Method Article

Mise en charge cardiaque à l’aide de la pressurisation auriculaire gauche passive et de la postcharge passive pour l’évaluation du greffon

DOI:

10.3791/66624

⸱

August 2nd, 2024

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1Division of Cardiac Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Shriners Children's Boston, 3VentriFlo Inc

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit un système de perfusion cardiaque porcine ex vivo dans lequel la charge directe du ventricule gauche peut servir de technique d’évaluation de la santé du greffon tout en fournissant simultanément une évaluation holistique de la fonction du greffon. Une discussion sur la conception du système et les mesures d’évaluation possibles est également fournie.

Abstract

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La perfusion machine ex vivo ou perfusion machine normothermique est une méthode de conservation qui a acquis une grande importance dans le domaine de la transplantation. Malgré l’immense opportunité d’évaluation due à l’état de battement du cœur, la pratique clinique actuelle dépend de tendances métaboliques limitées pour l’évaluation du greffon. Les mesures hémodynamiques obtenues à partir de la charge ventriculaire gauche ont suscité beaucoup d’attention dans le domaine en raison de leur potentiel en tant que paramètres d’évaluation objectifs. En effet, ce protocole offre un moyen facile et efficace d’incorporer des capacités de charge aux systèmes de perfusion de Langendorff établis par le simple ajout d’un réservoir supplémentaire. De plus, il démontre la faisabilité d’utiliser la pressurisation auriculaire gauche passive pour le chargement, une approche qui, à notre connaissance, n’a pas été démontrée auparavant. Cette approche est complétée par une postcharge passive de base Windkessel, qui agit comme une chambre de conformité pour maximiser la perfusion myocardique pendant la diastole. Enfin, il met en évidence la capacité de capturer des paramètres fonctionnels pendant la charge cardiaque, y compris la pression du pouls ventriculaire gauche, la contractilité et la relaxation, pour découvrir les déficiences de la fonction du greffon cardiaque après de longues périodes de conservation (˃6 h).

Introduction

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La transplantation cardiaque orthotopique est la référence actuelle en matière de soins pour l’insuffisance cardiaque en phase terminale1. Malheureusement, le domaine est considérablement limité par une grave crise de pénurie de donneurs, ce qui fait que seulement 2 000 transplantations cardiaques sont effectuées chaque année alors que plus de 20 000 personnes bénéficieraient de la procédure vitale2. Cette pénurie d’organes devrait s’aggraver car la prévalence de l’insuffisance cardiaque aux États-Unis seulement devrait dépasser les 8 millions d’individus d’ici 20303. L’augmentation constante du temps de survie sur les listes d’attente - en raison de l’amélioration de la prise en charge médicale, des progrès de l’assistance circulatoire mécanique et des modifications apportées à la politique d’attribution de l’UNOS - a entraîné une nouvelle augmentation du nombre de patients nécessitant une transplantation à un moment donné 4,5.

La perfusion machine ex vivo ou perfusion machine normothermique (NMP) est une modalité de préservation qui a facilité l’expansion du pool d’approvisionnement en permettant l’utilisation d’organes donnés après la mort circulatoire (DCD) tout en réalisant une certaine extension des temps de conservation 5,6,7,8. Contrairement à l’entreposage frigorifique statique, l’étalon-or actuel en matière de préservation, la NMP maintient les organes dans un état métaboliquement actif, ce qui crée la possibilité d’une surveillance en temps réel et d’une évaluation des greffons, devenant ainsi la méthode de conservation standard pour les greffons DCD 8,9. Cependant, les dispositifs NMP actuellement utilisés en clinique sont limités au mode de perfusion de Langendorff, qui ne dispose pas de mesures quantitatives pour prédire les résultats de la transplantation et est incapable de capturer les paramètres fonctionnels6. Par exemple, l’accumulation de lactate pendant la perfusion de Langendorff a été désignée comme le meilleur prédicteur métabolique des résultats post-transplantation et est actuellement utilisée en milieu clinique comme indicateur de la santé du greffon cardiaque10. Cependant, même en tant que meilleur biomarqueur d’évaluation, il ne parvient pas à anticiper de manière fiable le besoin d’assistance circulatoire mécanique après la transplantation11,12. De même, les capacités prédictives des paramètres hémodynamiques couramment utilisés (c’est-à-dire la pression aortique et le débit sanguin coronaire) sont largement limitées par la nature rétrograde des configurations cliniques actuelles pour la perfusion de machinescardiaques 9.

