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Applications de la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide dans la recherche sur les produits naturels : les alcaloïdes tropanes comme étude de cas

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DOI :

10.3791/66620

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8 mars 2024

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1Department of Chemistry, Northern Michigan University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une méthode d’annotation et de classification des alcaloïdes tropanes basée sur la spectrométrie de masse rapide (MS)/spectrométrie de masse (MS), utile à la fois pour la déréplication préliminaire d’échantillons contenant des tropanes et la découverte de nouveaux alcaloïdes pour l’isolement.

Résumé

Bien que de nombreux médicaments utilisés aujourd’hui soient d’origine synthétique, les produits naturels fournissent toujours une riche source de diversité chimique et de bioactivité nouvelles, et peuvent donner des pistes prometteuses pour des maladies résistantes ou émergentes. Le défi, cependant, est double : non seulement les chercheurs doivent trouver des produits naturels et élucider leurs structures, mais ils doivent également identifier ce qui vaut la peine d’être isolé et analysé (et ce qui est déjà connu - un processus connu sous le nom de déréplication). Avec l’avènement de l’instrumentation analytique moderne, le rythme de la découverte et de la déréplication des produits naturels s’est accéléré. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) est devenue une technique particulièrement précieuse pour identifier et classer les structures chimiques. Les alcaloïdes tropanes (AT) sont des composés d’origine végétale d’une grande importance médicinale et toxicologique. Dans cette étude, nous avons développé un flux de travail de dépistage basé sur LC-MS/MS en utilisant les multiples configurations MS/MS disponibles sur un spectromètre de masse à triple quadripôle (QQQ) pour annoter et classer les structures TA en fonction de leurs modèles de fragmentation distincts. En utilisant une combinaison de balayages d’ions de produits dépendants des données (DD), de balayages d’ions précurseurs (PrIS) et de balayages de perte neutre (NLS), nous avons appliqué cette méthode à des extraits riches en TA des solanacées Datura stramonium et Datura metel. Cette méthode est rapide, sensible et a été utilisée avec succès à la fois pour la déréplication préliminaire d’échantillons complexes contenant de l’AT et pour la découverte d’un nouveau candidat pour l’isolement, la purification (et éventuellement l’essai biologique).

Introduction

Bien que les molécules entièrement synthétiques aient pris de l’importance dans la découverte de médicaments au cours des dernières décennies, près des deux tiers de tous les médicaments approuvés au cours des 39 dernières années sont des produits naturels ou inspirés de produits naturels1,2 , ce qui souligne l’importance continue de la recherche sur les produits naturels. Les alcaloïdes, certains produits naturels contenant de l’azote, sont particulièrement prisés pour leurs propriétés médicinales. Les alcaloïdes tropanes (TA) contenant le [3.2.1.]-système bicyclique contenant de l’azote, sont produits principalement par les plantes des familles des Solanacées (morelles), des Erythroxylaceae et des Convolvulaceae. Les exemples incluent l’atropine, la scopolamine et la cocaïne ; Plusieurs tropanes semi-synthétiques ou synthétiques sont également utilisés cliniquement3. Les TA et leurs dérivés sont utilisés pour traiter de nombreuses affections 3,4 et plusieurs de ces médicaments figurent sur la liste 2023 des médicaments essentiels de l’OMS5. En raison de leurs activités puissantes, les TA sont également utilisés à des fins récréatives (comme stimulants ou délirants) et peuvent provoquer une intoxication lors de l’ingestion de plantes (ou de préparations) qui en contiennent 6,7. Les TA sont indésirables dans l’alimentation humaine et animale8 et peuvent altérer les thés, les épices, les céréales, le miel et les suppléments à base de plantes 9,10. En raison de leur promesse médicinale et de leur capacité à empoisonner, les méthodes analytiques qui peuvent aider à la découverte de nouveaux TA (et à l’identification des TA connus) sont utiles.

En spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), des « filtres de masse » (p. ex., quadripôles, tubes à temps de vol) sont couplés physiquement (« dans l’espace »), ou un instrument utilise des étapes de réaction ou de séparation supplémentaires « dans le temps ». La spectrométrie MS/MS dans l’espace utilise différents modes pour sélectionner et fragmenter différents ions au niveau des différents filtres de masse (par exemple, les quadripôles d’un instrument triple quadripôle ou QQQ). Ces différents modes peuvent être utilisés pour déterminer quels fragments spécifiques sont fabriqués par un ion donné (balayage ionique produit), quels ions d’un échantillon produisent certains fragments (balayage d’ions précurseurs ou PrIS) ou subissent des pertes d’une masse caractéristique (balayage de perte neutre ou NLS), ou quels composés spécifiques possèdent quels fragments spécifiques (surveillance des réactions multiples). La MS/MS fournit donc des fragments utiles pour proposer des structures pour de nouveaux composés ou confirmer la présence d’un composé existant. La spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée dans les domaines de la découverte de médicaments, de la chimie des produits naturels et de la métabolomique11,12, et a été utilisée pour établir le profil d’espèces contenant des alcaloïdes (pour la caractérisation phytochimique ou l’analyse chimiotaxonomique) et pour détecter et quantifier des alcaloïdes spécifiques dans les aliments ou les plantes médicinales 10,13,14,15,16.

