Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.
Article de méthode
Modèle d’alvéole sur puce immunocompétent pour l’étude des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous présentons un modèle avancé de poumon sur puce immunocompétent conçu pour reproduire la structure et la fonction alvéolaires humaines. Ce modèle innovant utilise une biopuce perfusée microfluidique qui prend en charge une interface air-liquide imitant l’environnement dans les alvéoles humaines. L’ingénierie tissulaire est utilisée pour intégrer des composants cellulaires clés, notamment des cellules endothéliales, des macrophages et des cellules épithéliales, afin de créer un modèle tissulaire représentatif de l’alvéole. Le modèle facilite l’examen approfondi des réponses immunitaires de la muqueuse à divers agents pathogènes, notamment les virus, les bactéries et les champignons, faisant ainsi progresser notre compréhension de l’immunité pulmonaire. L’objectif principal de ce protocole est de fournir des détails pour établir ce modèle d’alvéole sur puce en tant que plate-forme in vitro robuste pour les études d’infection, permettant aux chercheurs d’observer et d’analyser de près les interactions complexes entre les agents pathogènes et le système immunitaire de l’hôte dans l’environnement pulmonaire. Ceci est réalisé grâce à l’application de techniques basées sur la microfluidique pour simuler les conditions physiologiques clés des alvéoles humaines, y compris le flux sanguin et la stimulation biomécanique des cellules endothéliales, tout en maintenant une interface air-liquide cruciale pour l’exposition réaliste des cellules épithéliales à l’air. Le système de modèle est compatible avec une gamme de tests standardisés, tels que la coloration par immunofluorescence, le profilage des cytokines et l’analyse des unités formant des colonies (UFC)/plaques, ce qui permet d’obtenir des informations complètes sur la dynamique immunitaire pendant l’infection. L’alvéole sur puce est composée de types de cellules essentiels, y compris les cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes stratégiquement positionnés entre les couches épithéliales et endothéliales. Le modèle tissulaire améliore la capacité de disséquer et d’analyser les facteurs nuancés impliqués dans les réponses immunitaires pulmonaires in vitro. En tant qu’outil précieux, il devrait contribuer à l’avancement de la recherche sur les maladies pulmonaires, en fournissant un modèle in vitro plus précis et plus dynamique pour étudier la pathogenèse des infections respiratoires et tester des interventions thérapeutiques potentielles.
Introduction
Le poumon humain joue un rôle remarquable dans la respiration et la défense immunitaire, avec des interactions complexes entre les réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire1. La capacité des alvéoles à créer une réponse immunitaire efficace est essentielle pour prévenir les infections pulmonaires et assurer la santé pulmonaire. Étant donné que les poumons sont constamment exposés à un large éventail de risques potentiels, notamment les bactéries, les virus, les champignons, les allergies et les particules, il est essentiel de comprendre les complexités des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire pour découvrir les mécanismes à l’origine des infections respiratoires, des troubles inflammatoires et du traitement des maladies pulmonaires1.
Pour étudier in vitro les processus liés à l’infection et à l’inflammation des voies respiratoires, il est nécessaire d’utiliser des modèles capables d’imiter fidèlement le milieu alvéolaire et les réponses immunitaires. La culture cellulaire 2D et les modules animaux sont utilisés depuis des décennies comme outils essentiels pour la recherche biomédicale sur la réponse immunitaire pulmonaire. Cependant, ils ont souvent des limites dans leur potentiel de traduction dans des situations humaines. Les modèles de poumons sur puce peuvent contribuer à combler le vide entre les modèles in vitro et in vivo traditionnels et fournir une nouvelle approche pour étudier les réponses immunitaires spécifiques à l’homme 2,3. Les modèles de poumons sur puce peuvent imiter l’interface air-liquide, qui est nécessaire aux cellules pulmonaires pour récapituler les conditions physiologiques des voies respiratoires et développer un modèle tissulaire plus précis et plus robuste. Cette technique de culture permet d’examiner avec précision la différenciation cellulaire, le fonctionnement et les réponses aux médicaments ou aux stimuli liés à la maladie in vitro2.
