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Article de méthode

Modèle de pochite chez le rat après proctocolectomie et anastomose iléale-anale à l’aide de sulfate de dextran sodique

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DOI :

10.3791/66623

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31 mai 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la méthode d’établissement d’un modèle de pochite chez le rat. Le modèle de la poche iléale a été créé en effectuant une chirurgie de la poche iléale-anastomose anale (IPAA) à l’aide de techniques microchirurgicales. Après l’opération, le rat a été traité avec du sulfate de dextran sodique (DSS) à 4 % pendant 4 jours.

Résumé

La colite ulcéreuse (CU) est une maladie chronique à médiation immunitaire qui affecte l’ensemble du côlon et du rectum avec une évolution récurrente et rémittente, entraînant une morbidité à vie. Lorsque le traitement médical est inefficace, en particulier en cas d’hémorragie gastro-intestinale massive, de perforation, de mégacôlon toxique ou de cancérogenèse, la chirurgie devient la dernière ligne de défense pour guérir la colite ulcéreuse. La résection colorectale totale et l’anastomose anale de la poche iléale (IPAA) offrent les meilleures chances de traitement à long terme. La pochite est la complication postopératoire la plus fréquente et la plus gênante. Dans cette étude, la microchirurgie est utilisée pour créer un modèle de poche iléale chez des rats expérimentaux via la chirurgie IPAA. Par la suite, un modèle de pochite soutenue chez le rat est établi en induisant une inflammation de la poche iléale avec du sulfate de dextran sodique (DSS). L’établissement réussi de la poche chez le rat est validé par l’analyse de l’état général postopératoire, du poids, de la consommation de nourriture et d’eau, des données fécales, ainsi que de la pathologie tissulaire de la poche, de l’immunohistochimie et de l’analyse des facteurs inflammatoires. Ce modèle animal expérimental de la pochite fournit une base pour l’étude de la pathogenèse et du traitement de la maladie.

Introduction

La pochite est une inflammation non spécifique qui affecte la poche iléale et constitue une complication fréquente après une proctocolectomie totale et une anastomose anale de la poche iléale (IPAA) chez les personnes atteintes de colite ulcéreuse (CU)1,2,3. Cette affection a un taux d’occurrence relativement élevé, allant jusqu’à 50 %, et peut provoquer diverses manifestations cliniques, notamment la diarrhée, des douleurs abdominales, une perte de sang fécal et de la fièvre. La cause exacte de la pouchite reste insaisissable, bien que certains chercheurs pensent qu’un changement dans la flore de la poche peut déclencher une activation immunitaire et une inflammation ultérieure 4,5,6,7.

En raison des défis associés à la réalisation d’essais cliniques sur la pochite, les modèles animaux peuvent servir d’outils précieux pour étudier les médicaments et les mécanismes de la pochite. La création de poches iléales chez le rat suscite des inquiétudes croissantes, des rapports indiquant une possible inflammation8. Cependant, les recherches dans ce domaine restent rares en raison de la nature complexe du processus de fabrication, qui manque de directives claires 9,10. En 1998, Lichtman a été le premier à établir un modèle de poche iléale chez des rats Lewis et des rats Sprague-Dawley (SD) en effectuant une colectomie totale11. Ils ont observé une infiltration de macrophages, une ulcération de la muqueuse et une augmentation de la flore bactérienne anaérobie dans les intestins de ces rats, fournissant une base solide pour d’autres recherches sur l’inflammation de la poche iléale. Ce modèle expérimental de la pochite chez le rat imite étroitement les signes physiques et les mécanismes sous-jacents observés dans la pochite humaine.

Les modèles précliniques de colite ulcéreuse couramment appliqués comprennent les modèles DSS et TNBS. Le produit chimique inducteur de l’acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS) simule généralement la maladie de Crohn12. Le modèle DSS, respecté pour son efficacité, son profil d’innocuité et son prix abordable, est souvent utilisé comme un outil fiable pour l’induction de la CU en raison des symptômes évidents observés. Compte tenu de la colonisation du tissu de la poche, nous avons réussi à induire un modèle de pochite à l’aide de DSS13,14.

