Method Article

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

DOI:

10.3791/66613

⸱

May 24th, 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Abstract

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Diverses techniques permettant d’isoler la moelle osseuse de souris adultes ont été bien établies. Cependant, l’isolement de la moelle osseuse de souris néonatales est difficile et prend du temps, mais pour certains modèles, cela est pertinent et nécessaire sur le plan translationnel. Ce protocole décrit une méthode efficace et simple pour préparer les cellules de moelle osseuse de chiots âgés de 7 à 9 jours. Ces cellules peuvent ensuite être isolées ou différenciées en types de cellules d’intérêt spécifiques. Les macrophages sont des cellules immunitaires cruciales qui jouent un rôle majeur dans l’inflammation et l’infection. Au cours du développement, les macrophages néonatals contribuent de manière significative au remodelage des tissus. De plus, le phénotype et les fonctions des macrophages néonatals diffèrent de ceux de leurs homologues adultes. Ce protocole décrit également la différenciation des macrophages néonatals à partir des cellules isolées de la moelle osseuse en présence d’un milieu conditionné par L929. Les marqueurs de surface des macrophages néonatals différenciés ont été évalués à l’aide d’une analyse cytométrique en flux. Pour démontrer la fonctionnalité, l’efficacité phagocytaire a également été testée à l’aide d’Escherichia coli conjugué à un colorant sensible au pH.

Introduction

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La moelle osseuse renferme des populations de cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses qui sont auto-renouvelables et peuvent être différenciées en diverses lignées cellulaires. Les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse donnent naissance aux lignées myéloïdes et lymphoïdes1. Les cellules souches mésenchymateuses produisent des ostéoblastes (os), des adipocytes (graisse) ou des chondrocytes (cartilage)2. Ces cellules ont de multiples applications dans le domaine de la biologie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire, y compris la thérapie génique 3,4. Les cellules progénitrices présentes dans la moelle osseuse se différencient en types de cellules spécifiques en présence de facteurs de croissance spécifiques à la lignée. L’érythropoïétine favorise la prolifération des cellules progénitrices érythroïdes, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) stimule la croissance des colonies de neutrophiles et la thrombopoïétine régule la production de plaquettes comme quelques exemples de facteurs de croissance spécifiques à la lignée5. L’antigène de surface cellulaire marqué FACS et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) sont des méthodes bien établies pour l’isolement et la purification des types cellulaires spécifiques dérivés de la moelle osseuse6.

Bien que les études néonatales progressent vers la découverte des causes des décès néonatals et la résolution des complications lors des naissances prématurées, le développement thérapeutique direct reste un besoin médical non satisfait. Smith et Davis ont déclaré que « les patients pédiatriques restent des orphelins thérapeutiques »7. Il y a plusieurs défis, tels que la petite taille des échantillons, les effets à vie du résultat et les questions éthiques liées à l’obtention du consentement dans les études cliniques sur les nouveau-nés8. Par conséquent, il existe une forte demande de modèles d’étude in vivo et in vitro spécifiques aux nouveau-nés pour atteindre une pertinence translationnelle. En raison des similitudes entre les niveaux anatomiques et tissulaires, des courtes périodes de gestation et de la taille des portées, les rongeurs sont le système modèle de mammifère le plus étudié.

Ici, nous décrivons une procédure détaillée, hautement réalisable et reproductible pour isoler la moelle osseuse de petits souris âgés de 7 à 9 jours et leur capacité à se différencier en macrophages. Cependant, une variété de lignées cellulaires pourrait être obtenue en utilisant des signaux de différenciation distincts. Nous démontrons également la présence de marqueurs de surface cellulaire et la présence d’une activité phagocytaire in vitro attendue pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM).

Protocol

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Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux de Virginie-Occidentale et ont été effectuées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Des bébés souris C57BL/6J ont été utilisés pour cette étude. Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des supports

  1. Dans un tube à centrifuger de 5 ml, préparez 3 ml de milieu de culture MEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, 25 mM de HEPES et de pénicilline (100 μg/mL)/streptomycine (100 μg/mL) et conservez-le sur de la glace.
  2. Si nécessaire pour stocker les progéniteurs de la moelle osseuse dans de l’azote liquide, préparez un milieu de congélation contenant 10 % de DMEM, 80 % de FBS et 10 % de DMSO.
  3. Pour un DMEM complet, préparez du DMEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, 25 mM d’HEPES et de la pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (100 μg/mL).
  4. Pour la différenciation des macrophages, préparer du DMEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, de la pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (100 μg/mL) et 10 % de surnageant à cellules L929 9,10,11.