Dans cette étude, nous présentons un modèle microfluidique de l’alvéole humaine comme outil efficace pour récapituler le milieu alvéolaire humain en appliquant une perfusion pour imiter le flux sanguin et une stimulation biomécanique des cellules endothéliales et en incorporant une interface air-liquide avec des cellules épithéliales exposées vers une phase4 de l’air. Nous avons développé une alvéole microfluidique perfusée sur puce qui imite la structure physique et les interactions biologiques de l’alvéole humaine, en mettant l’accent sur l’interface air-liquide. Cette interface joue un rôle crucial dans la différenciation des cellules épithéliales respiratoires, ce qui est essentiel pour modéliser avec précision l’environnement pulmonaire. Le modèle utilise des cellules épithéliales pulmonaires distales humaines (H441) et des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), séparées par des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate (PET), avec des macrophages primaires dérivés de monocytes positionnés entre les couches cellulaires. Cette configuration reproduit l’arrangement cellulaire complexe de l’alvéole et est essentielle pour simuler avec précision l’interface air-liquide, qui est un facteur important dans la fonction physiologique du tissu pulmonaire.
La raison d’être du développement du modèle s’étend à l’intégration des cellules immunitaires circulantes et tissulaires. Cette approche est conçue pour imiter avec précision la réponse inflammatoire de l’hôte aux infections respiratoires humaines, fournissant un environnement dynamique pour étudier les interactions pathogène-hôte. La présence de macrophages permet d’examiner les réponses immunitaires immédiates et leur interaction avec les agents pathogènes, reflétant la première ligne de défense contre les infections respiratoires. De plus, la conception de la plate-forme de biopuce facilite la manipulation pratique et précise des signaux biophysiques et biochimiques, ce qui est crucial pour reproduire la fonction de l’alvéole in vitro. Cette flexibilité est essentielle pour disséquer les facteurs contribuant aux infections humaines, ce qui permet aux chercheurs d’ajuster les conditions pour refléter divers états pathologiques ou de tester des interventions thérapeutiques potentielles. La compatibilité de la plate-forme avec de multiples technologies de lecture, notamment la microscopie avancée, les analyses microbiologiques et l’analyse des effluents biochimiques, renforce son utilité. Ces capacités permettent une évaluation complète de la réponse tissulaire aux infections, y compris l’évaluation du comportement cellulaire, de la prolifération des agents pathogènes et de l’efficacité des réponses immunitaires.
Nous présentons un protocole et des techniques détaillés pour créer et utiliser un modèle d’alvéole humaine sur puce axé sur la réplication de l’interface air-liquide et l’intégration de cellules immunitaires pour étudier les infections humaines in vitro.
Protocole
Les cellules HUVEC sont isolées des cordons ombilicaux et utilisées jusqu’au passage 4. Les monocytes primaires sont isolés à partir de donneurs sains à partir de sang total. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Iéna, Iéna, Allemagne (3939-12/13). Selon la Déclaration d’Helsinki, toutes les personnes qui ont donné des cellules pour l’étude ont donné leur consentement éclairé.
1. Jour 1 : Préparation de la biopuce
- Les biopuces sont disponibles en différentes tailles et modèles. Pour les expériences ici, utilisez le modèle BC002. Placez la biopuce dans une boîte de Pétri en verre, remplissez la boîte et rincez toutes les cavités avec de l’éthanol stérile à 70 % (EthOH). Incuber pendant 45 min à température ambiante. Ensuite, rincez les cavités 2x avec du ddH2O stérile. Retirez le ddH2O.
- Enduire la membrane de la biopuce des deux cavités avec une solution de collagène IV stérile (0,5 mg/mL dans 0,5 mM d’acide acétique ; utiliser une concentration de 1:100 dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco contenant du magnésium et du calcium PBS (+/+)) en rinçant doucement la solution de collagène IV à travers les deux cavités à l’aide d’une pipette de 1 000 μL avec des pointes bleues. Incuber pendant 15 min à 37 °C et 5% de CO2.
REMARQUE : L’utilisation d’une pipette de 1 000 μL avec des pointes de filtre bleu (P1000) est recommandée tout au long du protocole. Le diamètre de l’ouverture de l’embout du filtre recouvre entièrement l’ouverture des orifices reliant les canaux, ce qui évite l’insertion de bulles d’air dans la puce. - Après 30 minutes d’incubation, rincez les chambres inférieure et supérieure 2 fois avec du PBS stérile (+/+) pour éliminer le collagène et l’acide acétique restants.
- Préparez le milieu EC en ajoutant 1:100 (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL). Remplissez la chambre supérieure de chaque cavité avec 250 μL de fluide EC et la chambre inférieure avec 150 μL de milieu EC.