Dans la présente étude, la microchirurgie a été utilisée pour créer avec succès un modèle de poche iléale chez des rats expérimentaux via la chirurgie IPAA. Par la suite, un modèle de poche de rat soutenu a été établi en induisant une inflammation de la poche iléale avec le DSS. La précision pendant la chirurgie est essentielle pour une formation réussie du modèle, et les soins postopératoires sont également cruciaux. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la pathogenèse de la pochite, évaluer des agents thérapeutiques potentiels et approfondir notre compréhension de cette maladie complexe. L’étude rationalise le processus de fabrication de la poche iléale, réduisant la durée de l’opération et augmentant l’efficacité, établissant ainsi une base solide pour la recherche fondamentale sur les troubles postopératoires de la poche.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux politiques des comités d’éthique de l’hôpital général de l’Université de médecine de Tianjin. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 9 à 12 semaines, pesant environ 320 à 360 g, ont été utilisés pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Sélection et entretien des animaux

  1. Choisissez un animal en bonne santé (poids corporel de ~220-240 g).
  2. S’assurer qu’ils répondent aux critères d’un niveau spécifique exempt d’agents pathogènes (FPS)15 et qu’ils sont élevés de manière adaptative pendant au moins 2 semaines dans un environnement suffisamment ventilé (8 à 12 changements d’air par heure), doté d’une température confortable (20-25 °C), d’une humidité appropriée (40 % à 70 %), d’un bruit minimal (inférieur à 70 décibels) et d’un cycle de lumière naturelle (12 h de lumière et 12 h d’obscurité).
  3. Pendant cette période, logez-les dans des cages propres standard à une densité de trois à cinq par cage et changez la litière deux fois par semaine. Fournir un accès ad libitum à de la nourriture et de l’eau, ainsi qu’à des aliments d’entretien standard pour les rats de laboratoire.

2. Préparation préopératoire

  1. Choisissez un rat en bonne santé dont le poids corporel est d’environ 320 g à 360 g. Jeûnez le rat pendant 8 à 12 h avant l’opération et donnez-lui accès à une solution saline physiologique et à 5% de glucose dans un rapport de 1:1 pour une consommation volontaire.
  2. Préparez les instruments microchirurgicaux autoclavés (trempage préopératoire dans l’alcool pendant 1 h), un microscope, une table de dissection de rats, 8-0 Suture moléculaire élevée non résorbable, suture non résorbable 4-0, gaze stérile, cotons-tiges stériles, etc.

