Ce protocole décrit une méthode robuste pour développer un biofilm pelliculaire. La méthode est adaptable à différents volumes de culture, ce qui permet une adoption facile pour divers objectifs expérimentaux. La conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement le potentiel de formation de biofilms de plusieurs espèces mycobactériennes.
Article de méthode
Cultiver un biofilm mycobactérien comme modèle pour étudier la résistance aux antimicrobiens
Dans cet article
Résumé
Résumé
De nombreuses bactéries prospèrent dans des communautés naturelles complexes, présentant des attributs clés de la multicellularité tels que la communication, la coopération et la compétition. La manifestation la plus répandue du comportement multicellulaire bactérien est la formation de biofilms, souvent liés à la pathogénicité. Les biofilms offrent un refuge contre les agents antimicrobiens, favorisant l’émergence de la résistance aux antimicrobiens. La pratique conventionnelle de cultiver des bactéries dans des cultures liquides en flacons agités ne parvient pas à représenter leur croissance physiologique appropriée dans la nature, ce qui limite par conséquent notre compréhension de leur dynamique complexe. Notamment, les profils métaboliques et transcriptionnels des bactéries résidant dans les biofilms ressemblent beaucoup à ceux des cellules en croissance naturelle. Ce parallélisme souligne l’importance des biofilms en tant que modèle idéal pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article se concentre sur l’utilisation de Mycobacterium smegmatis comme organisme modèle pour illustrer une technique de culture de biofilms de pellicules. L’approche est adaptable à différents volumes de culture, facilitant sa mise en œuvre pour divers objectifs expérimentaux tels que les études antimicrobiennes. De plus, la conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement les capacités de formation de biofilms de différentes espèces mycobactériennes avec des ajustements mineurs.
Introduction
Les bactéries sont capables de survivre en tant qu’entités unicellulaires ; Cependant, dans la plupart des conditions physiologiquement pertinentes, ils s’organisent en mimétiques communautaires. Le biofilm est une organisation communautaire largement reconnue de bactéries formées de cellules agrégées enfermées dans une matrice autoproduite1. Un tel assemblage possède des signatures de multicellularité précoce et offre une plus grande résistance au stress aux systèmes bactériens. Les biofilms sont souvent tolérants aux antimicrobiens et on estime qu’ils sont responsables de près de 80 % des infections microbiennes 2,3.
Les cultures en flacons agités et sur plaque sont traditionnellement les pratiques habituelles pour la culture bactérienne. Leur énorme acceptabilité et leur succès peuvent être attribués à leur facilité de manipulation, à leur reproductibilité et à leur évolutivité. Cependant, l’absence de contexte physiologique limite le potentiel translationnel des connaissances générées à l’aide de tels systèmes4. Par conséquent, les biofilms deviennent un système modèle attrayant pour étudier la physiopathologie bactérienne. Les biofilms fournissent un système modèle dynamique, reflétant étroitement les conditions naturelles, permettant aux chercheurs de reproduire des aspects physiologiques tels que les gradients de nutriments et l’hétérogénéité spatiale 5,6.
Le mode de vie du biofilm est particulièrement pertinent dans les études mycobactériennes, car les mycobactéries, y compris la célèbre Mycobacterium tuberculosis, sont des formateurs de biofilms7. Leur capacité à se développer dans les biofilms contribue à leur persistance dans les tissus de l’hôte pendant les infections. Il pose un formidable défi dans le traitement des maladies mycobactériennes, compte tenu de la résistance aux antibiotiques inhérente aux modes de vie des biofilms8. Les biofilms constituent également un système modèle idéal pour étudier le métabolisme des mycobactéries, car ils permettent d’étudier les adaptations métaboliques uniques et les stratégies d’utilisation des nutriments employées par les mycobactéries au sein de communautés microbiennes complexes9.