- Récoltez HUVEC dans une fiole T25 confluente : Laver avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans PBS de magnésium et de calcium (-/-), ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % + 1 mM d’EDTA dans du PBS (-/-) et incuber pendant 3 min à 37 °C. Arrêter l’activité de la trypsine en ajoutant 5 mL de PBS (+/+) + 5 % de FCS et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) dans un tube conique de 50 mL. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu EC.
- Utilisez une dilution en série de 1:10 lors du comptage cellulaire. Ajouter 10 μL de pastille cellulaire remise en suspension à 90 μL de milieu cellulaire. Combinez soigneusement les échantillons. Utilisez un tube de microcentrifugation avec 10 μL de colorant bleu trypan. Diluer la solution cellulaire avec du bleu de trypan (1:1) à l’aide de lames de chambre de comptage de cellules. Comptez les cellules soit manuellement à l’aide d’une chambre Neubauer, soit à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Déterminer le nombre de cellules et ajuster la concentration à 0,4 x 106 cellules par 200 μL.
- Remplacer le milieu de cellules endothéliales dans la chambre supérieure de la biopuce par 200 μL de milieu EC contenant des HUVEC en suspension. Pipeter doucement pour éviter la formation de bulles d’air dans les canaux ou les chambres. Placez la boîte de Pétri en verre avec les biopuces à 37 °C et 5% de CO2.
2. Jour 2 : Vérification de la couche cellulaire
- Le jour 2, vérifiez visuellement la confluence de la couche cellulaire HUVEC dans la chambre supérieure. Effectuez un échange de fluide dans la chambre supérieure avec 300 μL de fluide EC. Pipeter doucement pour éviter le détachement des cellules de la membrane. Effectuez un échange de médias tous les jours après 24h. Remettez la boîte de Pétri en verre avec les biopuces à 37 °C et 5 % de CO2.
3. Jour 3 : Préparation de la chambre basse
- Vérifiez visuellement la confluence de la couche de cellules endothéliales. À ce stade, déterminez la présence d’une couche confluente et d’une morphologie semblable à celle des galets (Figure 1). Effectuez un échange de fluide dans la chambre supérieure avec 300 μL de fluide EC.
- Ensuite, préparez la chambre inférieure pour l’ensemencement des cellules formant la couche épithéliale. Rincer doucement la chambre inférieure avec 150 μL de milieu RPMI (ajouter 1:100 (v/v) de pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL), 5 % de sérum de vache fœtale, 1 μM de dexaméthasone).
- Pour la chambre inférieure, ensemencer 0,5 x 106 cellules H441 en suspension dans 200 μL de milieu RPMI (RPMI) par cavité.
- Récolte des cellules H441
- Lavez les cellules avec 5 mL de PBS (-/-) une fois. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,25 % + 1 mM d’EDTA dans du PBS (-/-).
- Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C et 5% de CO2. Le temps d’incubation varie en fonction de la confluence de la pondeuse. En 5 à 7 minutes, les cellules devraient se détacher complètement.
- Arrêtez l’activité de la trypsine avec 10 mL de PBS (+/+) + 5 % de FBS, collectez les cellules et centrifugez à 200 x g pendant 4 min.
- Après la centrifugation, jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de RPMI et compter.
- Ensemencez 0,5 x 106 cellules par chambre en pipetant doucement la solution cellulaire dans la chambre inférieure. Fermez tous les ports et retournez la biopuce pour que les cellules puissent se fixer à la membrane PET. Gardez la biopuce à l’envers et incubez toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2.
4. Jours 4 - Jour 7 : Entretien des cellules et récolte des monocytes
- Effectuez quotidiennement l’échange de fluide dans les chambres supérieure et inférieure. Pour la chambre supérieure, effectuez l’échange de fluide avec 300 μL de fluide EC.
- Utilisez 200 μL de RPMI+ (milieu RPMI plus 1:100 (v/v) pénicilline/streptomycine (10 000 U/mL), 10 ng/mL DE GM-CSF, 10 % de sérum humain autologue, 1 μM de dexaméthasone) pour la chambre inférieure. Le jour 7, rincez la chambre inférieure avec du RPMI+ pour préparer la cavité pour l’ensemencement des monocytes.
- Graine 0,1 x 106 monocytes en suspension dans 200 μL RPMI+ dans la chambre inférieure.