2. Préparation du surnageant à cellules L929

  1. Décongelez les cellules L929 stockées dans de l’azote liquide et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de DMEM complet. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
  2. Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu DMEM complet et les ensemencer dans un flacon de culture tissulaire T25 à la densité de 2×105 cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec 0,4 % de bleu trypan. Incuber à 37 °C avec 5% de CO2 jusqu’à ce qu’ils atteignent 70% de confluence.
  3. Pour détacher les cellules, lavez-les d’abord avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirez le PBS et remplacez-le par 2,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %.
  4. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 5 min et ajouter 5 mL de DMEM complet.
  5. Recueillir les cellules et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Remettre la pastille en suspension dans 15 mL de milieu DMEM complet et la transférer dans une fiole T75.
  7. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent 90 % de confluence, puis prélever le milieu et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Filtrer le média contenant du M-CSF à travers un filtre de 0,45 μm et congeler à -80 °C dans des aliquotes de 5 mL.

3. Préparation des animaux

  1. Sous une armoire de biosécurité, séparez soigneusement les bébés souris C57BL/6J âgés de 7 à 9 jours (une portée de 6 petits) de la mère et placez-les dans une cage séparée.
  2. Faites tremper une boule de coton dans 2 ml d’isoflurane de qualité vétérinaire dans un bocal ou une autre chambre de confinement.
  3. Placez un chiot dans la chambre et fermez le couvercle. Surveillez le nouveau-né pendant environ 90 secondes pour vous assurer qu’il devient immobile et inconscient.
  4. Retirez rapidement le chiot et décapitez-le avec des ciseaux bien aiguisés (en suivant les protocoles approuvés par l’institution) avant que le chiot ne puisse reprendre conscience.
    REMARQUE : Les nouveau-nés ne respirent pas assez profondément pour être euthanasiés par inhalation d’isoflurane seule.
  5. Assurez-vous de fermer le couvercle du récipient après avoir retiré chaque chiot. La même boule de coton peut être utilisée pour 5 à 7 chiots.

4. Isolement de la moelle osseuse néonatale

  1. Stérilisez le corps du nouveau-né avec de l’éthanol à 70%.
  2. "À l’aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux à pointe fine, faites une incision entre les
    abdomen et pattes arrière. Retirez la peau en tirant vers le pied des membres postérieurs.
  3. Grattez le tissu conjonctif et le muscle attaché aux os à l’aide d’une pince à arêtes vives.
  4. Coupez le tibia et le fémur, comme le montre la figure 1, avec des ciseaux pour les détacher et les retirer. À l’aide d’une pince, placez ces os dans le tube de média sur de la glace. Répétez le processus pour chaque chiot.
  5. Transférez les os à l’aide d’une pince dans une passoire de 40 μm avec un tube de prélèvement. Écrasez les os et libérez la moelle en appuyant avec un piston de seringue de 3 ml contre la passoire.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension par pipetage doux dans du NaCl à 0,2 %, une solution hypotonique pour la lyse des érythrocytes. Ajouter immédiatement un volume égal de 1,6% de NaCl pour amener la solution à isotonique.
  8. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et prélever la solution de lyse.
  9. Remettre en suspension dans un DMEM complet pour une utilisation immédiate ou dans un milieu de congélation pour le stockage et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
    REMARQUE : Pour la présente étude, cette méthode a donné 6,55 (± 1,44) ×10 6 cellules de moelle osseuse par petit (figure 1E).
  10. Stockez les cellules à -80 °C dans un fluide de congélation ou utilisez-les immédiatement comme décrit ci-dessous.
    REMARQUE : En raison de l’âge, les os sont suffisamment transparents et clairs pour visualiser la moelle à travers eux. Il est important d’être prudent lorsque vous tirez sur les os, car l’application d’une légère pression sur ceux-ci peut suffire à libérer la moelle. La moelle osseuse du nouveau-né se présente sous la forme d’un liquide plutôt que d’un fil intact que l’on trouve dans les os adultes. Il est difficile de prélever la moelle si elle s’échappe lors du prélèvement des os.

5. Différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse néonatale

  1. Ensemencer 2 × 107 cellules de moelle osseuse par fiole T75 dans 10 mL de DMEM complet contenant 10 % de surnageant de cellules L929 (2,5 mL) comme source de M-CSF. Incuber les boîtes de culture à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 5 jours. Ajouter 2 mL de milieu conditionné au L929 au jour 3 de la différenciation.
  2. Observez quotidiennement les cellules au microscope à l’aide d’un microscope inversé et d’un système d’imagerie avec un grossissement de 20x. Lors de la différenciation, les macrophages doivent apparaître adhérents, allongés et hétérogènes (Figure 2).
  3. Pour récolter les macrophages pour les tests en aval, aspirez le milieu de différenciation.
  4. Lavez les cellules avec 5 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes et les protéines sériques qui interféreront avec le détachement. Aspirer le PBS.
  5. Récoltez les cellules en ajoutant 5 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le ballon. Placer le ballon de culture à 37 °C avec un incubateur à 5 % de CO2 pendant 5 min et ajouter 5 mL de DMEM.
  6. Pipeter les cellules à détacher et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Dissociez la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM complet, puis comptez et vérifiez la viabilité cellulaire à l’aide de bleu trypan. Les DMBO isolées à l’aide de cette méthode sont de 7,05 (± 2,52) ×105 cellules/petit (figure 1E).
    REMARQUE : Observez la présence de cellules fusiformes qui commencent à apparaître au deuxième jour de la différenciation (Figure 1B, flèches rouges). Si la couleur du support devient jaune, indiquant qu’il est épuisé, ajoutez plus de support conditionné L929 au jour 4 de la différenciation ; Le remplacement complet du support n’est pas recommandé.

6. Immunomarquage et analyse cytométrique en flux

  1. Bloquer le marquage par anticorps non spécifiques des BMDM (2x105/marquage) en traitant avec 10 μL/107 cellules de réactif bloquant FcR selon les recommandations du fabricant dans un volume de 100 μL/tampon de cytométrie en flux (PBS complété par 2 mM d’EDTA et 0,5 % d’albumine sérique bovine). Garder sur la glace pendant 10 min.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être bloquées en vrac ou dans des puits ou des tubes individuels. Toutes les étapes suivantes indiquent les quantités et les volumes par étiquette de marqueur cellulaire individuel à un volume final de 100 μL.
  2. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de cytométrie en flux et centrifuger à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.
  3. Retirez le surnageant et ensemencez les cellules dans une plaque de 96 puits à fond en U à une densité de 5 × 105 cellules par puits. Colorer les cellules en ajoutant le colorant FVS780-Live/Dead cell counting dilué à 3 000 fois et 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4/80 et AlexaFluor488-CD206 dans 100 μL de tampon de cytométrie en flux, individuellement ou en combinaison 12,13,14,15. Incuber les cellules pendant 45 min sur de la glace recouverte de papier d’aluminium.
  4. Ajouter 100 μL de tampon de cytométrie en flux et laver les cellules par centrifugation à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.
  5. Aspirez le surnageant et vortex doucement la pastille cellulaire. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 0,4 % dans chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C.
  6. Laver les cellules en ajoutant 100 μL de tampon de cytométrie en flux et de pastille par centrifugation à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.
  7. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de cytométrie en flux et analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.

