gérez les données et analysez-les à l’aide d’un tableur. Utilisez le test U de Mann-Whitney pour les variables continues, en considérant qu’une valeur p bilatérale de ≤ 0,05 est statistiquement significative.

Results

Résultats généraux
Au cours de la période d’étude, 240 +naBC ont été identifiés par aMIAST à l’aide de DIP et SIP. De ce nombre, 15 % (36/240) des +naBC se sont révélés polymicrobiens après une nuit d’incubation sur le milieu plaqué. Sur les 204 +naBC, la proportion de RR-GN identifiés par SIP était de 51,5 % (105/204). Parmi eux, 47,6 % (50/105) étaient E . coli, 19 % (20/105) K. pneumoniae, 8,6 % (9/105) P. aeruginosa et 24,8 % (26/105) du complexe A. baumannii . Le tableau 1 fournit une description détaillée de tous les résultats d’identification par PFPI.

Précision diagnostique dans l’identification microbienne
Sur 105 RR-GN, 98 (93,3 %) et 99 (94,2 %) concordaient avec le DIP, jusqu’à l’identification au niveau de l’espèce et du genre, respectivement. Les taux de concordance par organisme étaient de 94 % (47/50) pour E. coli, de 90 % (18/20) pour K. pneumoniae, de 100 % (9/9) pour P. aeruginosa et de 92,3 % (24/26) pour le complexe A. baumannii , comme le montre le tableau 1. Dans 7 +naBCs, les résultats étaient discordants jusqu’à l’identification au niveau de l’espèce à l’aide du DIP, dont aMIAST a soit donné un non-identifié (3), soit identifié un non-RR-GN (4), comme le montre le tableau 2. Comme ces résultats n’obligeront pas le microbiologiste clinique à faire rapport, ils ont été considérés comme des erreurs majeures (EM). Le taux d’EM dans notre étude était de 6,7 % (7/105) jusqu’à l’identification au niveau de l’espèce. La proportion de GN-non-RR dans l’aMIAST par SIP était de 48,5 % (99/204). Parmi eux, 60 (60,6 %) étaient concordants par DIP jusqu’à l’identification au niveau de l’espèce. Parmi 99 GN-RR non-RR, un GN-RR a été identifié à l’aide de DIP dans 4 +naBC, comme le montre le tableau 2. Une telle discordance aurait pu conduire à une erreur de déclaration et a été considérée comme une erreur très majeure (VME). Le taux global d’EMV à l’aide du DIP était de 1,7 % (4/240). Le tableau supplémentaire 1 donne une description complète des résultats d’identification et des erreurs de tous les grammages négatifs.

Réduction du temps d’identification de l’isolement (TTI)
L’ITT des +naBC concordants dans le DIP était significativement inférieur à celui de l’ITT dans le SIP (médiane (IQR) : 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p<0,00001 (test de Mann-Whitney)). La différence médiane de TTI entre les deux protocoles était de 1635 min (IQR : 1964-1299).

Figure 1 : Déroulement de l’étude : représentation du déroulement de l’étude pour les flacons d’hémoculture marqués positivement avec des Gram négatifs monomorphes traités par les protocoles d’inoculum standard et direct. Abréviations : +aBC = flacon d’hémoculture avec marquage positif, +naBC = flacon d’hémoculture avec marquage positif avec des grammes négatifs monomorphes, DIP = protocole d’inoculum direct, SIP = protocole d’inoculum standard, SBA = gélose au sang de mouton, CA = gélose au chocolat, MA = gélose MacConkey, RR-GN = Gram négatif à déclaration obligatoire RAST, TAT = délai d’exécution Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Protocole d’inoculum direct pour l’identification bactérienne : montrant des images des flacons pendant la réalisation du protocole d’inoculum direct. Abréviations : +naBC = flacon d’hémoculture avec un drapeau positif avec des grammes négatifs Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Grammes négatifs à déclaration RAST	Isolats testés (n)	Concordant	Erreur d’identification	Pas d’identification
		n (%)	n (%)	n (%)
Total	105	98 (93.3%)	4 (3.8%)	3 (2.8%)
Escherichia coli	50	47 (94%)	1	2
Klebsiella pneumoniae	20	18 (90%)	1	1
Complexe Acinetobacter baumannii	26	24 (92.3%)	2#	0
Pseudomonas aeruginosa	9	9 (100%)	0	0
# Un isolat correctement identifié au niveau du genre, mais pas au niveau de l’espèce (complexe Acinetobacter baumannii identifié comme A. haemolyticus)

Tableau 1 : Résultats de l’identification bactérienne dans le protocole d’inoculum direct. Les résultats ne concernent que les Gram négatifs à déclaration RAST. Abréviations : n = numérateur, % = pourcentage.