- Récolte des monocytes
- Laver les cellules avec 1 mL de PBS (-/-) et incuber pendant 7 min à 37 °C dans du PBS préchauffé (-/-) contenant 4 mg/mL de lidocaïne + 5 mM d’EDTA à 37 °C et 5 % de CO2.
- Récupérez les cellules et centrifugez-les à 350 x g pendant 7 min, remettez-les en suspension dans 1 ml de RPMI+ et comptez. Placez les ports de la biopuce vers le bas pour que les cellules se fixent à la membrane.
5. Jour 8 : Perfusion de biopuce
- À ce stade, assurez-vous que les biopuces sont prêtes à être connectées au flux et perfusées. Avant de commencer la perfusion, préparez un incubateur vide et placez la pompe péristaltique à l’intérieur.
- Perfusion des biopuces
- Avant de fixer la tubulure stérilisée à la biopuce, rincez la tubulure avec 200 μL de PBS (+/+), suivie de 200 μL de milieu EC. Le tube a un diamètre intérieur de 0,5 mm, composé de côtés plus longs (20 cm) et plus courts (12 cm) divisés par deux bouchons de pompe péristaltiques. Mettez le tube de côté et préparez les réservoirs pour le fluide.
- Effectuez le remplacement du milieu dans les chambres supérieure et inférieure en les rinçant avec le milieu de culture cellulaire fraîchement préparé correspondant.
- Insérez le réservoir du côté de la sortie de la biopuce et connectez le réservoir avec la tubulure à l’entrée de la biopuce (Figure 2). Connectez le tube au réservoir et à la biopuce de manière à ce qu’il y ait une perfusion circulaire entre le réservoir et la biopuce.
- Une fois que tout est connecté aux ports, remplissez le réservoir avec 500 μL de fluide EC. Connectez la biopuce à la tubulure sur une perfusion avec un débit de 21 μL/min (Figure 2). Observez attentivement pendant les 15 premières minutes de perfusion l’insertion des bulles. Effectuez quotidiennement un échange de fluide dans les deux chambres.
6. Jour 9 - Jour 11 : Établissement d’une interface air-liquide
- Arrêtez la perfusion, videz les réservoirs et remplissez-les de milieu fraîchement préparé sous une enceinte de sécurité stérile. Pipetez 500 μL de fluide EC dans les réservoirs et rincez doucement la chambre inférieure avec 200 μL de RPMI+. Recommencer la perfusion avec un débit de perfusion de 21 μL/min.
- Interface air-liquide (ALI)
- Établissez l’ALI du 12e jour jusqu’à la fin de l’expérience (14e jour). Pendant la culture ALI, exposez les cellules épithéliales à l’air.
- Pour établir la culture ALI, préparez un nouveau milieu vasculaire EC (ajouter 1:100 (v/v) Pénicilline/Streptomycine (10 000 U/mL), 10 ng/ml de GM-CSF, 20 % de sérum humain autologue, 1 μM de dexaméthasone) pour maintenir tous les types de cellules dans la puce. À ce stade, le milieu contient une concentration plus élevée de SA (20%).
- Ouvrez les bouchons de la chambre inférieure sous une enceinte de sécurité stérile et imprégnez-le soigneusement jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit visible, comme le montre la figure 3. Assurez-vous que tout le liquide du canal et de la chambre est retiré et fermez soigneusement les orifices.
- Remplissez les réservoirs avec un milieu EC (-/-) et poursuivez la culture par perfusion avec un débit de 21 μL/min. Changez le milieu uniquement au niveau de la chambre supérieure jusqu’au 14e jour et conservez les cellules épithéliales dans la chambre inférieure avec de l’air uniquement.
7. Jour 14 : Prélèvement et analyse des tissus
- Déconnectez la biopuce du flux. Branchez la tubulure et vérifiez au microscope la confluence cellulaire. En raison de l’air dans la chambre inférieure, les couches cellulaires peuvent sembler floues et difficiles à visualiser. À ce stade, le modèle est prêt pour d’autres expérimentations.
- Fixation et coloration de tissus dans une biopuce
- Lavez les cavités avec du PBS (+/+) pour retirer le milieu de culture cellulaire. Pipeter 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dissous dans du PBS (-/-) dans la chambre supérieure et 200 μL dans la chambre inférieure et incuber pendant 10 min à RT.
REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des produits chimiques de fixation tels que le PFA, utilisez une hotte. Collectez et éliminez les déchets en conséquence. - Lavez les chambres 3 fois avec du PBS (+/+). Après la fixation, stockez les biopuces à 4 °C ou utilisez-les directement pour la coloration par immunofluorescence des cellules.