7. Essai in vitro pour évaluer l’efficacité phagocytaire des macrophages dérivés de la moelle osseuse néonatale

  1. Remettre les BMDM en suspension dans du DMEM complet sans rouge de phénol ni antibiotiques et les ensemencer à une densité de 2 × 105/quadrant dans une quadruple boîte de 35 mm à un volume de 500 μL.
  2. Pour préparer l’inoculum bactérien à une multiplicité d’infection (MOI) de 25 ou autre MOI souhaité, prélever un stock précalculé d’Escherichia coli O1 :K1 :H7 stocké à -80 °C.
  3. Aliquote le volume désiré de bactéries dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Lavez les bactéries en ajoutant du PBS à un volume total de 1 ml. Granulez les bactéries par centrifugation à 2 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Répétez l’étape de lavage.
  4. Remettre la pastille bactérienne en suspension dans 50 μL de PBS et ajouter un colorant fluorescent vert sensible au pH jusqu’à une concentration finale de 500 μM. Il s’agit d’un colorant sensible au pH, sans signal fluorescent à pH neutre, qui émet une fluorescence brillante dans les environnements acides, tels que les phagosomes acidifiés, pendant le processus de phagocytose.
  5. Incuber les cellules bactériennes pendant 20 min dans l’obscurité pour la conjugaison du colorant.
  6. Laver les bactéries quatre fois avec 1 mL de PBS par centrifugation à 1000 × g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Remettre les bactéries en suspension dans 500 μL de DMEM complet sans rouge de phénol et les ajouter aux cultures BMDM.
  8. Incuber les BMDM à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 4 h, puis ajouter 200 ng d’un colorant fluorescent rouge perméable aux cellules qui colore les lysosomes.
    REMARQUE : Les bactéries phagocytaires peuvent être visualisées par microscopie fluorescente.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant la méthode décrite dans cette étude, 25 à 37 millions de cellules de moelle osseuse peuvent être isolées avec succès à partir d’une portée de cinq petits souris C57BL/6. Cette méthode a été validée avec des portées de 5 à 7 petits. L’âge minimum pour l’isolement dans nos expériences a été de 7 jours. En fonction de la taille de la portée et du nombre de cellules nécessaires à l’expérience inférieur à un million, les chercheurs pourraient tenter ce protocole pour des souris de moins de 7 jours. En présence d’un surnageant de cellules L929 comme source de M-CSF, les cellules de la moelle osseuse ont été différenciées en macrophages en 5 jours (Figure 2). La formation de cellules fusiformes a été observée le deuxième jour de différenciation (Figure 2B), près de la moitié des cellules présentaient une forme de fuseau le troisième jour (Figure 2C), et la plupart des cellules adhéraient et formaient des formes de fuseau allongées le cinquième jour de différenciation (Figure 2D). Le rendement en macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec cette méthode était de 2,5 à 5 millions de cellules provenant de 5 petits âgés de 7 jours.

Pour caractériser phénotypiquement les BMDM différenciées, des cellules issues de cultures de 5 jours ont été immunomarquées pour CD11b, CD206 et F4/80. Les schémas de diffusion vers l’avant/côté et de déclenchement à un seul marqueur sont illustrés à la figure supplémentaire 1. Les résultats de l’analyse par cytométrie en flux ont montré que 76,4 % des BMDM sont positifs pour CD11b et F4/80 (figure 3A). La population F480-CD11b+ correspond au nombre approximatif de cellules positives pour CD206 (figure 3B). Ce dernier est généralement considéré comme un marqueur compatible avec les macrophages de type M2, et bien que l’abondance du marquage CD206 puisse varier jusqu’à deux fois plus, une proportion plus élevée de marquage F4/80 est compatible avec la capacité du M-CSF à promouvoir la différenciation vers un phénotype de type M116,17 (Figure 3).

Nous avons ensuite évalué la capacité des DMO néonatales différenciées à phagocyter les bactéries et à les acheminer vers des compartiments acidifiés à titre de mesure fonctionnelle. Les bactéries marquées avec un colorant sensible au pH ne devraient devenir fluorescentes que lorsqu’elles sont phagocytées et transportées vers des compartiments acidifiés. D’abondantes bactéries fluorescentes vertes phagocytées à l’intérieur des BMDM ont été détectées après l’infection (Figure 4A). La fluorescence verte se localise ensuite avec une fluorescence rouge indiquant des lysosomes acidifiés (Figure 4B,C). La phagocytose et l’apparition de DMO néonatales sensibles au pH vert et positives aux colorants ont également été observées tout au long de l’infection de 4 h (figure 4D et vidéo supplémentaire). L’activité fonctionnelle affichée ici est cohérente avec l’activité des macrophages inflammatoires de type M1.