Malgré les nombreuses techniques de spectrométrie de masse disponibles, il est difficile de trouver de nouveaux alcaloïdes. En plus de trouver un organisme candidat au dépistage, une confirmation structurale complète d’un alcaloïde est un processus ardu qui peut inclure de nombreuses techniques d’analyse différentes. De plus, les chercheurs pourraient isoler un composé déjà connu, ce qui fait perdre du travail, du temps et des ressources. Cela est particulièrement difficile pour les AT, où des centaines, voire des milliers d’AT, dont beaucoup sont isomères les uns avec les autres, sont signalés. Le processus d'« identifier les connus et de les distinguer des inconnus » est connu sous le nom de déréplication. Des bases de données sur les temps de rétention (r.t.s) et les fragments de masse de différents TA et autres composés sont publiées pour faciliter ce processus17,18. Néanmoins, la déréplication est laborieuse ; le simple fait d’annoter (c’est-à-dire d’attribuer des structures putatives à) les alcaloïdes dans l’ensemble du chromatogramme LC-MS/MS d’un échantillon prend du temps. Récemment, le réseau moléculaire1 9,20 et la déréplication manuelle 18,21,22 ont été utilisés pour les alcaloïdes de benzylisoquinoléine, d’indole monoterpénique et de tropane, et les PrISs ont été utilisés pour le « filtrage structurel » des spectres afin d’identifier les alcaloïdes de type pyrrolizidine et solanine 23,24. Cependant, il n’existe pas de méthodes ou de flux de travail spécifiques pour la déréplication rapide basée sur LC-MS/MS d’échantillons contenant des TA, même si les TA possèdent des fragments communs et facilement identifiables (Figure 1). La méthode décrite ici utilise une combinaison de balayages d’ions produits dépendants des données (DD), de PrIS et de NLS pour annoter et classer les structures TA dans les plantes en fonction des modèles de fragmentation distincts pour les tropanes mono-, di- et trisubstitués (Figure 1A) et des pertes de groupes esters communs trouvés dans ces alcaloïdes (Figure 1B). Les organismes étudiés sont plusieurs espèces du genre Datura. Une riche source de TA divers, Datura a été utilisé tout au long de l’histoire du monde à des fins médicinales et culturelles17- et est une matrice difficile à dérépliquer en raison de ses nombreux TA structurellement similaires, nous fournissant des échantillons attrayants sur lesquels tester notre méthode.

Protocole

ATTENTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données de sécurité (FDS) pertinentes avant d’utiliser les produits chimiques répertoriés.

1. Préparation de l’échantillon

ATTENTION : L’azote liquide peut provoquer des brûlures cryogéniques. Utilisez des gants cryogéniques et des lunettes de protection dans un endroit bien ventilé. Les échantillons de plantes contenant des alcaloïdes peuvent être irritants pour la peau ; manipulez-les toujours avec des gants. Le méthanol est toxique et inflammable et doit être manipulé dans une hotte à l’abri des sources d’inflammation potentielles.

REMARQUE : En théorie, on peut utiliser des tissus végétaux cultivés ou sauvages (séchés ou fraîchement moulus) ; La procédure ci-dessous n’est que celle utilisée lors du développement de la méthode.

  1. Si le tissu végétal d’intérêt est frais, congelez-le en le plaçant dans un tube conique en polypropylène et en l’immergeant dans de l’azote liquide pendant 2-3 min.
  2. Placez le tissu végétal congelé dans un mortier pré-refroidi (dans un refroidisseur en polystyrène avec de l’azote liquide) et, à l’aide d’un pilon pré-refroidi, broyez le tissu en une poudre uniforme.
  3. Pesez rapidement la quantité souhaitée de tissu dans un tube de microcentrifugation en polypropylène taré à l’aide d’une spatule pré-refroidie, et ajoutez immédiatement 20 % de méthanol (à température ambiante [RT]) à une concentration de 1 mL pour 100 mg de tissu.
    REMARQUE : Le méthanol (20 %) est couramment utilisé pour extraire les TA25. À l’occasion, on ajoute de l’acide formique à 0,1 %, bien qu’aucune différence dans l’efficacité de l’extraction n’ait été observée lors de la mise au point de cette méthode et d’autres.
  4. Placez les tubes bouchés sur un agitateur à bascule (vitesse moyenne) pendant au moins 3 h à RT.
  5. Centrifuger les tubes à 9464 x g pendant 10 min. Pipeter le surnageant dans un flacon d’échantillonneur automatique LC-MS ou, si le temps est encore trouble, filtrer d’abord à travers un filtre de seringue de 0,45 μm.
    REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici, bien que les échantillons et extraits de plantes fraîches traités doivent être conservés dans un congélateur à -80 °C avant l’analyse afin d’éviter toute dégradation potentielle des alcaloïdes.

2. Configuration de l’instrument LC-MS et collecte de données

ATTENTION : L’acétonitrile est toxique et inflammable ; tenir à l’écart des sources d’inflammation et contrôler les vapeurs à l’aide d’une hotte. L’acide formique est corrosif ; Évitez tout contact avec la peau et les yeux et portez un équipement de protection individuelle approprié.