Gram-négatifs	Nombre total d’isolats testés	Erreur majeure			Erreur très importante, n (%)
		Nombre	Erreur d’identification	Pas de pièce d’identité	(identifié comme)
		n (%)	n	n
Escherichia coli	50	3 (6%)	1 (A. haemolyticus)	2	0
Klebsiella pneumoniae	20	2 (10%)	1 (Ralstonia pickettii)	1	0
Complexe Acinetobacter baumannii	26	2 (7.7%)	2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)	-	0
Salmonella spp.	10	NA			1 (10%)
					(E. coli)
Complexe Enterobacter cloacae	8	NA			1 (12.5%)
					(E. coli)
Acinetobacter lwoffi	14	NA			1 (7.1%)
					(Complexe A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis	9	NA			1 (11.1%)
					(K. pneumoniae)
Abréviations- n : numérateur, % : pourcentage, ID : identification, NA : sans objet,
A : Acinetobacter, E : Escherichia, K : Klebsiella

Tableau 2 : Détails des erreurs majeures et très importantes par protocole d’inoculum direct. Abréviations : n = numérateur, % = pourcentage, ID = identification, NA = sans objet, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Tableau supplémentaire 1 : Résultats détaillés de l’identification de l’organisme dans les deux protocoles ainsi que résultats des erreurs dans le protocole d’inoculum direct. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

À l’aide du DIP, nous avons réussi à identifier les RR-GN avec une précision diagnostique considérable. L’ITT moyen après l’observation positive d’un cancer du sein aBC n’était que de 507 min (~ 8,5 h). Ainsi, lorsqu’elle est effectuée en conjonction avec la méthode EUCAST RAST pour la détermination de l’AST, elle peut donner l’identification de l’isolat à 8 h de temps de lecture de l’AST. Cette approche a le potentiel de mettre en œuvre la méthode EUCAST RAST, évitant ainsi la nécessité d’une identification basée sur la spectrométrie de masse. Il s’agit d’une aubaine pour les établissements à faibles ressources qui souhaitent mettre en œuvre la méthode EUCAST RAST dans leur flux de travail habituel afin de réduire le temps consacré aux rapports cliniques et de contourner les principaux obstacles à sa mise en œuvre.

Avant l’introduction de la méthode EUCAST RAST, plusieurs auteurs ont évalué la précision des tests directs à partir de +aBC pour divers systèmes aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. Dans ces études, les protocoles de test direct différaient soit en suivant une seule étape de centrifugation^{29, 30, 31, 32}, soit une double étape de centrifugation^{21, 22, 24, 25, 26, 27} pour la fabrication de la pastille bactérienne. Dans la méthode en une seule étape, le mélange de bouillon de sang d’un +aBC a été centrifugé à grande vitesse dans un tube séparateur de sérum (SST) pour granuler les bactéries au-dessus de la couche de gel de silicone. La pastille a été utilisée pour préparer l’inoculum pour l’inoculation des cartes d’identité. Dans la méthode de double centrifugation, le mélange sang-bouillon d’un +aBC a d’abord été centrifugé à basse vitesse dans un SST pour éliminer les cellules sanguines. De ce tube, le surnageant contenant des bactéries a été retiré et transféré dans un nouveau tube et a subi une centrifugation à grande vitesse. De ce tube, le surnageant a été jeté et la pastille a été utilisée pour inoculer les cartes d’identification appropriées. Dans ces études, le taux de concordance variait de 62 % à 100 %, mais en général, la précision était plus élevée avec la méthode de double centrifugation.

