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Préparation d’échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique

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DOI :

10.3791/66589

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24 mai 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit en détail les étapes de préparation des échantillons rétiniens pour la microscopie électronique volumique, en mettant l’accent sur les caractéristiques structurelles des terminaisons des photorécepteurs rétiniens.

Résumé

La microscopie électronique volumique (Volume EM) est devenue un outil puissant pour visualiser la structure 3D des cellules et des tissus avec une précision nanométrique. À l’intérieur de la rétine, divers types de neurones établissent des connexions synaptiques dans les couches plexiformes internes et externes. Bien que les techniques EM conventionnelles aient permis d’obtenir des informations précieuses sur les organites subcellulaires de la rétine, leur limite réside dans la fourniture de données d’image 2D, ce qui peut entraver la précision des mesures. Par exemple, la quantification de la taille de trois bassins de vésicules synaptiques distincts, cruciale pour la transmission synaptique, est un défi en 2D. Volume EM offre une solution en fournissant des données 3D à grande échelle et à haute résolution. Il convient de noter que la préparation des échantillons est une étape critique du volume EM, car elle a un impact significatif sur la clarté et le contraste de l’image. Dans ce contexte, nous décrivons un protocole de préparation d’échantillons pour la reconstruction 3D des terminaisons axonales des photorécepteurs dans la rétine. Ce protocole comprend trois étapes clés : la dissection et la fixation de la rétine, les processus d’intégration de l’échantillon et la sélection de la zone d’intérêt.

Introduction

La rétine est densément remplie d’axones neuronaux et de dendrites entrelacés qui forment des synapses entre eux1. La microscopie est un outil indispensable pour l’étude de l’anatomie de la rétine car elle possède des structures fines, complexes et petites. Bien que la microscopie électronique (EM) offre une puissance inégalée pour étudier l’ultrastructure des organites subcellulaires et la localisation précise de protéines spécifiques au niveaunanométrique 2, elle produit des images limitées au plan bidimensionnel (2D), entraînant une perte potentielle d’informations clés.

Le développement de nouvelles techniques de microscopie électronique volumique à haute résolution (Volume EM) permet de fournir des informations structurelles tridimensionnelles (3D) plus complètes et à plus grande échelle. Certaines méthodes EM 3D ont été récemment revues par d’autres 3,4,5. L’EM 3D permet de reconstruire la forme neuronale et les détails de connectivité, ce qui permet une analyse quantitative précise des structures d’intérêt. Cela démontre que les données obtenues par l’EM en volume sont plus systématiques, complètes et précises.

Les photorécepteurs rétiniens, constituant les neurones initiaux de la signalisation visuelle 6,7, établissent des synapses avec les dendrites des cellules bipolaires et horizontales de second ordre dans la terminaison du photorécepteur pour faciliter les signaux excitateurs 8,9. Ces terminaisons, appelées pédicules coniques et sphérules de bâtonnets, englobent trois composants cruciaux : les mitochondries, les rubans synaptiques et les vésicules synaptiques. Alors que les études précédentes se sont principalement concentrées sur la structure générale des synapses du ruban, il y a eu une absence notable d’enquête sur la structure fine des principaux composants, y compris les mitochondries, le ruban, les bassins de vésicules, et leur organisation spatiale dans les terminaisons 10,11,12,13 . Une analyse précise et systématique de chaque composant, ainsi qu’une compréhension de leur inter-association au sein des terminaisons photoréceptrices, sont essentielles pour démêler l’organisation spatiale et saisir de manière exhaustive les fonctions de traitement visuel. Dans les photorécepteurs, les mitochondries sont principalement présentes dans le segment interne, le corps cellulaire et la terminale. Nous nous sommes concentrés ici sur les mitochondries dans les photorécepteurs terminaux. La microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM), un type d’EM volumique offrant une résolution élevée (résolution x, y et z < 5 nm) et un flux volumique relativement important 4,14, constitue un outil puissant pour visualiser avec précision la structure 3D des terminaisons photoréceptrices.

Le FIB-SEM et le microscope électronique à balayage en bloc (SBF-SEM) sont tous deux des EM de volume basés sur le MEB pour obtenir l’image des tissus en balayant la surface de l’échantillon. Les caractéristiques ultrastructurales de la surface d’un échantillon sont révélées par le contraste créé par l’intensité des électrons secondaires ou rétrodiffusés (ESB) lorsque le faisceau d’électrons balaie l’échantillon15. Essentiellement, la détection de l’ESB ou d’électrons secondaires à partir de la surface de la section efficace d’un échantillon de tissu enrobé de résine dans le MEB permet d’obtenir des images de l’échantillon enrobé16,17. Lorsque l’ESB ou les électrons secondaires sont moins générés, on ne peut obtenir que des informations à la surface de l’échantillon. Pour obtenir un contraste constant et des images en série de haute qualité, il faut un dépôt suffisant de métaux lourds dans l’échantillon. Par conséquent, des protocoles spécifiques de préparation d’échantillons sont cruciaux pour la segmentation ultérieure, la reconstruction 3D et l’analyse lors de l’utilisation du MEB pour l’imagerie en série. La méthode osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) est un schéma typique de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique 3D d’échantillons biologiques, préservant la structure des membranes contenant des lipides et maintenant un bon contraste18,19.