L’élaboration de protocoles d’évaluation pour une détermination précise de la santé des greffons cardiaques pendant la PMN aurait un impact immense sur le terrain, au-delà de l’amélioration des résultats post-transplantation. Des outils prédictifs objectifs permettraient d’évaluer de manière fiable et d’utiliser probablement des organes critères marginaux ou étendus (c’est-à-dire des temps d’ischémie prolongés chauds (> 30 minutes) et froides (> 6 heures), une augmentation de l’âge du donneur (> 55 ans), d’autres comorbidités, etc.) chez les donneurs de TDC et de mort cérébrale (DBD) qui sont actuellement rejetés pour la transplantation en raison de critères de sélection stricts13. En permettant l’utilisation de cœurs marginaux, la NMP pourrait faciliter une augmentation de l’approvisionnement en organes, car on estime qu’une transplantation réussie de la moitié des cœurs actuellement inutilisés serait suffisante pour éliminer la liste d’attente cardiaque d’ici 2 à 3 ans14. Les mesures hémodynamiques obtenues à partir de la charge ventriculaire gauche au cours de la NMP ont suscité une attention considérable dans le domaine en raison de leur potentiel en tant que paramètres d’évaluation objectifs. Des études antérieures ont démontré que ces paramètres, tels que la pression du pouls ventriculaire gauche, la contractilité et la relaxation, sont plus révélateurs de la fonction du greffon cardiaque que des tendances métaboliques 15,16,17.

En effet, des efforts ont été consacrés à l’élaboration et à l’identification de méthodes de chargement optimales afin de maximiser la précision de l’évaluation. Grâce à ces efforts, d’autres groupes ont identifié le mode de perfusion aortique le plus pertinent pendant la charge, où une corrélation plus forte entre les paramètres hémodynamiques et la fonction post-transplantation a été observée lors de la mise en œuvre d’une postcharge passive (c’est-à-dire pas de perfusion rétrograde à l’aorte pendant la charge) par rapport à la postcharge assistée par pompe (c’est-à-dire une perfusion rétrograde à l’aorte pendant la charge)18. Cela indique que la perfusion coronaire assistée masque probablement des déficiences fonctionnelles. Des études antérieures ont réussi à incorporer des postcharges passives dans des configurations de perfusion en mettant en œuvre des systèmes qui imitent l’effet Windkessel 18,19,20. L’effet Windkessel aide à atténuer la fluctuation de la pression artérielle, à maintenir un flux sanguin continu vers les tissus et à améliorer la perfusion coronaire. Ce protocole permet d’obtenir la postcharge passive basée sur Windkessel à l’aide d’un sac intraveineux (IV) modifié enfermé dans deux plaques à ressort, où la perfusion coronaire dépend exclusivement de l’éjection cardiaque (brevet en instance).

L’utilisation de la pressurisation passive de l’oreillette gauche (c’est-à-dire la pressurisation dépendante de la gravité) pendant le chargement, bien qu’elle soit courante dans les perfusions cardiaques chez les petits animaux, est rarement utilisée dans le chargement des grands cœurs 21,22,23. Au lieu de cela, la grande majorité des méthodes rapportées dans la littérature reposent sur des pompes secondaires pour la pressurisation de l’AL 18,24,25,26,27,28. La pressurisation de l’AL à travers un réservoir dépendant de la gravité, plutôt que par pompe, simplifie considérablement la mise en œuvre des protocoles de chargement. L’utilisation de la gravité fournit une source de pression fixe et constante, ce qui réduit considérablement le besoin de systèmes de contrôle complexes pour obtenir et maintenir une pressurisation adéquate de l’AL. De plus, grâce à cette approche de pressurisation, la nécessité d’une pompe secondaire est éliminée, ce qui facilite l’incorporation des capacités de charge dans les configurations Langerdoff actuelles, car seul un réservoir supplémentaire est nécessaire. L’intégration des capacités de charge dans les systèmes de perfusion mécanique utilisés en clinique amplifierait l’application des dispositifs de NMP cardiaque en facilitant l’évaluation détaillée des greffons cardiaques pendant la période de conservation. En effet, il s’agit de maximiser l’utilité d’un système qui représente un engagement financier important pour les soins aux patients en raison du transport et de l’utilisation des appareils29.

Ce protocole démontre la faisabilité d’utiliser à la fois la postcharge passive et la pressurisation passive de l’AL pendant la charge ventriculaire gauche. Grâce à la validation de la postcharge passive/pressurisation de l’AL en tant que méthode de chargement, ce protocole fournit également un moyen facile et efficace d’incorporer les capacités de charge dans les systèmes de perfusion de Langendorff établis. Il est important de noter qu’il met en évidence la capacité de l’évaluation fonctionnelle à découvrir des différences entre les cœurs viables et les cœurs défaillants après de longues périodes de conservation (˃6 h).