  1. Utilisez un instrument LC-MS avec une source d’ionisation par électronébulisation (ESI) et une colonne HPLC en phase inverse (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Pour la HPLC, utiliser de l’acide formique à 0,1 % dansH2O comme solvant A et de l’acide formique à 0,1 % dans l’acétonitrile comme solvant B ; équilibrer la colonne avec 99 % A et 1 % B. Configurez une pente de 30 min de 1 % à 50 % B sur 26 min, revenant à 1 % B à 26,01 min et maintenant à 1 % B pendant 4 min. Utilisez une température de four à colonne de 45 °C et un débit de 0,5 mL/min.
  3. Dans la méthode LC-MS, utilisez les paramètres de fonctionnement suivants pour le spectromètre de masse : tension d’interface : 4,0 kV, débit de gaz de nébulisation : 3 L/min, débit de gaz de chauffage : 10 L/min, température DL : 250 °C, température du bloc thermique : 400 °C, température d’interface : 300 °C, débit de gaz de séchage : 10 L/min et pression du gaz de dissociation induite par collision (CID) (argon) de 17 kPa.
  4. Créez une méthode MS en mode ESI positif qui comprend à la fois un balayage Q3 et un balayage Q1 (100-1000 Da) qui fonctionne comme un événement d’enquête (réglé sur la longueur de la méthode LC), avec l’exclusion automatique des isotopes activée. Inclure un balayage d’ions produits en tant qu’événement dépendant du balayage Q1 (analyse DD), avec une fenêtre de masse de 50 à 1000 Da, une énergie de cellule de collision de -20 V et un temps d’événement de <0,2 s.
    REMARQUE : Le seuil de comptage pour déclencher le balayage ionique du produit DD de Q1 peut être variable, mais en règle générale, un niveau de 7 000 à 10 000 comptages est utilisé. Sur certains instruments, comme celui utilisé pour développer la méthode, le balayage Q3 offre une plus grande précision de masse et une sensibilité que le Q1 et est inclus pour confirmer les ions observés dans le balayage Q1, bien qu’il puisse être omis de l’étape 2.4 sans problème.
  5. À la méthode MS ci-dessus, ajoutez des PrISs en mode positif égaux à la longueur de la méthode LC avec des énergies de cellule de collision de -20 V et des temps d’événement de 0,75 s. Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion automatique des isotopes ou de désisotopation sont activées. Assurez-vous que les valeurs m/z d’intérêt pour les fragments d’AT (en Da, voir la figure 1A) sont 124.1 (pour les AT monosubstitués, fenêtre de masse de 125-1000 Da), 122.1 et 140.1 (pour les AT disubstitués, fenêtres de masse commençant à 123 et 141 Da, respectivement), et 156.1 et 138.1 (pour les AT trisubstitués, fenêtres de masse commençant à 157 et 139 Da, respectivement).
    REMARQUE : Au cours de l’élaboration de la méthode, les PrIS ont été divisés en deux méthodes différentes, l’une pour les AT mono- et disubstitués et l’autre pour les TA trisubstitués, bien qu’elles puissent être divisées ou combinées de n’importe quelle façon.
  6. Construisez une deuxième méthode MS qui inclut les paramètres de l’étape 2.4.
    1. À cette méthode MS/MS, ajoutez un NLS en mode positif égal à la longueur de la méthode LC, avec des énergies de cellule de collision de -20 V et des temps d’événement de 0,75 s. Assurez-vous que dans tous les cas, les fonctions d’exclusion ou de désisotopation automatiques des isotopes sont activées.
    2. S’assurer que les masses de perte neutre d’intérêt pour les esters sur les AT (en Da, voir Figure 1B) sont 100,05 (pour les esters dérivés de l’acide tiglique, fenêtre de masse de 110-1000 Da), 60,03 (pour les groupes acétyle, fenêtre de masse de 100-1000 Da) et 166,06 (esters d’acide phényllactique ou d’acide tropique, fenêtre de masse de 170-1000 Da).
  7. Téléchargez la méthode LC-MS et créez des fichiers de données pour les échantillons d’intérêt. Une fois que la colonne HPLC est équilibrée à 45 °C, analysez les échantillons d’intérêt dans un lot ou un fichier de projet avec des blancs de solvant d’extraction appropriés entre différentes espèces ou types de tissus. Un volume d’injection typique est de 10 à 20 μL.
    REMARQUE : À des volumes particulièrement élevés, le détecteur de spectromètre de masse peut être saturé. Si vous analysez des échantillons très concentrés, assurez-vous que la source ESI est nettoyée et que l’instrument est accordé régulièrement. Le protocole peut être mis en pause ici une fois que toutes les données ont été collectées.

3. Analyse des données

  1. Examinez le chromatogramme ionique total des balayages Q1 et Q3 (et le balayage d’ions produit DD), et notez la masse parente de tous les ions abondants qui ont des caractéristiques similaires à celles de l’AT : a) masse <500 Da pour l’ion [M+H]+ , généralement une masse paire, b) r.t.s typique entre 2 et 22 min en utilisant la méthode LC ci-dessus, et c) fragments de la liste suivante : m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 ou 128 Da.
  2. Examinez le chromatogramme/canal PrIS pour m/z 124, et notez quels pics/ions sont à quels r.t.s (enregistrés à l’étape 3.1) produisent ce fragment. Cliquez balayage par balayage sur le chromatogramme et examinez l’ensemble des spectres MS/MS obtenus dans le balayage ionique du produit DD, en particulier pour les espèces moins abondantes.
    REMARQUE : Une véritable espèce contenant ce fragment existera pour plusieurs balayages et apparaîtra à la fois dans les balayages Q1 et Q3 (si ce dernier est utilisé). Une feuille de calcul est jointe aux renseignements à l’appui (fichier supplémentaire 1) pour faciliter les annotations.
  3. Répétez l’étape 3.2 avec les autres chromatogrammes PrIS. Comme m/z 122 et 140 sont tous deux indicatifs d’AT disstitués et que m/z 138 et 156 sont indicatifs d’AT trisubstitués, examinez ces chromatogrammes/canaux ensemble.
  4. Examinez le chromatogramme/les canaux NLS pour m/z 100, 60 et 166, et notez quels pics/ions auxquels les r.t. (enregistrés à l’étape 3.1) produisent ces pertes neutres. Comme pour le PrIS, cliquez balayage par balayage dans le chromatogramme et comparez avec la fragmentation obtenue dans le balayage ionique du produit DD, en particulier pour les espèces de faible abondance.
  5. À l’aide de la combinaison des données PrIS et NLS, étayées par les résultats de balayage ionique du produit DD, faites des annotations présumées des alcaloïdes observés en ajoutant la plus petite masse tropane (par exemple, 124, 122 ou 138) et la perte neutre, puis en tenant compte de la masse restante.
    REMARQUE : Les groupes typiques substituant les TA (et leurs masses en Da) sont l’hydroxyle (18), l’acétyle (60), le propionyle (74), l’isobutyryle (88), le tigloyle (100), le tigloyl/2-méthylbutyryle saturé (102) ou le phényllactate/acide tropique (166).
  6. Comparer les annotations pour les alcaloïdes à celles rapportées dans la littérature17 et les bases de données (par exemple, MoNA)26 pour déterminer quels modèles de substitution d’AT sont rapportés (et lesquels sont potentiellement nouveaux). De plus, utilisez des étalons de certains alcaloïdes tropanes courants (par exemple, atropine, littorine, scopolamine) qui sont disponibles dans le commerce pour confirmation.
  7. Pour obtenir des informations structurales supplémentaires sur les échantillons de faible abondance (le PrIS et le NLS peuvent détecter des ions inférieurs aux seuils d’événements dépendants), prélever un balayage d’ions de produit spécifique (en utilisant la masse d’intérêt comme ion précurseur) sur un échantillon plus concentré.
    REMARQUE : Cette méthode a été développée sur un instrument QQQ à basse résolution. Pour tous les nouveaux composés présumés, un instrument MS à haute résolution doit être utilisé pour obtenir des spectres de masse précis.