Ici, nous avons développé la méthode OTO pour la préparation d’échantillons rétiniens pour l’utilisation du Volume EM. Ce processus se concentre particulièrement sur la dissection de la rétine, la détermination du temps de fixation optimal du tissu rétinien et le détail des procédures et précautions spécifiques à la préparation d’échantillons 3D. De plus, la segmentation et la reconstruction 3D de la structure cible font partie intégrante de cette application étendue. La rétine, étant une structure petite et difficile à obtenir des matériaux, nécessite des opérations rapides et précises pour les EM, avec des temps fixes et des réactifs frais préparés pour une utilisation immédiate.

Protocole

Les protocoles de soin et d’utilisation des animaux ont été approuvés par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Wenzhou et ont suivi les directives établies par l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO). Toutes les souris ont été maintenues dans un cycle de 12 heures de lumière et de 12 heures d’obscurité et ont reçu un régime alimentaire standard.

1. Dissection et fixation de la rétine

  1. Anesthésier les souris (C57BL/6J, mâle, 8 semaines, 20-25 g) en injectant du 2,2,2-tribromoéthanol (0,25 mg/g de poids corporel) par voie intrapéritonéale. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de rétraction de la patte arrière après le pincement de l’orteil ou l’absence de réflexe de clignement des yeux. Ensuite, disloquez la vertèbre cervicale alors qu’il est encore sous anesthésie pour euthanasier l’animal.
    REMARQUE : Le tribromoéthanol a été choisi pour son efficacité bien documentée à induire une anesthésie rapide et fiable dans des modèles de petits animaux, en particulier pour les procédures à court terme. Bien que les anesthésiques de qualité pharmaceutique soient préférés, le tribromoéthanol offre des avantages spécifiques dans certains protocoles, ce qui en fait une alternative appropriée lorsqu’il est correctement préparé et administré. Toutes les précautions ont été prises pour assurer son utilisation sûre et efficace. Cette étude respecte les considérations éthiques en assurant une préparation, une administration et une surveillance appropriées afin d’atténuer les risques potentiels associés à son utilisation.
  2. Retirez les yeux avec des ciseaux incurvés et plongez les yeux dans une solution mixte contenant 2% de glutaraldéhyde et 2% de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate (PB, 0,1 M, pH 7,4).
  3. Retirez le segment antérieur et le vitré des yeux à l’aide d’une pince sous le microscope à dissection.
  4. Pelez la sclérotique avec les deux pinces jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée de l’œilleton.
  5. Coupez rapidement la rétine en bandes de 100 à 200 μm d’épaisseur avec un rasoir et manipulez les bandes rétiniennes avec une pipette Pasteur dans un nouveau tube de microcentrifugeuse (EP) contenant 2 % de glutaraldéhyde et 2 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate (PB, 0,1 M, pH 7,4) pendant 2 h à température ambiante (RT) sur le rotateur. Une fois terminé, placez les tubes à fixer à 4 °C pendant 24 h.