Nous avons constaté que la méthode était simple à mettre en œuvre et qu’elle avait été mise en œuvre dans un laboratoire de diagnostic de routine avec une main-d’œuvre de >10 techniciens de laboratoire en rotation, ce qui prouve la robustesse de la méthode. Dans ~94% (98/105) des +naBC contenant l’un des RR-GN, le DIP a correctement identifié le micro-organisme. Le taux de concordance pour les différentes catégories d’organismes était également comparable les uns aux autres, puisqu’ils étaient respectivement de 94 %, 90 %, 100 % et 92,3 % pour E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et le complexe A. baumannii. Nous avons également constaté que le taux de concordance global pour tout Gram négatif était sous-optimal, ~77% (157/204). Cependant, la plupart de ces erreurs d’identification concernaient des Gram négatifs non fermentatifs tels que Acinetobacter spp. autre que le complexe baumannii, Pseudomonas spp. autre que aeruginosa, Moraxella spp. et Sphingomonas paucimobilis qui sont généralement considérés comme des contaminants courants de la peau. D’autres auteurs ont également noté des erreurs d’identification avec des Gram négatifs non fermentatifs ^21,23, ce qui est probablement dû à la faible réactivité de ces bactéries dans les cartes d’identification aMIAST.

Nous avons constaté une réduction significative de l’ITT des bactéries au sein des +naBC à l’aide du DIP. L’ITT médiane de la DIP était environ 4 fois inférieure à l’ITT médiane de la SIP (507 min contre 2171 min) lorsqu’elle était effectuée dans un laboratoire de diagnostic clinique de routine. Cette ITT de ~8,5 h comprenait également l’intervalle entre le signalement positif de l’aBC et la performance de l’inoculation de la carte aMIAST, car le temps moyen d’analyse de l’isolat par l’aMIAST n’était que de 5,45 h ± 1,6 h. Si l’on ajoute le temps moyen de positivité de 728 min ± 301 min (~12 h) pour les +naBC concordants dans notre étude, cette approche d’identification bactérienne a le potentiel de donner un rapport le jour même après avoir reçu l’aBC dans un laboratoire de diagnostic de routine.

Il y a aussi certaines limites, avec le DIP. Tout d’abord, comme il s’agit d’une utilisation non conforme de la préparation d’inoculum, les résultats doivent être considérés comme préliminaires, tout comme les résultats de l’AST par EUCAST RAST. Néanmoins, il sert principalement à identifier en temps opportun uniquement les RR-GN ayant une précision diagnostique considérable. Deuxièmement, il existe une possibilité pratique de gaspillage des ressources d’essai, comme dans environ 60% des +naBC ; nous n’aurions pas été en mesure de faire un rapport en raison d’infections polymicrobiennes ou de l’identification d’un non-RRGN. Ce gaspillage de ressources s’applique à toutes les nouvelles méthodes automatisées d’AST directe pour les hémocultures. Troisièmement, le taux d’infections polymicrobiennes et l’identification des contaminants cutanés courants étaient plus élevés dans cette étude en raison de mauvaises pratiques de collecte d’échantillons. Quatrièmement, nous n’avons pas confirmé l’identité des isolats testés par spectrométrie de masse, qui est l’étalon-or actuel pour l’identification bactérienne.

Cette étude établit avec succès que même avec des tests phénotypiques, il est possible de signaler le jour même des hémocultures positives, en particulier dans les cas de bactériémie à Gram négatif. Cela a le potentiel de réduire considérablement la durée d’initiation d’un traitement antimicrobien approprié dans les PRFI où les diagnostics microbiologiques pour l’identification bactérienne et l’AST reposent fortement sur des tests phénotypiques conventionnels. Cette approche devrait être validée par la réalisation d’une étude multicentrique, et son impact potentiel sur les résultats pour les patients, et en tant qu’outil de gestion des antimicrobiens, devrait être au centre des futurs essais cliniques dans les PRFI.