- Pour la perméabilisation, pipette 300 μL de Triton X-100 à 0,25 % dans du PBS (+/+). Incuber pendant 30 min à RT.
- Après l’incubation, laver les deux chambres avec du PBS (+/+) et pipeter 300 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans du PBS (+/+) dans les deux chambres. Incuber pendant 1 h à RT.
- Pendant ce temps, préparez le panel d’anticorps pour la coloration par immunofluorescence. Pour préparer le panel d’anticorps à la coloration par immunofluorescence, un tube contenant une quantité suffisante de BSA à 3 % a été mis en place pour diluer les anticorps. Utilisez 50 μL de dilutions d’anticorps pour chaque membrane. Utilisez un rapport de dilution de 1:100 pour les panels d’anticorps primaires et de 1:200 pour les panels d’anticorps secondaires. De plus, pour le panel d’anticorps secondaires, préparez le DAPI à un rapport de dilution de 1:2 000. Pour les anticorps correspondants, voir (Tableau 1).
- Pour accéder directement aux cellules de la biopuce, la feuille de liaison doit être retirée. Pour ouvrir les chambres microfluidiques, faites une coupe précise à l’extérieur de la cavité et retirez la feuille de liaison. Découpez la membrane en retirant les bords scellés à la biopuce avec le scalpel.
REMARQUE : Travaillez avec précision et précision au cours de cette étape pour éviter tout dommage à la membrane et les blessures dues à la netteté du scalpel. - Après avoir détaché la membrane de la biopuce, divisez la membrane en deux morceaux. Prélevez les morceaux de membrane à l’aide d’une pince à épiler et placez-les sur une lame microscopique pour les colorer.
- Pipette de 50 μL de solution d’anticorps par morceau de membrane. Incuber une nuit à 4 °C, à l’abri de la lumière.
- Après l’incubation, placez la membrane dans 500 μL de PBS (-/-) dans une plaque à 24 puits et lavez la membrane 3x pendant 5 min chacune dans du PBS (+/+). Après le lavage, pipeter 50 μL de solution secondaire d’anticorps et incuber pendant 1 h à RT à l’abri de la lumière.
- Lavez la membrane avec du PBS (+/+) 3 fois pendant 5 min chacune. Pendant ce temps, préparez et étiquetez les lames microscopiques pour l’expérience. Placez une goutte de support de montage sur la glissière et placez la membrane correspondante. Répétez cette étape pour toutes les membranes. À la fin, placez une goutte supplémentaire du support de montage sur le dessus de la membrane et utilisez un verre de protection. Conserver à 4 °C.
- Lavez les cavités avec du PBS (+/+) pour retirer le milieu de culture cellulaire. Pipeter 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dissous dans du PBS (-/-) dans la chambre supérieure et 200 μL dans la chambre inférieure et incuber pendant 10 min à RT.
Résultats
Un examen des altérations morphologiques et de l’expression des protéines marqueurs pourrait être effectué à l’aide de la coloration par immunofluorescence. Après une co-culture de 14 jours, les côtés vasculaire et épithélial sont analysés pour l’expression des marqueurs cellulaires respectifs. Cette méthode est utile pour étudier les interactions et l’intégrité des composants vasculaires et épithéliaux, ce qui est essentiel pour la modélisation de la maladie en tant que lecture biologique fonctionnelle liée à l’infection. La coloration par immunofluorescence pourrait être étayée par une analyse quantitative, une évaluation morphologique et des tests fonctionnels, y compris la libération de cytokines, l’analyse de l’effluent de marqueurs de mort cellulaire tels que la libération de LDH et la modification de la morphométrie des cellules5. Du côté vasculaire, l’intégrité et la morphologie des protéines de jonction des cellules endothéliales, telles que la VE-cadhérine, peuvent être étudiées pour évaluer la confluence et la formation de la barrière endothéliale6 (Figure 4A). Après la perfusion, la couche de cellules endothéliales doit confluent avec une expression clairement structurée de VE-cadhérine aux frontières des cellules endothéliales. La partie inférieure de la membrane peut être immunomarquée pour les marqueurs épithéliaux tels que la E-cadhérine et la protéine de tensioactif A (SP-A)7. L’expression de SP-A, un composant clé du tensioactif pulmonaire et un mélange complexe de lipides et de protéines, réduit la tension superficielle à l’interface épithéliale air-liquide et empêche ainsi in vivo l’affaissement des alvéoles pendant l’expiration et le maintien d’une fonction pulmonaire correcte et des échanges gazeux 6,8. Dans notre modèle, les cellules épithéliales expriment SP-A après le traitement ALI et peuvent être visualisées par coloration par immunofluorescence (Figure 4B). La confluence et l’intégrité de la couche cellulaire épithéliale peuvent être confirmées par une coloration par immunofluorescence pour la E-cadhérine, un marqueur jonctionnel épithélial important des cellules épithéliales alvéliales (Figure 4C). La présence de macrophages peut être confirmée par coloration par immunofluorescence pour la protéine CD686 (Figure 4C). Pour étudier les infections virales, bactériennes ou fongiques, veuillez trouver des détails sur les modèles d’infection fournis dans Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 et Hoang et al.9.