Résultats

Pour démontrer l’efficacité de la méthode, un mélange standard d’AT (10 μg/mL chacun d’un mélange d’acétyltropine/acétylpseudotropine [monosubstitué], 10 μg/mL chacun d’un mélange de deux isomères d’anisodamine [disubstitué], ainsi que d’hyoscyamine [monosubstitué], de littorine [monosubstitué] et de scopolamine [trisubstitué]) a été analysé en tant que témoin positif (figure 2). Un chromatogramme de balayage Q1 complet (affiché dans la vue du chromatogramme de crête de base) est illustré à la figure 2A, avec les structures standard TA indiquées par leurs pics correspondants. Le PrIS pour m/z 124 (Figure 2B) affiche des pics dans son chromatogramme pour les TA monosubstitués ; Par conséquent, le mélange d’acétyltropine / pseudotropine, d’hyoscyamine et de littorine sont présentés. Les pics correspondant à l’acétyltropine et à la pseudotropine dans le chromatogramme m/z 124 sont petits (peut-être parce qu’ils sont à une concentration inférieure à celle des autres étalons et peut-être parce qu’ils pourraient produire un fragment m/z 124 moins abondant que les autres TA monosubstitués). Néanmoins, ils sont toujours détectables à la fois dans ce chromatogramme et dans le canal PrIS correspondant. Les figures 2C et 2D sont des chromatogrammes PrIS pour m/z 122 et 140, respectivement. En détectant des fragments de TA disstitués, ils signalent tous deux les deux isomères de l’anisodamine, avec un signal plus fort visible sur le canal m/z 140. Étant donné que différents TA peuvent posséder des fragments d’intensités différentes, les canaux m/z 122 et 140 doivent être examinés ensemble. Enfin, les canaux m/z 156 (Figure 2E) et m/z 138 (Figure 2F), diagnostiques pour les TA trisubstitués, présentent tous deux un pic pour la scopolamine (le seul TA trisubstitué dans le mélange standard).

Des chromatogrammes NLS ont ensuite été utilisés pour attribuer les groupes esters présents. La figure 2G montre le chromatogramme NLS pour 60 Da (perte d’acide acétique à partir des esters d’acétate) : les deux isomères monosubstitués acétylés de TA sont visibles. Le chromatogramme NLS pour 166 Da (Figure 2I), destiné à identifier les esters phényllactiques ou tropiques, identifie correctement tous les alcaloïdes contenant l’un ou l’autre de ces groupes (hyoscyamine, littorine, les deux isomères de l’anisodamine et scopolamine). Enfin, comme prévu, le chromatogramme (Figure 2H) de la perte de 100 Da (diagnostic des esters tigloylés) est vierge à l’exception d’une impureté mineure à 1,75 min de profondeur, car aucun des alcaloïdes standards ne contient ce groupe.

La méthode a ensuite été testée pour détecter les faux positifs. Un extrait eau/méthanol de feuille de tomate (Solanum lycopersicum) a servi de témoin négatif. Bien qu’elles soient des morelles, les tomates ne produisent pas d’AT. La figure 3A illustre un chromatogramme à crête de base à balayage Q1 complet. Le PrIS pour m/z 124 (Figure 3B) est principalement vide, avec de petites fluctuations de base qui sont probablement du bruit de détecteur (aucun signal ne correspondait à ces masses dans les balayages Q1 ou Q3). Deux caractéristiques avec des r.t.s de 2,6 et 3,4 min donnent un fragment de 124, mais l’examen du balayage des ions produits DD révèle que ces caractéristiques ne produisent pas d’autres fragments de tropane monosubstitués (m/z 93 ou 142), ce qui suggère qu’il ne s’agit pas de TA. Cet exemple met également en évidence l’utilité d’inclure le balayage ionique du produit DD dans cette méthode pour exclure les faux positifs. De même, le canal m/z 122 pour les TA disstitués (Figure 3C) ne montre également que du bruit. Les chromatogrammes PrIS pour m/z 140, m/z 138 et m/z 156, ainsi que les trois NLS, qui ne suggèrent que des caractéristiques non TA sur les balayages DD, sont illustrés dans la figure supplémentaire 1A-F.