2. Processus d’intégration d’échantillons

  1. Après avoir lavé dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) 5 fois pendant 15 min chacune, incubez les bandelettes rétiniennes avec une solution contenant 1,5 % de ferrocyanure de potassium et 1 % d’OsO4 (dans PB, pH 7,4) dans du cacodylate de sodium 0,1 M avec 4 mM de CaCl2 pendant 1,5 h dans l’obscurité sur de la glace.
    REMARQUE : L’incubation sombre et le manque de phosphate peuvent empêcher les précipitations et les artefacts dans l’échantillon.
  2. Lavez les bandelettes rétiniennes 3 fois dans ddH2O pendant 10 min chacune, puis traitez avec 1% de thiocarbohydrazide dans ddH2O pendant 30 min dans l’obscurité à RT.
  3. Après avoir rincé 3 fois dans la ddH2O pendant 15 min chacune, incuber les bandelettes rétiniennes dans 2% d’OsO4 (en PB, PH 7,4) pendant 45 min dans l’obscurité à RT.
  4. Après avoir lavé au ddH2O 3 fois pendant 15 min chacun, plongez les bandelettes rétiniennes dans de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % dans l’obscurité à 4 °C pendant la nuit.
  5. Le lendemain, après un lavage en ddH2O 3 fois pendant 15 min chacun, traitez les bandelettes rétiniennes avec 0,66% de nitrate de plomb dans de l’acide L-aspartique (0,03 M, pH 5,5) pendant 40 min à 65 °C.
  6. Après avoir lavé à la ddH2O 3 fois pendant 15 minutes chacune, déshydratez les bandelettes rétiniennes avec une concentration croissante d’éthanol de 30%, 50%, 70%, 90% et 100% pendant 20 min dans chaque solution.
  7. Traitez les bandelettes rétiniennes avec une solution mixte contenant autant d’éthanol et d’acétone pendant 20 min, suivie d’un lavage à l’acétone 2 fois pendant 20 minutes chacune.
  8. Infiltrer les bandelettes rétiniennes dans de l’acétone/résine mélangée dans un rapport de 7:3 dans l’obscurité à RT pendant la nuit, puis acétone/résine à 3:7 dans l’obscurité pendant 24 h à RT.
    REMARQUE : La composition précise de la résine est la suivante : Epon812 10,06 ml, DDSA 4 ml, MNA 5,94 ml et DMP-30 0,2 ml.
  9. Changez les tubes le lendemain et infiltrez les bandelettes rétiniennes avec de la résine pure pendant 24 h à 45 °C. Changez à nouveau la résine le lendemain et encastrez les bandes rétiniennes pendant 48 h à 60 °C.
    REMARQUE : Le but de l’augmentation de la température est d’améliorer la pénétration.

3. Sélection de la zone d’intérêt

  1. Coupez les blocs de résine en sections de 1 m d’épaisseur, colorez les sections avec 1% de bleu de toluidine et observez la structure générale de la rétine au microscope optique pour sélectionner les régions rugueuses d’intérêt.
  2. Enduire les blocs de résine de platine à l’aide d’une machine à pulvériser, puis fraiser avec une section de 70 nm d’épaisseur à l’aide d’une microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés sous un courant de 0,23 nA et une tension d’accélération de 30 kV.
  3. Pré-criblez la section à l’aide de FIB-SEM avec un grossissement de 2000x pour identifier les régions d’intérêt précises.
  4. Collectez les données à l’aide de FIB-SEM avec un courant de faisceau de 0,69 nA et une tension d’accélération de 2 kV. Les autres paramètres sont les suivants : temps de séjour = 2 μs, taille du voxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Résultats

La figure 1A montre l’image des terminaisons des photorécepteurs rétiniens préparée à l’aide de la méthode traditionnelle de double fixation chimique, et la figure 1B montre l’image des terminaisons des photorécepteurs rétiniens préparée à l’aide de la méthode OTO. Les deux ont été échantillonnés par FIB-SEM. On peut clairement voir que la structure de la membrane cellulaire peut être conservée autant que possible en utilisant la méthode OTO, et même le contour des vésicules peut être clairement vu. De plus, le contraste des images obtenues à l’aide de la méthode OTO est également plus clair.

La figure 2 illustre le flux de travail expérimental utilisé pour reconstruire les caractéristiques ultrastructurales des terminaisons photoréceptrices. La reconstruction s’est concentrée sur quatre types de terminaisons photoréceptrices, notamment les pédicules du cône M, les pédicules du cône S, les sphérules de bâtonnet1 et les sphérules de bâtonnet2. L’accent a été mis sur les composants essentiels, tels que les mitochondries, les rubans synaptiques et les bassins de vésicules synaptiques dans les terminaisons photoréceptrices.

La figure 3 montre les mitochondries reconstruites et les rubans synaptiques dans les terminaisons photoréceptrices des bâtonnets. Notamment, les rubans synaptiques des sphérules de la tige 2 présentent une forme de fer à cheval distinctive, comportant généralement un seul ruban par sphérule. De plus, la figure 2 met en évidence la présence de deux mitochondries dans les sphérules des bâtonnets, avec une position cohérente dans l’espace central des terminaisons, situé au-dessus des rubans synaptiques. Toutes les structures ont été tracées manuellement, page par page.

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Figure 1 : Exemples d’images échantillonnées à l’aide de FIB-SEM pour la méthode traditionnelle de double fixation chimique et la méthode OTO. (A) Méthode traditionnelle de double fixation chimique. (B) Méthode OTO. Barre d’échelle : 1000 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Flux de travail de reconstruction 3D pour les terminaux photorécepteurs à l’aide de FIB-SEM. Après l’alignement à l’aide d’un logiciel de visualisation de données 3D, les images en série ont été segmentées manuellement et rendues pour une analyse plus approfondie. (A) Images originales de série. (B) Images alignées. (C) Images segmentées. (D) Images reconstituées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Reconstruction 3D. Les images représentatives de la reconstruction 3D représentent les terminaisons photoréceptrices en blanc, les mitochondries en orange et les rubans synaptiques en bleu. Barre d’échelle : 500 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous avons mis en œuvre le protocole de préparation d’échantillons Volume EM de l’OTO pour analyser la structure terminale des photorécepteurs dans le tissu rétinien. L’accent a été mis sur les détails de l’ensemble de la procédure, en commençant par le décollement et la fixation de la rétine jusqu’à la présentation des résultats de la reconstruction 3D des terminaisons axonales des photorécepteurs.