Alors que le biofilm est de plus en plus accepté comme un meilleur système modèle pour les études mycobactériennes10, il est nécessaire de disposer de procédures opérationnelles standard cohérentes et reproductibles, en particulier pour établir des parallèles entre les études menées dans différents laboratoires. La méthode décrite ici décrit les procédures de formation du biofilm pour une espèce mycobactérienne, M. smegmatis. M. smegmatis est un modèle plus accessible pour l’étude des biofilms mycobactériens, compte tenu de sa non-pathogénicité et de sa cinétique de formation de biofilm plus rapide. La méthode peut être modifiée pour s’adapter à des applications telles que le dépistage d’antimycobactériens, l’extraction de métabolites et les études omiques.
Protocole
Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. La préparation médiatique de Sauton
- Préparez 50 ml de solution de dihydrogénophosphate de potassium à 2,5 % en pesant soigneusement 1,25 g de dihydrogénophosphate de potassium et en le dissolvant dans 50 ml d’eau déminéralisée.
- Préparez 50 ml de solution de sulfate de magnésium à 2,5 % en pesant 2,56 g de sulfate de magnésium et en le dissolvant dans 50 ml d’eau déminéralisée.
- Préparez 10 ml de solution de citrate d’ammonium ferrique à 5 % en pesant 0,5 g de citrate d’ammonium ferrique et en le dissolvant dans 10 ml d’eau désionisée. Conservez-le dans un tube ambré.
- Préparez 100 ml de solution de glucose à 20 % en pesant 20 g de glucose et en le dissolvant dans 100 ml d’eau déminéralisée. Stériliser par filtre à l’aide d’une seringue stérile de 50 ml et d’un filtre pour seringue en PVDF de 0,2 μM dans un tube.
- Préparez 10 ml de solution stérile de sulfate de zinc à 1 % en pesant soigneusement 0,1 g de sulfate de zinc et en le dissolvant dans 10 ml d’eau déminéralisée. Stérilisez par filtre à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml et d’un filtre de seringue en PVDF de 0,2 μM dans le capot laminaire.
- Mélanger les composants préparés dans 750 mL d’eau déminéralisée comme décrit dans le tableau 1. Mesurez le pH de la solution et ajustez-le à 7. Compléter le volume à 900 mL avec de l’eau déminéralisée.
- Autoclavez le média à 15 PSI et 121 °C pendant 15 à 20 min. Laissez-le refroidir. Ensuite, ajoutez 100 μL de sulfate de zinc à 1 % stérilisé par filtre. Ajoutez 100 ml de glucose à 20 % stérilisé par filtre et dissolvez-le bien.
2. Préparation du Tween-80 5% stérilisé par filtre
- Dissoudre 0,5 mL de Tween-80 dans 9,5 mL d’eau désionisée.
- Stérilisez la solution à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml et d’un filtre pour seringue en PVDF de 0,2 μM dans le capot laminaire.
3. Préparation de la culture primaire
- Dans le capuchon laminaire, à l’aide d’une pipette sérologique, distribuer 2 mL de milieu LB autoclavé dans deux tubes à essai stériles de 14 mL.
- Ajouter 20 μL de Tween-80 5% stérilisé par filtre dans les tubes à essai à l’aide d’une micropipette.
- Inocuculez M. smegmatis dans l’un des tubes en ajoutant son stock cryogénique à l’aide d’une boucle d’inoculation. L’autre tube à essai sert de contrôle du support.
- Incuber les tubes pendant 48 h dans un incubateur à 300 tr/min et 37 °C.
REMARQUE : Le tube de contrôle du support ne doit pas montrer de croissance.
4. Préparation de la culture secondaire
- Dans le capuchon laminaire, à l’aide d’une pipette sérologique, distribuer 2 mL de milieu LB autoclavé dans deux tubes à essai stériles de 14 mL.
- Ajouter 20 μL de Tween-80 5% stérilisé par filtre dans les tubes à essai à l’aide d’une micropipette.
- Ajouter 20 μL de la culture primaire dans l’un des tubes à l’aide d’une micropipette. Gardez l’autre tube comme support de contrôle.
- Incuber les cultures dans un incubateur à 300 tr/min et 37 °C jusqu’à ce qu’elles atteignent une DO600 de 0,6 à 0,8.
REMARQUE : Il faut généralement 12 à 14 heures pour atteindre une OD600 de 0,6 à 0,8. D’autres densités cellulaires peuvent également être utilisées, mais une valeur OD600 définie facilite les études comparatives.