Pour démontrer les utilisations de cette méthode dans la déréplication d’un échantillon contenant de l’AT, un extrait de racine de D. metel var. 'fastuosa' a été analysé. Les racines sont le principal site de biosynthèse des TA chez les morelles, et la présence de nombreux TA divers a été prédite. Le chromatogramme complet de balayage Q1 est illustré à la figure 4A. Comme prévu, de nombreuses caractéristiques d’abondance variable ont été détectées sur les PrISs pour m/z 124 (figure 4B), m/z 122 (figure 4C), m/z 140 (figure 4D), m/z 156 (figure 4E) et m/z 138 (figure 4F). Beaucoup de ces TA étaient également acétylés ou tigloylés, ou dérivés de l’acide phényllactique/tropique, comme le montrent les nombreux signaux dans les chromatogrammes NLS de la figure 4G-I, respectivement.

Une feuille de calcul, fournie sous forme de fichier .xls (une feuille vide à l’usage du lecteur est le fichier supplémentaire 1, la racine de D. metel est dans le fichier supplémentaire 2), a été utilisée pour documenter d’abord quelles caractéristiques (masses ou r.t.s) semblaient similaires à TA (en utilisant les critères de l’étape 3.1). Ensuite, des fragments et des pertes neutres appartenant à ces caractéristiques ont été notés. La méthode est extrêmement sensible : les canaux PrIS ont même détecté facilement des TA de faible abondance qui ne produisaient pas de pics visibles sur les chromatogrammes correspondants. En utilisant les fragments et les pertes neutres, une structure pour l’alcaloïde pourrait alors être proposée en suivant l’étape 3.5.

La figure 5 donne un exemple d’utilisation des données spectrales pour annoter les alcaloïdes. Le chromatogramme complet de balayage Q1 pour la racine de D. metel se trouve à la figure 5A. Une fonctionnalité à 14,4 min a été sélectionnée ; le spectre de balayage Q1 (figure 5B) montre une masse parente de m/z 224 pour ce pic. Le spectre de balayage ionique du produit DD est illustré à la figure 5C. Le canal PrIS pour m/z 124 (Figure 5D) indique que l’ion 224 produit ce fragment (également visible dans le balayage ionique du produit DD). Le canal NLS pour 100 Da (pour détecter les TA tigloylés) signale également m/z 224 (également confirmé par le balayage ionique du produit DD). L’addition de la perte neutre et du fragment TA de plus faible masse (100 + 124 Da) est égale à la masse parente, 224, confirmant que le groupe tigloyl est la seule substitution ; une structure probable de cet alcaloïde est indiquée à la figure 5C. Pour les TA di- et tri-substitués, les masses de perte neutre observées ont été ajoutées à la masse TA la plus faible, puis une autre substitution a été proposée pour tenir compte de la masse restante : par exemple, m/z 222, avec des fragments TA disubstitués de 140 et 122 et une perte neutre de 100 Da, a une masse résiduelle de 100 (222-122 = 100), Il s’agit probablement d’un deuxième groupe de Tigloyl. Ce flux de travail peut être utilisé intuitivement pour le processus d’élimination : il est peu probable qu’une caractéristique dépourvue de fragments de tropane (même si elle peut perdre 60, 100 ou 166 Da) soit un TA. Dans un exemple de déréplication complète et rapide à l’aide de ce flux de travail, 71 TA distincts d’abondance et de polarité variables ont été identifiés dans la racine de D. metel , y compris plusieurs composés isomères (Fichier supplémentaire 2). Certains de ces composés avaient des groupes esters qui ne pouvaient pas être facilement attribués, et certains composés supplémentaires ont été signalés comme des TA potentiels, mais n’ont pas pu être annotés avec un niveau de confiance élevé.

Un extrait au méthanol/eau de graines de D. stramonium moulues a également été analysé. La figure 6A montre le chromatogramme de crête de base complet de Q1 pour la racine de D. metel. Le PrIS pour m/z 124 est illustré à la figure 6B et le PrIS pour m/z 122 est illustré à la figure 6C ; les autres chromatogrammes sont illustrés dans la figure supplémentaire 2A-F. La figure 6B indique un alcaloïde tropane monosubstitué très abondant à un r.t. = 12,6 min, probablement de l’hyoscyamine. La feuille de calcul montrant les annotations d’AT de départ est incluse dans le Fichier supplémentaire 3. Les performances de la méthode semblaient plus faibles avec cet échantillon particulier : deux caractéristiques très abondantes avec un m/z de 259 à des r.t.s de 8,5 et 10,2 mins ont donné des pics sur les chromatogrammes NLS pour 60 et 100 Da (Figure supplémentaire 2 D,E) avec une masse de m/z 260 (un isotope M+1) indiquée sur les spectres correspondants. Ces composés ne sont pas des TA, mais des fragments formés compatibles avec les alcaloïdes bêta-carboline27. Ils ne sont ni acétylés ni tigloylés, mais perdent 60 ou 100 de leur isotope M+1, ce qui rend leur apparition incorrecte sur ces deux canaux NLS. De plus, la scopolamine (r.t. = 10,5 min) a produit un fragment m/z 122 à partir de son pic isotopique m/z 305 M+1, un isotope du fragment m/z 121 attendu de la scopolamine. Même si ces méthodes utilisent des fonctions de désisotopation, certaines « fuites » d’isotopes sont possibles à ces concentrations élevées d’échantillons. Bien qu’il puisse s’agir d’un événement propre à l’instrument utilisé dans cette étude ou dans cet échantillon, il convient de le noter.