La particularité du tissu rétinien, contrairement au tissu cérébral, réside dans son absence de différences régionales. Composée de trois couches de corps cellulaires neuronaux et de deux couches de connexions synaptiques, la rétine présente une structure régulière et hiérarchique malgré la complexité de ses composants neuronaux etsynaptiques20. Lors de la dissection de la rétine, il devient impératif de s’assurer que les fines bandes sont minimisées pour garantir un contraste uniforme dans les étapes ultérieures de préparation de l’échantillon. Les terminaisons axonales des photorécepteurs, structures critiques d’intérêt, sont situées dans la couche plexiforme externe (LPP) de la rétine. La nature hiérarchique et organisée de la rétine permet une localisation efficace des structures cibles, facilitant un échantillonnage précis pendant l’EM et assurant la précision des résultats de reconstruction 3D ultérieurs.

Volume EM facilite la visualisation tridimensionnelle des circuits neuronaux locaux et des connexions synaptiques dans la rétine à l’échelle nanométrique, en utilisant des coupes en série21,22. Cette technique permet la génération automatique d’images 3D haute résolution, et FIB-SEM a le potentiel de dévoiler des détails complexes d’activités physiologiques et pathologiques. Par conséquent, le maintien d’un contraste d’image stable sur l’ensemble du bloc est crucial pendant le processus de préparation des échantillons. Pour obtenir une conductivité uniforme, nous utilisons la méthode OTO de pré-intégration, une approche classique largement reconnue pour son efficacité à améliorer le contraste en microscopie électronique à balayage (MEB)18,23,24. Cette méthode implique un double revêtement d’osmium associé à du thiocarbohydrazide, assurant une conductivité globale optimale pour les grands échantillons. De plus, le double traitement à l’osmium contribue à la préservation supérieure des structures membranaires lipidiques, ajoutant une couche de précision à nos investigations. Les échantillons rétiniens sont hiérarchiques, les blocs de tissu sont petits et faciles à pénétrer, et la méthode OTO peut maintenir un meilleur contour de la membrane cellulaire et un contraste d’image uniforme.

Plusieurs facteurs critiques contribuent au succès de ce protocole. Tout d’abord, une récolte rétinienne rapide et des temps de fixation précis sont primordiaux pour maintenir une structure subcellulaire optimale. Deuxièmement, il est essentiel de s’assurer que les concentrations appropriées d’osmium et de thiocarbohydrazide sont nécessaires pour préserver le contraste dans la structure membranaire des images de la série. L’osmium, en particulier, joue un rôle crucial en se liant aux molécules lipidiques, améliorant ainsi le signal de l’ESB.

Notre protocole de préparation d’échantillons rétiniens est convivial, ne nécessite aucun équipement supplémentaire et minimise le temps de traitement. Cette caractéristique met en évidence son applicabilité potentielle à d’autres techniques de Volume EM, suggérant une polyvalence et une facilité d’adoption dans diverses configurations expérimentales. La méthode de l’OTO améliore considérablement le contraste des images FIB-SEM. Cependant, les détails de la membrane cellulaire, en particulier la structure bicouche, peuvent encore sembler quelque peu flous. Notre système actuel de préparation des échantillons implique un certain sacrifice de petits détails dans la structure cellulaire dans une certaine mesure. Nous visons à développer des méthodes optimisées à l’avenir pour remédier et améliorer cette limitation.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de Chine (2022YFA1105503), du Laboratoire clé d’État de neurosciences (SKLN-202103) et de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (Y21H120019).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,2,2-TribromoéthanolSigma-AldrichT48402
AcétoneMicroscopie électronique Science10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
Moule d’encastrementBeijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon résineMicroscopie électronique Science14900
ÉthanolSigma64-17-5
GlutaraldéhydeMicroscopie électronique Science16020
Helios NanoLab 600i SEM bifaisceauFEI
Acide L-aspartiqueSigma56-84-8
Nitrate de plombSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Composant du tampon phosphate
NaH2PO4. H2OSigma71507Un composant du tampon phosphate
OsO4TED PELLA4008-160501
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Science157-8
Ferrocyanure de potassiumSigma14459-95-1
Cacodylate de sodiumSigma6131-99-3
Coucheuse par pulvérisation cathodiqueLeicaACE200
ThiocarbohydrazideSigma2231-57-4
Acétate d’uranyleTED PELLACA96049

Références

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