Figure 1 : Image représentative d’une couche confluente de HUVECs dans la biopuce au jour 3. L’image montre une microscopie à fond clair avec un grossissement de 10x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration pour l’induction de l’alvéole sur puce et de l’ALI. (A) Image représentative de la configuration de perfusion pour le modèle d’alvéole sur puce et (B) Image représentative de l’induction d’une ALI dans la chambre en absorbant le milieu et en introduisant de l’air dans les cellules. La formation d’une bulle d’air à l’intérieur de la chambre indique que les cellules sont exposées à l’air. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Vue d’ensemble schématique de l’alvéole sur puce. Un protocole détaillé pour 14 jours de culture indique les étapes importantes pour l’ensemencement et la croissance des cellules au sein de la biopuce. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration par immunofluorescence des couches de cellules endothéliales et épithéliales. (A) Cellules endothéliales HUVEC exprimant l’expression de VE-cadhérine (orange), (B-C) H441 exprimant (B) SP-A (rouge) et (C) E-cadhérine (orange), SP-A (rouge) et CD68 (vert) du côté épithélial. DAPI (bleu) colore l’ADN et indique les noyaux cellulaires. La barre d’échelle représente 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Cavité | Cellules |
| Cavité supérieure | Endothélial (0,4 x 106) |
| Cavité inférieure | Épithélial (0,5x106H441+ 1x105 monocytes) |
Tableau 1 : Vue d’ensemble de l’ensemencement cellulaire dans la biopuce.
Discussion
Le modèle d’alvéole sur puce représente un modèle tissulaire multicouche de l’alvéole humaine, intégrant les types de cellules essentielles des voies respiratoires inférieures, y compris les cellules épithéliales pulmonaires, les cellules endothéliales et les macrophages, cultivés dans un arrangement organotypique à un ALI avec une perfusion moyenne de la muqueuse endothéliale. Les cellules de différentes couches expriment des protéines marqueurs cellulaires spécifiques telles que la E-cadhérine, une molécule d’adhésion dépendante du calcium des cellules épithéliales pulmonaires, qui est essentielle dans l’établissement des barrières épithéliales intercellulaires 5,10. L’E-cadhérine forme un élément de barrière physique et contrôle la réponse immunologique aux agents pathogènes et aux substances nocifs dans l’environnement10,11. Les cellules épithéliales H441 expriment en outre la protéine A, qui est également cruciale dans la première ligne de défense de l’hôte contre l’infection en médiant l’activité immunomodulatrice et antibactérienne8. L’intégration de cellules immunitaires dans le modèle d’alvéole augmente sa complexité cellulaire, reproduisant ainsi mieux la réponse immunitaire aux déclencheurs inflammatoires, c’est-à-dire pendant l’infection. Dans ce contexte, le modèle a été utilisé pour étudier la co-infection du virus grippal A et de l’agent pathogène opportuniste humain Staphylococcus aureus (S. aureus)5. Dans l’étude, un mécanisme de co-infection dans la pneumonie a été révélé dans lequel l’infection virale des cellules épithéliales déclenche une réponse inflammatoire importante, qui cause des dommages considérables aux cellules endothéliales, entraînant une perte de la fonction barrière. Dans une autre étude, le modèle a été utilisé pour démontrer que l’infection à S. aureus réduit les niveaux extracellulaires de la protéine surfactante-A (SP-A), un composant crucial de la défense immunitaire dans les poumons, probablement en raison des protéases bactériennes6. Bien que l’expression de SP-A ne soit pas directement affectée par S. aureus ou le virus de la grippe A, elle est significativement régulée à la baisse par le TNF-α, une cytokine fortement produite en réponse aux infections bactériennes, en particulier en présence de macrophages. Ces résultats suggèrent que les mono- et super-infections