Quarante TA ont été annotés dans les graines de D. stramonium à l’aide de cette méthode, dont plusieurs qui semblent être glycosylés, perdant des masses de 162 (hexose), 146 (désoxyhexose) ou 132 Da (xylose ou un sucre similaire). Bien que des TA contenant de l’hexose aient été signalés chez Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 et Atropa25, il s’agit du premier rapport de TA contenant du désoxyhexose ou du xylose. Un TA avait un r.t. de 13,8 min (figure 7A) et une masse de m/z 436 (balayage Q1 de la figure 7B). Cette caractéristique produisait un signal sur le canal m/z 124, indiquant un TA monosubstitué (Figure 7D), mais ne produisait aucun signal sur aucun autre canal PrIS ou NLS. Le balayage ionique du produit DD (figure 7C) a indiqué le m/z attendu 124, soit une perte de 312 Da, peut-être 166 + 146 Da, par rapport à l’ion parent. Une spectrométrie MS/MS à haute résolution a été obtenue sur un instrument quadripolaire à temps de vol (spectre sur la figure 7E), qui a indiqué un fragment m/z 290, suggérant de l’hyoscyamine ou de la littorine glycosylée sur la partie hydroxyle ester avec du rhamnose ou un sucre similaire ; la masse précise mesurée était également très proche de la masse exacte calculée pour la rhamnosyl-hyoscyamine ou la littorine (structure de la figure 7E). En raison de sa structure et de son abondance sans précédent, cet alcaloïde mérite d’être isolé des graines de D. stramonium , un exemple qui démontre l’utilisation de cette méthode dans la découverte de nouveaux alcaloïdes.

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Figure 1 : Fragments et pertes pertinents observés dans la MS des TA. (A) Fragments caractéristiques (et leurs masses diagnostiques) formés à partir d’AT monosubstitués, disubstitués et trisubsitués, ainsi que des exemples représentatifs d’alcaloïdes dans chaque classe. (B) Pertes neutres courantes observées à partir de groupes esters dans les TA (et leurs masses diagnostiques). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Balayage des ions précurseurs de contrôle positif et des pertes neutres. Pour tous les chromatogrammes, l’axe X est le temps de rétention et l’axe Y est le nombre (abondance d’ions). (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme à crête de base, du mélange étalon d’alcaloïdes. Les structures des normes sont indiquées ; Les pics correspondants sont indiqués par des flèches rouges. (B-F) sont des chromatogrammes PrIS pour (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 et (F) 138. (G-I) Chromatogrammes NLS pour 60 Da (acétyle, G), 100 Da (tigloyl, H) et 166 Da (acide phényllactique/tropique, I). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Balayages de pertes d’ions précurseurs et de pertes neutres de contrôle négatif. Pour tous les chromatogrammes, l’axe X est le temps de rétention et l’axe Y est le nombre (abondance d’ions). (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme de la base, d’un extrait méthanol/eau de la feuille de S. lycopersicum. (B) Le chromatogramme PrIS pour m/z 124 ne montrant que deux caractéristiques non tropanes à r.t. 2,6 et 3,4 min. (C) Le chromatogramme PrIS pour m/z 122, à blanc sauf pour le bruit du détecteur. Les échelles utilisées sont les mêmes que celles de la figure 2 ; les chromatogrammes restants se trouvent dans la figure supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Application de la méthode MS/MS aux racines de D. metel var. 'fastuosa'. Pour tous les chromatogrammes, l’axe X est le temps de rétention et l’axe Y est le nombre (abondance d’ions). (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme à pic de base, d’un extrait méthanol/eau de racines de D. metel var. 'fastuosa'. (B-F) sont des chromatogrammes PrIS pour m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 et (F) 138. (G-I) sont des chromatogrammes NLS pour 60 Da (acétyle, G), 100 Da (tigloyl, H) et 166 Da (acide phényllactique/tropique, I). Notez l’abondance de signaux sur chaque chromatogramme correspondant à de nombreux TA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Application de la méthode combinée de balayage ionique du produit DD, de balayage d’ions précurseurs et de balayage à perte neutre pour proposer la structure d’un TA. (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme à pic de base, d’un extrait méthanol/eau de racines de D. metel var. 'fastuosa'. Un pic à r.t. = 14,4 min est indiqué par une flèche rouge. (B) Le Q1 (balayage de levé), avec une masse abondante de m/z 224 pour ce pic. Pour tous les spectres, l’axe X est la masse et l’axe Y est l’intensité. (C) Le balayage de l’ion produit DD, montrant la fragmentation de l’ion m/z 224, indiquant une perte de 100 Da et un fragment de m/z 124 (flèches rouges). Ce composé apparaît à la fois sur le canal (D) m/z 124 PrIS et (E) sur le canal 100 Da NLS, indiquant qu’il est à la fois monosubstitué et tigloylé (structure dans le panneau C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Application de la méthode MS/MS aux graines de D. stramonium. Pour tous les chromatogrammes, l’axe X est le temps de rétention et l’axe Y est le nombre (abondance d’ions). (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme de base à crête, d’un extrait méthanol/eau de graines de D. stramonium. (B) Le chromatogramme PrIS pour m/z 124 ; (C) représente le chromatogramme PrIS pour m/z 140. Les chromatogrammes restants se trouvent dans la figure supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Annotation d’un nouvel alcaloïde dans les graines de D. stramonium. Pour tous les chromatogrammes, l’axe X est le temps de rétention et l’axe Y est le nombre (abondance d’ions). (A) Le chromatogramme ionique total, en vue du chromatogramme à pic de base, d’un extrait méthanol/eau de graines de D. stramonium. Une caractéristique à r.t. = 13,7 min est indiquée. (B) Le Q1 (balayage d’arpentage) montrant une masse de m/z 436 pour ce pic. Pour tous les spectres, l’axe X est la masse et l’axe Y est l’intensité. (C) Le balayage de l’ion produit DD montrant la fragmentation de l’ion m/z 436. (D) Ce composé TA monosubstitué apparaît sur le canal m/z 124 PrIS. (E) Le spectre MS/MS à haute résolution pour ce nouveau TA, ainsi que les structures proposées et la masse exacte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Balayage supplémentaire des ions précurseurs de contrôle négatif et des pertes neutres. (A-C) Chromatogrammes PrIS pour m/z (A) 140, (B) 156 et (C) 138. (D-F) Chromatogrammes NLS pour 60 Da (acétyle, D), 100 Da (tigloyl, E) et 166 Da (acide phényllactique/tropique, F). Les échelles utilisées sont les mêmes que sur la figure 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Application de la méthode MS/MS aux graines de D. stramonium ; chromatogrammes supplémentaires. (A-C) sont des chromatogrammes PrIS pour m/z (A) 140, (B) 156 et (C) 138. (D-F) Chromatogrammes NLS pour 60 Da (acétyle, D), 100 Da (tigloyl, E) et 166 Da (acide phényllactique/tropique, F). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Tableur vierge utilisé pour les annotations d’alcaloïdes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Tableur d’annotations et de structures d’alcaloïdes pour les racines de D. metel var. 'fastuosa' . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Tableur d’annotations et de structures d’alcaloïdes pour les graines de D. stramonium. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Bien que les paramètres de l’instrument fournis dans le protocole permettent des performances satisfaisantes, l’utilisation réussie de cette méthode peut nécessiter une attention particulière ou une optimisation de plusieurs étapes critiques. Bien que le gradient de solvant HPLC fourni à l’étape 2.2 soit généralement approprié pour les alcaloïdes tropanes, il peut être nécessaire de le modifier en fonction du profil alcaloïde tropane de l’échantillon ou de l’espèce végétale examinée. Le volume d’injection de l’échantillon peut également être modifié en fonction de la sensibilité de l’instrument et de la façon dont la méthode est utilisée. Le profilage métabolique « profond » ou la déréplication doit utiliser un volume d’injection plus important (15 à 20 μL ont été utilisés dans cette étude), tandis que la simple détection d’alcaloïdes pourrait utiliser des volumes plus petits. Lors de l’utilisation de grands volumes d’échantillons, il faut veiller à (a) nettoyer régulièrement la source d’ions, (b) surveiller la colonne HPLC pour détecter les changements de pression ou les obstructions (une colonne de protection appropriée doit toujours être utilisée), (c) empêcher le transfert entre les échantillons, et (d) examiner les chromatogrammes pour détecter une potentielle « fuite isotopique » comme décrit ci-dessus. Les températures et les tensions de l’interface ne doivent pas être modifiées de manière significative par rapport à celles spécifiées dans la méthode afin d’éviter une fragmentation prématurée dans la source. De plus, bien qu’une tension de cellule de collision de 20 V soit recommandée, elle peut ne pas fournir un signal de chromatogramme optimal (ou des fragments de balayage ionique de produit DD diagnostiques) pour tous les TA. Certains instruments et fonctions MS ont une fonction de « rampe d’énergie de collision », ou la capacité de collecter des balayages à des énergies de collision multiples ou optimisées, ce qui pourrait également trouver une utilité dans une méthode comme celle-ci30.