Pour conclure, le DIP pour aMIAST complète la méthode EUCAST RAST pour permettre l’identification précoce des RR-GN. Il n’est donc pas nécessaire de s’appuyer sur des techniques avancées d’identification microbienne et d’AST, car le temps nécessaire pour produire des rapports avec ces approches est comparable à celui de cette approche. Dans le cas de bactéries à Gram négatif, la déclaration le jour même est réalisable à l’aide de méthodes phénotypiques conventionnelles, à condition qu’elles soient optimisées au maximum. Cela a le potentiel de réduire la durée du traitement antimicrobien à large spectre et de faciliter la gestion des antimicrobiens dans les milieux à ressources limitées.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amikacin 30 & micro ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD035-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque Amoxyclav (20/10 & micro ; g)	Himedia, Mumbai, Inde	SD063-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de céfotaxime 5 µ ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD295E-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Ceftazidime disque 10 µ ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD062A-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de ciprofloxacine (5 µ ; g)	Himedia, Mumbai, Inde	SD060-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de co-trimoxazole (23,75/1,25 & micro ; g)	Himedia, Mumbai, Inde	SD010-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de gentamicine 10 µ ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD016-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque Imipenem 10 µ ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD073-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de lévofloxacine 5 & micro ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD216-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de méropénème 10 µ ; g  ;	Himedia, Mumbai, Inde	SD727-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque pipéracilline-tazobactam (30/6 µ ; g)	Himedia, Mumbai, Inde	SD292E-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
Disque de tobramycine 10 µ ; g	Himedia, Mumbai, Inde	SD044-1VL	Tests de sensibilité aux antimicrobiens  ;
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Souche bactérienne à Gram négatif recommandée pour le contrôle de la qualité dans RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	412CM8423	Système d’hémoculture automatisé en continu
Armoire de biosécurité II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, Inde	DFP-2/21-22/149	Pour la protection contre les agents dangereux et infectieux et pour maintenir le contrôle de la qualité
Base de gélose au sang n° 2	Himedia, Mumbai, Inde	M834-500G	Préparation de la gélose au sang et de la gélose au chocolat
Modèle de centrifugeuse clinique SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, Inde	HLL/2021-22/021	Centrifugation à basse et haute vitesse pour la séparation du surnageant
Dispensette S Distributeur de bouteilles réglable analogiquement  ;	BrandTech, Essex CT, Angleterre	V1200	Distribution précise de
gélose saline MacConkey  ;	Himedia, Mumbai, Inde	M008-500G	Milieux différentiels pour fermenteurs/non-fermenteurs de lactose Bacilles à Gram négatif
Micropipette (100-1000 µ ; L)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, Inde	NJ478162	Transfert du surnageant après la première centrifugation, élimination du surnageant après la deuxième centrifugation
Pointes de micropipette (200-1000 µ ; L)	&lrm ; Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, Inde	521020	Transfert du surnageant après la première centrifugation, élimination du surnageant après la deuxième centrifugation
Gélose Mueller-Hinton  ;	Himedia, Mumbai, Inde	M173-500G	Essai de sensibilité aux antimicrobiens par la méthode Kirby-Bauer de diffusion sur disque
Boucle Nichrome D-4	Himedia, Mumbai, Inde	LA019	Pour le stries sur milieu de culture
Fil droit Nichrome	Himedia, Mumbai, Inde	LA022	Pour l’inoculation par arme de poignard
Nulife Gants stériles MRK	healthcare Pvt Limited, Mumbai, Inde		Pour la sécurité précautions
Flacon ordinaire (flacon avec couvercle rouge), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtention de granulés après deuxième centrifugation
Sang de mouton	Labline Trading Co., Hyderabad, Inde	70014	Préparation de gélose au sang et de gélose au chocolat
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Séparation surnageante lors de la première centrifugation
Coton-tige stérile (avec bâtonnet en bois)	Himedia, Mumbai, Inde	PW005-1X500NO	Culture sur pelouse d’un bouillon d’hémoculture pour test de sensibilité aux antimicrobiens
Seringue hypodermique stérile à usage unique 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, Inde	2213805NB2	Préparation des aliquotes à partir du
kit de référence +aBC VITEK DensiCHEK McFarland	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	422219	Densitomètre pour vérifier la turbidité de la solution
saline VITEK en suspension (0,45 % NaCl)	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	V1204	Réglage de la turbidité McFarland Standard Support de
tube VITEK  ;	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	533306-4 REV	Support pour le bon placement des tubes avant l’inoculation de la carte d’identité
Tubes VITEK	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France		Tubes pour la préparation d’inoculum
VITEK-2 Compact 60	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	VKC15144	Système automatisé d’identification et d’AST
VITEK-2 Carte GN	bioMérieux, Marcy d' Etoille, France	21341	Identification des bacilles à Gram négatif