figure-results-1
Figure 1 : Isolement de petits souris C57BL/6J âgés de 7 jours, os osseux. (A) Os postérieurs des petits âgés de 7 jours dans une boîte de 100 mm. (B) Membre postérieur d’un chiot de 7 jours après avoir enlevé la peau et le tissu sous-cutané ; Des pointillés noirs indiquent l’endroit à couper pour l’extraction de la moelle osseuse. (C) Le membre postérieur néonatal a traité les os avec de la moelle avant de les écraser. (D) Le membre postérieur néonatal a traité les os après les avoir écrasés à l’aide d’un piston de seringue dans une passoire. (E) Le nombre moyen ±erreur-type de cellules de macrophages de la moelle osseuse et de la moelle osseuse obtenues à partir de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Différenciation des DMBO à partir de cellules de moelle osseuse néonatale âgées de 7 jours. Cellules de la moelle osseuse au jour 1 (A), au jour 2 (B), au jour 3 (C) et au jour 5 de la différenciation (D). Les flèches rouges sur le panneau B indiquent des cellules adhérentes en forme de fuseau au jour 2 de la différenciation. Barres d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Détection de marqueurs de macrophages murins à l’aide de l’analyse cytométrique en flux. Macrophages différenciés dérivés de la moelle osseuse néonatale montrant l’expression des antigènes de surface F4/80 et CD11b (A) ou CD206 et CD11b (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Phagocytose d’E. coli marqués à un colorant sensible au pH par des DMO néonatals. (A) Macrophages dérivés de la moelle osseuse montrant des E. coli sensibles au pH phagocytés marqués (vert) après 4 h d’infection. (B) BMDM marqués d’une coloration pour les lysosomes acidifiés (rouge). (C) Image fusionnée des panneaux (A) et (B). Barres d’échelle : 20 μm. (D) Une superposition de bactéries fluorescentes vertes sur des macrophages montrées en contraste de phase. Le grossissement en (D) est le même que celui en (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire. Une vidéo de 4 h de l’imagerie de cellules vivantes de bactéries fluorescentes vertes par des BMDM néonatals, comme dans la figure 4, panneau A. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure supplémentaire 1 : Analyse par cytométrie en flux des BMDM. (A) Les BMDM ont d’abord été raccordés au FSC et au SSC pour enlever les débris et les doublets. Une coloration unique de F4/80 (B), CD11b (C) et CD206 (D) est montrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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La recherche sur des modèles de souris néonatales peut présenter un certain nombre de défis. Les nouveau-nés ont un système immunitaire en développement qui est unique par rapport aux adultes8. En tant que telles, les données générées à partir de modèles animaux adultes ne doivent pas être supposées s’appliquer aux nouveau-nés, et plusieurs travaux publiés ont bien articulé cette idée18,19. Par conséquent, des modèles et des sources de cellules spécifiques au nouveau-né sont nécessaires pour étudier les subtilités de la réponse immunitaire au début de la vie. Cependant, en raison de la taille, de la sensibilité et de la nature délicate des souris néonatales, la quantité d’échantillons biologiques peut être limitée et le processus de collecte peut prendre du temps. Ce protocole établit une procédure simple et rapide pour l’extraction de la moelle osseuse de souris néonatales.

Les os de souris adultes sont assez gros pour insérer une aiguille et rincer facilement la moelle. À l’inverse, l’accès à la moelle osseuse néonatale à l’aide d’une aiguille est difficile en raison de sa taille et de sa fragilité. Certaines études ont utilisé la digestion enzymatique avec la collagénase de type II et la dispase20. Ici, en raison de la nature molle et minuscule des os néonatals, nous avons adopté une méthode d’écrasement pour libérer la moelle osseuse. Après purification, en fonction de l’application de recherche d’intérêt, ces cellules peuvent être différenciées en types de cellules spécifiques.