Cette méthode MS elle-même est également facilement modifiable : alors que les esters tiglic, acétique et phényllactique/tropique sont courants chez les espèces de Datura, les modèles de substitution des esters TA peuvent être différents chez d’autres plantes ou échantillons. Les masses NLS peuvent être modifiées pour détecter d’autres groupes d’esters (par exemple, une perte de 74 Da pour les esters propioniques) ou potentiellement détecter des glycosylations (par exemple, une perte de 162 Da pour les hexoses). Les masses PrIS peuvent également être modifiées. Par exemple, un TA dans les deux échantillons de Datura (r.t. = 12,5 min ; voir le fichier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2) a été annoté comme norhyoscyamine ou norlittorine (hyoscyamine/littorine moins le groupe N-méthyle tropane) sur la base de ses fragments de balayage ionique produit DD (m/z 110 et 93) et correspond aux spectres de la littérature31; ce TA n’est apparu sur aucun des canaux PrIS du fragment tropane. Un canal pourrait être ajouté pour ces deux masses afin de détecter les nortropanes. Le fragment m/z 93 est également présent dans la plupart des TA monosubstitués17 ; l’ajout de ce canal pourrait fournir une confirmation supplémentaire de la présence d’un TA monosubstitué et aider à réduire les faux positifs.

En plus de son adaptabilité à différents types d’AT, l’un des principaux avantages de ce protocole (par rapport aux méthodes d’annotation d’alcaloïdes existantes) est sa rapidité. Selon la configuration de la méthode MS (et le temps d’exécution HPLC utilisé), toutes les données MS/MS d’un échantillon peuvent être collectées en 60 à 90 minutes. Par exemple, au cours de nos études, les PrIS TA mono- et di-substituées ont été intégrées dans une méthode, les PrIS TA trisubstituées étaient dans une autre méthode, et les NLS étaient dans une troisième (toutes les méthodes contenaient le balayage ionique du produit DD), pour un total de trois injections à trente minutes chacune. L’annotation complète de l’échantillon à l’aide des données MS/MS combinées est beaucoup plus rapide que l’examen manuel de chaque pic ou la collecte de balayages ioniques de produits individuels pour de nombreux pics d’intérêt. Cette méthode peut être utilisée sur n’importe quel instrument doté d’un balayage ionique produit, d’un PrIS et d’un NLS et peut être utilisée pour une évaluation qualitative rapide (c’est-à-dire si les TA sont présents ou absents ?), pour distinguer ou « empreindre » différents genres de plantes, espèces, variétés ou cultivars, organes ou stades de croissance, et pour comparer les TA observés à ceux rapportés (dans le cadre d’un flux de travail de déréplication). Comme démontré, le protocole peut également être utilisé pour la découverte de nouveaux TA comme pistes d’isolement, de purification ou d’essai biologique, ainsi que pour l’identification d’espèces et de tissus candidats à isoler. Cette méthode pourrait être utilisée dans les domaines des produits naturels et de la métabolomique, notamment pour aider à comprendre la biochimie des plantes et pour la découverte de médicaments à un stade précoce. D’autres applications pourraient être trouvées dans le domaine de la salubrité des aliments ou de la criminalistique (p. ex., détection d’AT dans les aliments, les suppléments ou les biofluides).