5. Mise en place du biofilm
- Dans le capuchon laminaire, distribuer 6 mL de milieu de Sauton complété par 2 % de glucose dans chaque puits d’une plaque à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique.
- Inoculer dans les puits respectifs 120 μL (c.-à-d. 2 %) de l’inoculum secondaire à l’aide d’une micropipette. Gardez-en un non inoculé comme témoin du milieu.
- Mélangez le milieu et la culture en pipetant de haut en bas à l’aide d’une micropipette de 1 ml. Couvrez le couvercle et fermez soigneusement la plaque avec un film de paraffine.
- Incuber la plaque sans être dérangée dans un incubateur statique à 37 °C pendant 7 jours.
6. Mise en place de biofilms pour des observations spécifiques à un stade
REMARQUE : La configuration globale du biofilm est la même que celle décrite à l’étape 5. Pour récolter ou imager le biofilm à différents moments dans le temps, il est suggéré que le même biofilm soit mis en place en plusieurs ensembles sur des plaques distinctes.
- Pour observer les biofilms entre le jour 3 et le jour 6, préparez quatre plaques dans des conditions identiques et utilisez une plaque par jour pour l’imagerie.
REMARQUE : La couche de biofilm commence à apparaître sur l’interface air-milieu à partir du troisième jour de configuration de la plaque.
7. Estimation du développement du biofilm
- Estimation visuelle
- Imagez les plaques à l’aide d’un système de documentation en gel avec éclairage à lumière épi-blanche (Figure 1).
REMARQUE : L’imagerie donne une estimation qualitative et quantitative grossière du biofilm formé. N’importe quel appareil photo de bonne qualité peut être utilisé comme alternative.
- Imagez les plaques à l’aide d’un système de documentation en gel avec éclairage à lumière épi-blanche (Figure 1).
- Estimation du poids à sec
- Effectuez une mesure du poids à sec pour une quantification plus précise.
- Pour mesurer le poids à sec, commencez par peser un papier buvard.
REMARQUE : Le papier filtre peut également être utilisé à la place du papier buvard. - Extrayez le biofilm de la plaque à 6 puits et transférez-le sur le papier à l’aide d’une spatule.
- Prélevez soigneusement la majeure partie du biofilm de la culture, en prenant soin de ne pas transférer des quantités excessives de milieu sur le papier.
- Placez le biofilm sur le papier buvard.
- Placez-le dans un incubateur à 50 °C pendant 0,5 à 1 h jusqu’à ce que le biofilm sèche complètement.
- Mesurez le poids combiné du papier et du biofilm.
REMARQUE : Poids sec du biofilm = (Poids du biofilm + papier)-(Poids du papier)
8. Dosage de la tolérance aux antibiotiques dans les biofilms
- Estimer la CMI90 de la rifampicine dans la culture planctonique de M. smegmatis en suivant le protocole décrit par Irith Wiegand et al. en utilisant le milieu de Sauton11. Ajouter l’antibiotique lorsque les cultures atteignent une DO600 de 0,2.
- Installez les plaques pour la croissance du biofilm comme décrit à l’étape 5 du protocole.
- Le quatrième jour d’incubation, ajouter la rifampicine aux cultures à la concentration MIC90 (64 μg/mL) à partir des côtés du puits à l’aide d’une micropipette dans le capuchon laminaire.
REMARQUE : Faites-le avec précaution sans trop déranger le biofilm. Laissez l’un des puits avec un biofilm non traité. - Faites tourner lentement les plaques pour mélanger les antibiotiques.
- Couvrez les côtés des plaques d’un film de paraffine et conservez-les dans l’incubateur pour une croissance ultérieure.
- Après 24 h, retirez les plaques du capot laminaire et ajoutez Tween-80 à une concentration finale de 0,2% dans tous les puits contenant du biofilm.
- Une fois de plus, couvrez les plaques d’un film de paraffine et maintenez-les à 4 °C et 100 tr/min pendant 12 h.
- Sortir les plaques dans un capuchon laminaire et homogénéiser les constituants à l’aide d’une micropipette de 1 ml.
- Lavez les constituants avec le milieu de Sauton en utilisant le protocole décrit dans Anand et al.12.