Protocol

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Cette étude a été menée conformément aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), du Massachusetts General Hospital et de Jove. Des cœurs (170 à 250 g) ont été récoltés sur des porcs Yorkshire (30 à 35 kg, âgés de 3 à 4 mois, mixtes) à l’aide d’un modèle de don après mort cérébrale et perfusés rétrogradement (Langendorff) pendant 6 heures avant le chargement. Tous les greffons ont été exposés à un temps d’ischémie à froid d’environ 1h pendant l’instrumentation.

1. Conception du système

  1. Vérifiez que le système est composé d’une chambre d’orgue (11,046 pouces x 7,595 pouces x 3,095 pouces), de deux réservoirs (4 L et 1 L), d’un oxygénateur à double enveloppe et d’un sac Windkessel (WB). Vérifiez que les deux réservoirs contiennent un antimousse intégré, qui élimine la mousse.
  2. Vérifiez que les composants sont solidement reliés à l’aide d’un tube en silicone, le réservoir plus petit, le WB et la chambre de l’organe étant dans deux configurations différentes (Figure 1A) en fonction de la modalité de perfusion (c’est-à-dire Langendorff par rapport à la charge).
    1. Connectez la base de la chambre de l’orgue au sommet du grand réservoir (veineux) à l’aide d’un tube de 3/8 de pouce. Placez le grand réservoir sous la chambre de l’orgue pour permettre à la gravité de faire circuler le perfusat de la chambre au réservoir.
    2. Connectez le fond du grand réservoir à l’orifice d’entrée de la tête de pompe à l’aide d’un tube de 3/8 de pouce.
    3. Connectez l’orifice de sortie de la tête de pompe à un tube de 3/8 de pouce équipé d’un réducteur de 3/8 de pouce à 1/4 de pouce et d’un tube de 1/4 de pouce à l’autre extrémité. Connectez le 1/4 de pouce à l’orifice d’entrée de l’oxygénateur.
    4. Installez l’orifice de sortie de l’oxygénateur avec un tube de 1/4 de pouce avec un connecteur en Y à l’extrémité. Montez les deux extrémités du connecteur en Y avec un tube de 1/4 de pouce.
    5. Séquence 1 - Schéma d’écoulement des perfusats pendant la perfusion de Langendorff (ligne pointillée bleue sur la figure 1A)
      1. Installez la première extrémité du connecteur en Y avec un expanseur de 1/4 pouce à 3/8 de pouce avec une connexion Luer intégrée. Connectez le tube de 3/8 de pouce au premier port au bas du WB. Fixez une valve Luer à trois voies à la connexion Luer de l’expanseur et utilisez-la pour l’administration d’adénosine goutte à goutte.
    6. Séquence 2 - Schéma d’écoulement du perfusat pendant la perfusion chargée (ligne pointillée orange sur la figure 1A)
      1. Fixez la deuxième extrémité du connecteur en Y au sommet du plus petit réservoir (de chargement). Fixez une pince Hoffman au tube et utilisez-la pour contrôler le remplissage du réservoir.
      2. Placez une conduite de trop-plein du haut du réservoir de chargement vers le réservoir plus grand.
      3. Montez le fond du réservoir de chargement avec un tube de 1/4 de pouce et connectez-vous à un orifice à la base de la chambre de l’orgue. Ajoutez une valve Luer à trois voies à mi-chemin de la longueur du tube pour l’administration de l’adénosine et une valve unidirectionnelle juste avant d’atteindre la chambre de l’organe.
      4. Fixez l’autre extrémité de l’orifice de la chambre de l’organe à une canule à angle droit.
    7. Placez le sac Windkessel (WB) directement au-dessus de la chambre de l’orgue. Installez le deuxième orifice de trop-plein au bas du WB avec un tube de 3/8 de pouce et connectez-vous à n’importe quel orifice d’entrée du réservoir veineux. Fixez une pince Hoffman et fermez-la complètement pour arrêter le fluide à travers cet orifice pendant Langendorff et ajustez-la en mode chargé pour moduler les pressions aortiques.
    8. Connectez une valve Luer à trois voies à l’orifice de trop-plein en haut du WB et utilisez un tube de 1/4 de pouce pour connecter le WB à n’importe quel orifice d’entrée dans le réservoir veineux. Fixez une pince Hoffman au tube de 1/4 de pouce. Gardez la pince complètement fermée pendant la perfusion de Langendorff et ajustez-la pendant le mode de chargement pour moduler les pressions aortiques.
    9. Connectez le troisième orifice de sortie sur le WB au port aortique sur la chambre de l’organe à travers le tube de 3/8 de pouce, avec une interruption dans les 3/4 inférieurs de la longueur pour une sonde de température.