La méthode présente plusieurs inconvénients qui méritent d’être discutés. Tout d’abord, en fonction de l’instrument utilisé et de l’objectif de l’utilisation du protocole, un grand volume d’injection d’échantillon peut être nécessaire, ce qui peut entraîner des problèmes de performance de l’instrument et le risque de faux positifs dans certains cas (comme décrit ci-dessus). Deuxièmement, cette méthode a été développée sur un instrument QQQ à basse résolution, et des faux positifs pourraient résulter de la faible résolution (par exemple, la caractéristique contenant un fragment m/z 124 dans le témoin négatif qui n’est pas un TA). Un instrument à plus haute résolution offrirait une meilleure capacité de diagnostic, et des spectres MS/MS de masse précis devraient être obtenus pour tout nouvel alcaloïde proposé. Les inconvénients supplémentaires de cette méthode sont tout simplement les inconvénients de l’analyse MS/MS dans son ensemble. Bien que la MS/MS soit utile pour proposer des structures (« annotation » telle que désignée par l’Initiative32 des normes métabolomiques), elle ne fournit pas d’affectations concrètes de connectivité moléculaire (« identification »). Par exemple, dans les deux échantillons de Datura, nous avons trouvé plusieurs isomères d’un m/z 306 TA, qui semblaient avoir à la fois des fragments m/z 124 et m/z 140 (Fichier supplémentaire 2), ce qui rend difficile l’attribution définitive du modèle de substitution. Il pourrait s’agir d’un mécanisme de fragmentation non encore découvert, et une autre technique (comme la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire) pourrait être utile pour résoudre les ambiguïtés. Les méthodes basées sur la MS/MS ont souvent du mal à lutter contre l’isomérie : l’ester d’acide phényllactique littorine (ou ses dérivés) est difficile à distinguer de l’hyoscyamine (ester d’acide tropique), et d’autres plantes solanacées contiennent des TA substitués par les groupes isomères tigloyl, senecioyl et angeloyl33,34 ; En l’absence de normes, il peut être difficile, voire impossible, de distinguer ces composés. De plus, la méthode ne différencie pas les énantiomères (p. ex., 3,6- et 3,7-dihydroxytropane ; voir la figure 1 pour la numérotation) ou les régioisomères (p. ex., distinguer le 3-acétyle du 7-acétyle sans étalon). Nous avons attribué la plupart des tropanes monosubstitués comme 3-substitués sur la base de modèles antérieurs rapportés dans le genre Datura et d’autres plantes Solanacées17,35. Par conséquent, toute connaissance biochimique ou littérature sur l’organisme étudié (si disponible) doit toujours être consultée en même temps que toute analyse instrumentale.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention de recherche de la faculté (Northern Michigan University, attribuée à M.A.C.), une bourse de recherche de premier cycle (Northern Michigan University, attribuée à J.C) et le département de chimie. Les auteurs tiennent à remercier John Berger (NMU) pour son aide à la préparation des tissus végétaux, Hannah Hawkins (NMU) pour l’entretien et le dépannage de la LC-MS, et le Dr Ryan Fornwald et ses étudiants du CH 495 (Natural Products Synthesis) pour leur préparation du mélange d’acétyltropine. Les auteurs souhaitent également remercier le Dr Daniel Jones (Michigan State University) d’avoir acquis des spectres MS/MS à haute résolution.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétonitrile, Pour UHPLC, adapté à la spectrométrie de masseSigma-Aldrich900667Solvant HPLC
Gaz argonAirGasAR UHP300CID
Acide formique, 99 % pour l’analyseThermo ScientificAC270480010Additif HPLC
Support de colonnede protection Restek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58Colonne HPLC
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Spectromètre de masse ; nous avons exécuté le logiciel LabSolutions, qui est standard pour les instruments Shimadzu
Azote liquideAirGasNI 180LT22
Méthanol, pour HPLC/UHPLC/LCMSVWR BDH85800.400Pour la fabrication de solvant d’extraction
Microcentrifugeuse  ;VWR2400-37
Tubes de microcentrifugation, 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Mortier  ;Fisher ScientificFB961CPour le broyage des tissus végétaux
PilonFisher ScientificFB961MPour le broyage des tissus végétaux
Pipette 1000 mLGilson  ;
Pointe de pipette 1000 mLFisher scientific02-707-404
Tissus végétauxSources diversesN/APeut être n’importe quoi sauvage ou cultivé
Tubes coniques en polypropylène, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Glacière en polystyrèneULINES-18312Le type de glacières dans lesquelles les réactifs pour la biologie moléculaire sont expédiés serait
approprié Roc C18 3 & micro ; m, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315Colonne HPLC
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Colonne de garde
Agitateur à basculeThemo Scientific11-676-680
Kit de distribution de flacon à vis (9 mm)Fisher scientific13-622-190Flacons d’échantillonneur automatique LCMS
Seringue, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Filtre à seringue 0,45 & micro ; m  ;Avantor/VWR76479-008
Eau, pour chromatographie liquide et spectrométrie de masseJT Baker9831-03Pour la fabrication d’un solvant d’extraction
Solution d’eau, contient 0,1 % v/v d’acide formique, Pour UHPLC, adapté à la spectrométriede masse Sigma-Aldrich900687-1LSolvant HPLC
F144059M

Références

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