- Enfin, remettre les cellules en suspension dans un milieu de 6 mL de Sauton et les diluer jusqu’à des concentrations finales de 10-4, 10-5, 10-6 et 10-7.
- Étaler 100 μL de chaque dilution sur des plaques de gélose LB à l’aide de billes de verre autoclavées.
- Fermez toutes les plaques à l’aide d’un film de paraffine et conservez-les dans un incubateur à 37 °C.
- Après 3 jours d’incubation, comptez les colonies sur chaque plaque. Ne considérez que les plaques avec un nombre de colonies compris entre 30 et 300.
- Calculer l’UFC/mL et la diminution relative de l’UFC/mL à l’aide des formules fournies13.
REMARQUE : UFC/mL = (Nombre de colonies × facteur de dilution) / (Volume plaqué (en mL))
Diminution relative de l’UFC/mL = ((UFC/mL dans les aliments non traités - UFC/mL dans les aliments traités)) / ((UFC/mL dans les aliments non traités)) × 100
Résultats
Les pellicules du biofilm deviennent visibles à l’œil nu à partir du troisième jour. Bien que le biofilm se développe sur le milieu de Sauton sans 2% de glucose, une amélioration a été observée dans la réticulation lorsqu’il a été ajouté. Nous avons obtenu 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de poids sec de biofilm à partir de chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 1,5 mL de milieu de Sauton (complété par 2% de glucose) cultivé pendant quatre jours. Sur la figure 2, le développement du biofilm était visible du jour 3 au jour 6. Il commence à former un film avec une légère réticulation le jour 3, et au jour 5, il est complètement mature. À partir du 6e jour, le biofilm commence à se désintégrer. La CMI90 de la rifampicine (64 μg/mL) a réduit l’UFC du biofilm de 25 % ± 12 % (n = 3) seulement.
Figure 1 : Biofilms de M. smegmatis après 4 jours d’incubation dans le milieu de Sauton. (1) Sans glucose et inoculé avec un inoculum à 2%. (2) Sans glucose et inoculé avec 4% d’inoculum. (3) Avec 2% de glucose et inoculé avec 2% d’inoculum. (4) Avec 2% de glucose et inoculé avec 4% d’inoculum. (5) et (6) sont des commandes multimédias. Ici, les échantillons sont dans des plaques standard à 6 puits. Les photographies sont capturées sans aucun grossissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie du biofilm de M. smegmatis du 3e jour après l’inoculation au 6e jour. Ici, les échantillons sont dans des plaques standard de 24 puits. Les photographies sont capturées sans aucun grossissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| S. N° | Composant | Concentration de travail (p/v) | Concentration de la solution mère | Volume/Poids de la solution mère | |||||
| 1 | Dihydrogénophosphate de potassium | 0.05% | 2.50% | 20 mL | |||||
| 2 | Sulfate de magnésium | 0.05% | 2.50% | 20 mL | |||||
| 3 | Citrate d’ammonium ferrique | 0.01% | 5% | 1 mL | |||||
| 4 | Glycérol | 6% | 100% | 60 ml | |||||
| 5 | L- Asparagine | 0.40% | NA | 4 grammes | |||||
| 6 | Acide citrique | 0.20% | NA | 2 grammes | |||||
Tableau 1 : Composants de la préparation des milieux de Sauton.
Discussion
Le mode de vie multicellulaire des microbes a été décrit il y a près d’un siècle. Cependant, les études cliniques restent rares, principalement en raison du manque de méthodes robustes14. Les méthodes décrites dans les travaux sur la biologie du biofilm sont souvent difficiles à adapter. Ici, la méthodologie détaillée, aidée par des démonstrations d’étapes critiques, devrait améliorer la reproductibilité des protocoles.
La méthode de production de biofilm décrite dans cet article est évolutive, nécessitant une augmentation proportionnelle du volume moyen et de la taille de l’inoculum. Des applications telles que l’extraction de métabolites nécessitent un volume de culture plus élevé, tandis que les tests de sensibilité aux antimicrobiens nécessitent une biomasse plus petite12. De plus, la taille de l’inoculum peut être ajustée pour s’adapter au taux de formation du biofilm. Cette flexibilité permet aux chercheurs de contrôler correctement la durée des expériences.