Les nouveau-nés présentent des populations phénotypiques de macrophages distinctes21. Cette étude a élucidé la différenciation des DMBO à partir des cellules de la moelle osseuse des chiots âgés de la 7e à la 9e année sans utiliser d’enzymes. Les étapes critiques de la méthodologie comprennent la nature délicate globale des bébés souris nouveau-nés, la collecte des petits os d’une manière qui ne permet pas la libération de la moelle osseuse et la localisation de l’endroit approprié dans le tibia et le fémur pour faire des coupes en ciseaux. Nous avons observé que les DMO néonatales sont plus sensibles que les DMO adultes en culture, et qu’une durée plus longue d’isolement de la moelle osseuse des nouveau-nés interdisait leur capacité de différenciation. Par conséquent, l’extraction de plus de 7 chiots à la fois n’est pas suggérée. De plus, l’ajout de milieux de différenciation BMDM le deuxième jour de différenciation a également entraîné de mauvais résultats tels qu’une mauvaise différenciation et une viabilité plus faible.

Ce protocole utilisait le surnageant de cellules L929 comme source de M-CSF pour la différenciation des cellules de la moelle osseuse en macrophages. Les cellules L929 sont des fibroblastes murins connus pour produire de grandes quantités de M-CSF10. On s’attend à ce que les macrophages soient exposés à d’autres substances sécrétées dans le surnageant L929, ainsi qu’au M-CSF. Le M-CSF purifié commercial peut également être utilisé pour la différenciation des macrophages ; cependant, nous ne l’avons pas directement comparé à l’utilisation du surnageant de culture L929. Il est également important de noter que L de Brito Monteiro et al. ont observé des profils métaboliques distincts entre les macrophages générés à l’aide de L929 et le M-CSF22 commercial.

Cette méthode a permis d’établir une approche économique et rapide sans utiliser d’enzymes digestives. La technique a permis d’isoler de manière fiable la moelle osseuse néonatale, ce qui a permis de différencier clairement les DMO néonatales. Les DMO néonatales isolées peuvent être utilisées pour étudier la dynamique des macrophages néonatals au cours de diverses infections et la régulation de l’inflammation par ces cellules. Les limites de la méthode comprennent une courbe d’apprentissage pour l’établissement initial et l’adaptation au processus de traction des petits os, qui finit par s’améliorer avec l’expérience et minimise la durée du processus avec une viabilité accrue des cellules. La taille des portées de petits est une considération supplémentaire pour le nombre de macrophages qui peuvent être différenciés en fonction des besoins expérimentaux.

Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent pour cet article.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R01 AI163333] à CMR. Nous tenons à souligner le soutien financier supplémentaire apporté à la plateforme de cytométrie en flux et de cellule unique de l’Université de Virginie-Occidentale par les subventions suivantes : GM104942 de subvention CTSI de WV, GM121322 de subvention CoBRE de microenvironnement tumoral et OD016165 de subvention NIH.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40 et micro ; m passoireGreiner542040Culture cellulaire
96 puits rond (U)plaque inférieure Thermo Scientific12-565-65Culture cellulaire
Anti-souris CD11b-BV786BD Biosciences740861analyse FACS
Anti-souris CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709analyse FACS
Anti-souris F4/80-PEBD Biosciences565410Analyse FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCCompteur de cellules
automatisé DMEMHycloneSH30022.01Culture cellulaire
DMSOVWRWN182Culture cellulaire
DPBS, 1xCorning21-031-CVCulture cellulaire
Escherichia coli O1 :K1 :H7ATCC11775Infection
EVOS FL  ;Système d’imagerie cellulaireInvitrogen12-563-649
FBSAvantor  ;76419-584Culture cellulaire
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701Milieux de culture sans colorant
GlutamineCytivaSH30034.01Culture cellulaire
HEPESCytivaSH30237.01Culture cellulaire
L-929ATCCDifférenciation
LSRFortessaBecton DickinsonFlowcytometer
Lysotracker rouge DND 99InvitrogenL7528Colorant fluorescent
MEMCorning15-010-CVCulture cellulaire
Pénicilline /streptomycine  ;HycloneSV30010Culture cellulaire
pHrodo green STP ester  ;InvitrogenP35369Colorant fluorescent
Fiole T75Étoile cellulaire658170Culture cellulaire
Trypsine-EDTAGibco25300120Culture cellulaire
Zeiss 710  ;ZeissP20GM103434Confocal

References

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