3. Mise en place du modèle de poche iléale du rat

  1. Injection intrapéritonéale d’une solution sodique de pentobarbital à 1 % à une dose de 6 mL/kg et infiltration incisionnelle d’une anesthésie locale avec 0,5 % de ropivacaïne pour anesthésier le rat. Maintenez le rat à une température confortable pendant l’anesthésie avec une lampe électrique.
  2. Effectuez une résection colorectale totale en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Fixez le rat en décubitus dorsal sur un banc anatomique en suivant un protocole d’anesthésie satisfaisant. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par un pincement des orteils. Utilisez une tondeuse à raser pour éliminer les débris de cheveux et appliquez une solution d’iodophore deux fois pour la stérilisation sur le terrain chirurgical.
    2. Faites une incision médiane, d’environ 6 cm de long, pour disséquer à travers la peau, le fascia de la ligne blanche et le péritoine, permettant l’entrée dans la cavité abdominale. À l’aide d’un écarteur, exposez la surface péritonéale et couvrez-la d’une gaze stérile inbibée de solution saline bactériostatique.
    3. Isoler le flux vasculaire du jéjunum terminal, ligaturer son origine à l’aide d’un 8-0 fil de suture, puis le sectionner. Mettez le moignon cæcal, situé à 1-2 cm de la valve iléo-ca-cale, au repos, puis sectionnez-le.
    4. Commencer la résection de l’hémicôlon droit, en ligaturant l’hémicôlon droit et la veine colique moyenne de manière conservatrice.
    5. Séparez davantage l’artère mésentérique inférieure et isolez l’artère rectale inférieure. Continuez l’isolement le long du rectum jusqu’à un intervalle équivalant à deux centimètres du bord anal. Réséquez obliquement le rectum distal à environ 45 degrés pour éviter la sténose postopératoire.
  3. Construction de la poche en J.
    1. À l’aide d’un scalpel microtome, séparez la section transversale de l’iléon terminal de l’intestin du mésentère, qui doit mesurer environ 6 à 7 cm.
    2. Pliez l’iléon terminal en forme de J pour créer une poche pour l’iléon. Effectuer une anastomose de la paroi postérieure via un point de couture. Augmentez la paroi antérieure à l’aide d’un point de Connell modifié et conservez un intestin approprié pour correspondre à la taille de la section transversale du moignon rectal distal.
    3. Renforcez le sac en forme de J avec 8-0 couture si nécessaire. La longueur du sachet en J doit être comprise entre 2,5 cm et 3,5 cm.
  4. Effectuer une anastomose iléale-anale, IPAA.
    1. Confirmer l’absence de torsion dans le mésentère et suturer les parois latérales de l’ouverture de la poche et la paroi latérale du moignon rectal à intervalles réguliers avec un 8-0 Fil de suture pour la traction.
    2. En fin de compte, appliquez une suture à verrouillage continu sur toute la couche sur les parois antérieure et postérieure.
    3. Vérifiez l’absence de saignement actif et nettoyez physiologiquement la cavité abdominale avec une solution saline normale. Fermez séquentiellement le muscle abdominal, le fascia et la peau avec des sutures 4-0.
  5. Effectuer une prise en charge postopératoire.
    1. Administrer du kétoprofène comme analgésie postopératoire (40 mg/kg, par voie sous-cutanée) à tous les rats après la fermeture abdominale. Assurez-vous que le rat est réchauffé à l’aide d’une lampe électrique jusqu’à ce que la restauration se produise.
    2. Limitez la consommation de nourriture de l’animal pendant une période minimale de 72 heures postopératoires pour réduire le risque d’occlusion intestinale. Permettre l’accès à un régime alimentaire à 5 % de glucose à volonté pour reconstituer rapidement l’énergie et les fluides corporels, et ajuster la fréquence des repas en fonction des schémas de défécation.
    3. Une semaine après l’opération, commencez par une alimentation limitée et augmentez progressivement la quantité consommée. Ensuite, fournissez aux rats de la nourriture régulière pour rongeurs à consommer librement, tout en tenant un registre quotidien de leur apport alimentaire, de leur consommation d’eau et de leur poids corporel.

4. Etablissement d’un modèle de pochite iléale chez le rat avec le DSS

  1. Effectuez le regroupement expérimental.
    1. Répartissez au hasard 12 rats qui ont subi une résection colorectale totale et une chirurgie IPAA dans le groupe IPAA (groupe A, n = 6) et le groupe de la pochite (groupe B, n = 6).
    2. Préparez une solution de SSD à 4 % en ajoutant 4 g de DSS à 100 ml d’eau pure, fraîchement préparée quotidiennement.
    3. Administrer le groupe IPAA et le groupe pochite avec de l’eau pure ou 4 % de DSS du 31e au 35e jour postopératoire, respectivement. Laissez les rats boire et manger librement de la nourriture pour rats pendant les quatre jours consécutifs d’administration.
  2. Effectuez l’échantillonnage du sac.
    1. Le matin du 35e jour, après l’opération, anesthésier les rats avec une injection intrapéritonéale d’une solution de pentobarbital sodique à 1 %, en leur administrant une dose de 6 mL/kg (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
    2. Sectionnez la poche perpendiculairement à la stomie de la poche jusqu’à la jonction des poches d’entrée et de sortie dans chaque groupe. Obtenez l’échantillon de la poche.
    3. Ouvrez le sac le long de la ligne de suture de la paroi antérieure et lavez le canal intestinal avec une solution saline.
    4. Placez un fragment de tissu de poche dans un tube de microcentrifugation et réfrigérez-le rapidement à -80 °C. Utilisez cette partie pour la détection ELISA des indicateurs inflammatoires. Fixez la section restante de la poche avec 10 % de formaldéhyde pour le marquage histopathologique et la coloration immunohistochimique.
    5. Enfin, euthanasier le rat par embolie gazeuse sous anesthésie profonde (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).