Les conditions de croissance et le microenvironnement jouent un rôle crucial dans la physiologie du biofilm15. Notamment, la présence de glucose n’est pas obligatoire pour la formation d’un biofilm ; Néanmoins, il a été observé que l’inclusion de 2 % de glucose améliore la réticulation et la stabilité du biofilm. Une autre observation intéressante est le potentiel d’amélioration du biofilm de la mise en place d’une lamelle de verre au fond des puits de culture. L’ajout de Tween-80 dans les cultures primaires et secondaires est crucial pour atténuer l’agrégation cellulaire.
Le développement du biofilm implique des phases de croissance distinctes telles que l’attachement, la maturation et la dispersion. Alors que la configuration du biofilm décrite ici est généralement incubée pendant 7 jours, les pellicules deviennent visibles à l’œil nu à partir du3e jour. Ce dispositif permet d’étudier la dynamique temporelle du développement du biofilm. Bien que cet article décrit l’estimation du poids sec pour évaluer la biomasse du biofilm, la configuration se prête également à la coloration violette cristalline conventionnelle ou à l’estimation basée sur la microscopie12,16.
La production de biofilms par les mycobactéries joue un rôle important dans leur pathogénicité et confère une résistance accrue aux médicaments 8,17. Nous avons observé une tolérance aux antibiotiques sept à huit fois plus élevée dans les cultures de biofilm par rapport aux cultures en flacons agités. Plusieurs groupes utilisent les biofilms comme système modèle pour étudier la physiologie bactérienne ; Une adoption plus large de ce mode de croissance par la communauté de recherche mycobactérienne peut fournir de nouvelles informations sur la physiopathologie de diverses espèces pathogènes au sein de ce genre.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la bourse DBT-Ramalingaswami attribuée à Amitesh Anand.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 et micro ; Filtre à seringue M PVDF | Axiva | SFNY04 R | |
| 1 mL embouts | Genetix | GXM-611000 C | |
| 10 µ ; Embouts en L | Genetix | GXM-6110 C | |
| 200 & micro ; Embouts en L | Genetix | GXM-61200C | |
| Plaques en polypropylène à 6 puits | Tarsons | 980010 | |
| Tubes ambrés | Tarsons | 546051 | |
| Autoclave | Hospharma | ||
| Biosafety Cabinet A II | MSET | ||
| Papier buvard | Tout fournisseur | ||
| Centrifugeuse | Eppendorf | ||
| Acide citrique | Sigma | 251275 | |
| Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
| Citrate d’ammonium ferrique | Sigma | F5879 | |
| Système de documentation sur gel | Bio-Rad | ||
| Perles de verre | Sigma | G8772 | |
| Glucose | Sigma | 49139 | |
| Glycérol | Sigma | G5516 | |
| Boucles d’inoculation | Genaxy | HS81121C | |
| L-Aspargine | Sigma | A0884 | |
| LB-agar | Himedia | M1151 | |
| LB-media | Himedia | M575 | |
| M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC | 700084 | |
| Sulfate de magnésium | Sigma | M2643 | |
| Micropipettes | Gilson | ||
| Parafilm | Tarsons | ||
| Boîte de Pétri | Tarsons | 460020 | |
| pH-mètre | Labman Scientific Instruments | ||
| Lecteur de plaques | Tecan | ||
| Tubes à essai en polypropylène | Genaxy | GEN-14100-PS | |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma | P5379 | |
| Rifampicine | MedchemExpress | HY-B0272 | |
| Pipette sérologique | SPL Life Sciences | 95210 | |
| Incubateur | Eppendorf | ||
| Spatule | |||
| Spectrophotomètre | Thermo Scientific | ||
| Incubateur statique | CARON | ||
| Seringue stérile 10 mL | Becton Dickinson | 309642 | |
| Seringue stérile 50 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| Tween-80 | Sigma | P1754 | |
| Balance pesée | Sartorius | ||
| Sulfate | de zinc Sigma | Z0251 |
Références
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Réimpressions et autorisations