bactériennes peuvent abaisser les niveaux de SP-A dans les poumons, ce qui pourrait aggraver l’issue de la pneumonie bactérienne6. De plus, le modèle d’alvéole a été utilisé pour étudier l’infection fongique de l’alvéole par Aspergillus fumigatus et l’efficacité des médicaments antifongiques en exploitant la microscopie à haute résolution et l’analyse d’images basée sur des algorithmes en combinaison avec des tests de biologie moléculaire, y compris la coloration par immunofluorescence et le profilage des cytokines7. La modélisation de l’aspergillose pulmonaire invasive dans l’alvéole sur puce a révélé des fonctions clés des macrophages humains qui pourraient inhiber partiellement la croissance du champignon. Les macrophages ont joué un rôle central dans la libération de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, ce qui est corrélé à un nombre accru d’hyphes fongiques invasifs. De plus, l’étude a confirmé que le médicament fongistatique caspofungine limite efficacement la croissance fongique et induit des changements morphologiques dans la structure fongique, s’alignant sur les résultats d’autres études. Ces études confirment le potentiel de la plate-forme modèle pour identifier les cibles cellulaires de l’infection et tester des médicaments à des concentrations cliniquement pertinentes.
Plusieurs aspects doivent être pris en compte lors de la mise en place de l’alvéole sur puce. Un ensemencement cellulaire précis est essentiel pour obtenir une distribution cellulaire uniforme et la formation de couches. Assurez-vous que les cellules sont ensemencées à la densité appropriée pour obtenir une confluence sans se propager les unes les autres, ce qui pourrait compromettre l’intégrité et la fonctionnalité des couches cellulaires. Pendant le processus d’établissement de l’ALI, retirez soigneusement le milieu du côté apical et fermez les orifices pour éviter toute contamination. Le maintien de conditions optimales de co-culture, telles que la température, les niveaux de CO2 et la composition du milieu, est essentiel pour la survie et l’interaction des cellules endothéliales et épithéliales. Effectuez toujours les changements de milieu avec précaution pour éviter de perturber les couches cellulaires ou d’introduire des bulles d’air. Pipetez doucement et assurez-vous que tout le matériel utilisé est stérile pour minimiser le risque de contamination. Pour éviter les bulles d’air, pipetez lentement et inclinez la puce lors des changements de milieu pour permettre aux bulles de s’échapper. Travaillez dans un environnement propre, stérile et contrôlé pour minimiser la contamination. Tenez compte de la complexité et de la précision requises pour établir et maintenir le modèle 3D pour les expériences ultérieures avec le modèle. Si les couches cellulaires ne se forment pas correctement, envisagez d’optimiser la densité cellulaire et les lots de cellules, car des différences de croissance cellulaire peuvent se produire en fonction du donneur et du lot.
Bien que le modèle offre des améliorations significatives par rapport aux méthodes existantes, il est également essentiel de reconnaître que certaines limites doivent être prises en compte. L’une de ces limitations est la complexité et le coût associés au fonctionnement du dispositif microfluidique. L’utilisation de modèles d’organe sur puce nécessite un équipement spécialisé et une expertise en microfluidique pour adopter le modèle d’alvéole sur puce. De plus, bien que ce modèle puisse reproduire avec succès de nombreuses caractéristiques clés de l’environnement alvéolaire, il ne peut pas reproduire entièrement toutes les interactions cellulaires et les forces mécaniques trouvées in vivo. Par exemple, le modèle ne dispose pas d’un système immunitaire complet ou de la gamme complète des types de cellules du poumon humain, ce qui pourrait avoir un impact sur la précision des études d’interaction pathogène-hôte.