5. Analyse histologique

  1. Après avoir obtenu le tissu de la poche du rat, immergez-le dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h. Par la suite, procédez à la déshydratation et aux protocoles d’intégration. Sectionner le tissu traité pour l’examen histologique16.
  2. Appliquez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine pour identifier les différences histopathologiques entre les groupes. Examinez les échantillons au microscope et prenez des photos pour les documenter.

6. Dosage immunohistochimique

  1. Décortiquez et déshydratez soigneusement les sections de tissu. Ensuite, effectuez la récupération de l’antigène en refroidissant les sections dans une solution de citrate de sodium et en les bloquant avec du sérum bloquant pendant 20 min.
  2. Ensuite, exposez les tranches à l’anticorps anti-occludine primaire et incubez-les pendant la nuit à 4 °C. Ensuite, traitez-les avec des anticorps secondaires pendant 30 min avant de contre-marquer l’hématoxyline16.
  3. Une fois que les tranches ont séché, observez-les et photographiez-les au microscope optique.

7. Test ELISA

  1. 7.1 Hacher et homogénéiser les fragments de tissu dans le tampon de lyse à l’aide de la sonication pour assurer une homogénéisation complète. Utilisez le surnageant résultant pour la détection.
  2. Allouez des puits pour les blancs, les échantillons et les répétitions par groupe. Déterminer la concentration en protéines en lisant l’absorbance à 450 nm (valeur OD) et en effectuant une analyse de régression linéaire16.

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Résultats

Évaluation de l’état général de rats modèles de poche iléale après l’établissement
Après que l’opérateur ait réussi la courbe d’apprentissage chirurgical IPAA, les rats ont bien toléré la chirurgie, avec une durée chirurgicale de 192,94 min ± 27,15 min, et moins de complications postopératoires sont survenues. Au début de la période postopératoire, les rats ont connu une diminution de l’apport alimentaire, mais leur appétit préopératoire a été rétabli dans les 10 à 14 jours suivant la chirurgie. L’act...

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Discussion

La colite ulcéreuse (CU) est une inflammation intestinale chronique caractérisée par des douleurs épigastriques récurrentes, de la diarrhée et des selles sanglantes de mucus. Il affecte principalement le rectum et peut impliquer la progression du côlon à des degrés divers. La chirurgie joue un rôle crucial dans la prise en charge de la CU 17,18,19. Depuis que Parks et al.20

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Éthanol anhydreTianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdChineColoration de l’hématoxine-éosine Sulfate
dextran Sodium  ;  ; Yeasen  ;60316ES76Utilisé pour induire l’inflammation
Solution de formaldéhydeTianjin Zhiyuan Reagent CompanyChineGaze de coloration à l’hématoxine-éosine
JiangxiZhonggan Medical Equipment CompanyChineUtilisé pour la microchirurgie animale
HématoxylinePékin Zhongshan Jinqiao CompanyChineColoration à l’hématoxine-éosine
Interféron &gamma ;   ; Kit de réactifs de détectionCloud-cloneSEA049RaDétection des facteurs inflammatoires
Kit de détection Interleukin-10Cloud-cloneSEA056RaDétection des facteurs inflammatoires
détection Interleukin-17Cloud-cloneSEA063RaDétection des facteurs inflammatoires
Kit de détection Interleukin-6Cloud-cloneSEA079RaDétection des facteurs inflammatoires
IodophorTangpai Medical Equipment Co., LtdChineUtilisé pour la microchirurgie
animale Instruments de manipulation microscopiquesAesculapAllemagneUtilisé pour la microchirurgie animale
Occludinabcamab216327Test immunohistochimique
Aiguille à coudreYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdChineUtilisé pour la microchirurgie animale
facteur de nécrose tumorale &alpha ; Kit de réactifs de détectionCloud-cloneSEA133RaDétection des facteurs inflammatoires
Microscope chirurgical binoculaire pour deux personnesOPTONAllemagneUtilisé pour la microchirurgie animale
XyleneTianjin Yingda Rare and Precious Reagent FactoryChineColoration à l’hématoxine-éosine
de de la poche Kit de

Références

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  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
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