Malgré ces limitations, le modèle de poumon sur puce offre des avancées par rapport aux cultures cellulaires 2D traditionnelles telles que les systèmes Transwell. En incorporant une interface air-liquide, des cellules endothéliales et épithéliales et des composants immunitaires dans un tissu multicouche au sein d’un environnement dynamique et perfusé, le modèle représente une approche plus pertinente sur le plan physiologique pour étudier la physiologie pulmonaire, les maladies et les réponses au traitement in vitro. Ceci est crucial pour faire progresser notre compréhension des infections respiratoires humaines et développer des thérapies plus efficaces. La capacité du modèle à manipuler avec précision les signaux biophysiques et biochimiques représente une caractéristique importante pour disséquer les mécanismes de progression de la maladie et d’action des médicaments. L’utilisation de matériel cellulaire humain peut réduire davantage les différences interespèces observées dans les expériences sur les animaux. L’intégration de plusieurs analyses de biomarqueurs améliore encore la profondeur et l’étendue des données pouvant être obtenues à partir d’une seule expérience, ce qui contribue à réduire les coûts de l’expérimentation in vitro. Tout en reconnaissant ses limites, le modèle de poumon sur puce représente une avancée significative dans la recherche sur les maladies respiratoires, offrant une alternative plus précise, éthique et efficace aux méthodes traditionnelles.
Déclarations de divulgation
K.R. est PDG de Dynamic42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. A.S.M. est conseiller scientifique de Dynamic 42 GmbH et détient des actions de l’entreprise. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
H.K. et A.S.M. reconnaissent le financement du Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financé par la ligne de financement Strategic Networking de l’Association Leibniz. M.A. et A.S.M. ont été soutenus par le projet IGF IMPROVE financé par le ministère fédéral de l’Économie et de l’Énergie sur la base d’une résolution du Bundestag allemand. A.S.M remercie en outre le soutien financier du Cluster of Excellence Balance of the Microverse dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Consommables | |||
| Lames de chambre de comptage cellulaire (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Plaques multipuits pour culture cellulaire, 24 puits, stérile | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Plaques multipuits pour culture cellulaire, 6 puits, stérile | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Lamles (24x40mm ; #1.5) | Menzel-Glä ; ser | 15747592 | |
| Eco lingettes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Écouvillon de gaze | Noba | PZN 2417767 | |
| Gants Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Lames de microscope | Menzel-Glä ; ser | AAAA000001##12E | |
| Plaques Multiwell 24 puits, stériles | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| pipettes Pasteur (verre) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| Pipettes Pasteur (verre) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Tubes à fond rond (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Pipettes sérologiques 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Pipettes sérologiques 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Pipettes sérologiques 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Pipettes sérologiques 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Pipettes sérologiques 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 gourde | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Embouts stériles 10µ ; L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Embouts stériles 1250µ ; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Embouts stériles 300µ ; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Embouts non stériles 10µ ; L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Embouts non stériles 1000µ ; L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Embouts non stériles 200µ ; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Pince à épiler (Prä ; zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Ethanol 96 % | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Médium de montage fluorescent Dako | S3023 | ||
| Méthanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Culture cellulaire | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| Solution EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Milieu de croissance des cellules endothéliales Promocell | C-22020 | ||
| Milieu de croissance des cellules endothéliales mélange de suppléments | Promocell | C-39225 | |
| Sérum fœtal bovin | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Recombinant humain GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocaïne | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Trypane blue stain 0,4 | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Anticorps primaires | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (chèvre) | BD | 610252 | |
| CD68 (lapin) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (chèvre) | R& D | AF748 | |
| SP-A (souris) | Abcam | ab51891 | |
| Anticorps secondaires | |||
| AF488 (anti souris âne) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (anti souris âne) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (âne anti lapin) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (âne anti chèvre) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Mini luer mâles, rangée de quatre,PP, vert | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 | |
| Mini Luer mâle, rangée de quatre, PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
| Mini Luer mâle, rangée de quatre, PP, rouge | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| Bouchons | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Réservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5424 | |
| Incubateur CO2 | Heracell | 150i Countess | |
| Compteur de cellules automatisé | Invitrogen | C10227 | |
| Débitcytomètre | BD | FACS Canto II | |
| Congélateur (-20 ° ; C) | Congélateur Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 ° ; C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Réfrigérateur | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Vibrateur orbital | Heidolph | Reax2000 | |
| Pompe péristaltique | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipettes 10µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipettes 100µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipettes 1000µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipettes 2.5µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipettes 20µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipettes 200µ ; L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| Banc stérile | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Waterbath Julabo | SW-20C | ||
| Fluorescence Microscope Setup | |||
| Apotome.2 | d’éclairage Zeiss | ||
| Microscope | Zeiss | HXP 120 C | |
| Sectionnement | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Bloc | d’alimentation Zeiss | ApoTome | |
| Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN Édition bleue | Zeiss |
Références
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- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Réimpressions et autorisations