2. Préparation du système de perfusat

  1. Préparez un perfusat de base composé de 0,96 % de tampon Krebs-Henseleit, de 9,915 mM de Dextran, de 25 mM de bicarbonate de sodium, de 1,054 mM d’albumine sérique bovine, de 1 % de Pen Strep, de 0,13 % d’insuline, de 0,02 % d’hydrocortisone, de 0,5 % d’héparine et de 2,75 mM de chlorure de calcium. Porter le volume à 4 L avec de l’eau distillée.
  2. Configuration du système de perfusion
    1. Rincez tous les tubes, composants du système et réservoirs avec de l’eau distillée et rebranchez-les dans le bon ordre (Figure 1A).
    2. Placez le sac Windkessel entre deux plaques acryliques et serrez-le avec la configuration à vis et ressort (Figure supplémentaire 1).
    3. Fixez une valve Luer à trois voies à la connexion Luer de l’orifice aortique et de l’orifice auriculaire de la chambre de l’organe (Figure 1B). Connectez deux capteurs de pression à la boîte de l’organe, l’un au niveau de la valve reliée au port aortique en haut de la chambre de l’organe, et l’autre au niveau de la valve connectée au port auriculaire au bas de la chambre de l’organe.
    4. Calibrez les capteurs de pression en les ouvrant à l’air (pression de 0 mmHg) et en réglant cette lecture sur 0 dans l’appareil d’enregistrement.
    5. Connectez deux capteurs de débit à la tubulure du système. Connectez le capteur mesurant le débit aortique au tube de 3/8 de pouce reliant le WB au port aortique. Connectez le capteur de mesure du débit auriculaire au tube reliant le réservoir de chargement à l’orifice auriculaire.
    6. Connectez une sonde de température au tube de 3/8 de pouce reliant le WB au port aortique. Connectez un tube de désaération au troisième orifice de la valve fixé à l’orifice aortique et maintenez-le ouvert en tout temps. Connectez l’autre extrémité de la conduite à tout afflux du réservoir veineux.
    7. Connectez l’échangeur de chaleur à l’oxygénateur et réglez-le à 38 °C. Connectez la conduite d’oxygène à 100 % à l’orifice d’entrée de gaz de l’oxygénateur. Allumez l’oxygène à 0,5 L/min.
  3. Amorçage du système
    1. Ajoutez 2 L de perfusate dans le système à l’aide de la chambre de l’organe. Allumez la pompe pulsatile et laissez le perfusat circuler (en sautant le réservoir de chargement) jusqu’à ce que le perfusat soit oxygéné à un pO2 minimum de 400 mmHg et que la température ait atteint ~35 °C.
    2. Laissez le perfusat circuler et remplissez tous les composants du système pour éliminer l’air. Massez les tubes contenant les bulles d’air restantes pour les éliminer. Ensuite, éliminez tout air emprisonné dans l’orifice aortique en augmentant la pression en obstruant partiellement l’écoulement du fluide et en augmentant le débit de la pompe. Cette augmentation de la pression forcera l’air à travers le tube de purge/désaération.
    3. Laissez le perfusat circuler jusqu’à ce qu’il atteigne la température souhaitée (37 °C, surveillée en permanence par une sonde de température), effectuez une première évaluation des paramètres biochimiques pour garantir une concentration correcte en ions (tableau 1) et une oxygénation adéquate.
      REMARQUE : Lisez les niveaux d’ions et de pH après que la solution a été portée à température (37 °C) et a été correctement oxygénée.

3. Obtention d’un greffon cardiaque

  1. Animaux sédatifs avec une injection intramusculaire d’atropine (0,04 mg/kg), de télazol (4,4 mg/kg) et de xylazine (2,2 mg/kg).
  2. Une fois sous sédation, transférez les animaux dans la salle d’opération et obtenez un accès veineux à l’aide d’une ligne IV placée dans l’une ou l’autre oreille.
  3. Administrer un bolus de propofol (0,16-0,33 mg/kg) par voie intraveineuse et tester les stimuli nocifs 3 minutes après l’injection. S’il n’y a pas de réflexes, intuber l’animal et maintenir l’anesthésie par inhalation continue d’isoflurane (3 % à 5 %) et de fentanyl par voie intraveineuse (5 à 20 μg/kg/h) au besoin.
  4. Une fois intubé, placez un brassard de pression dans l’un des membres avant et connectez un capteur ECG à l’apex de la lèvre inférieure pour surveiller la saturation en oxygène.
  5. Initiez une perfusion saline et administrez-la par la voie intraveineuse de l’oreille. Placez un champ chirurgical sur la face ventrale de l’animal.
  6. Administrer un bolus de citrate de fentanyl (5 μg/kg) par voie intraveineuse en préparation de la sternotomie.
  7. Faites une incision verticale entre l’encoche sternale et le xiphoïde à l’aide d’un scalpel à 10 lames (~25 cm). Après l’incision, utilisez une électrocautérisation pour diviser la graisse sous-cutanée et le fascia jusqu’à ce qu’ils atteignent le sternum.
  8. Une fois exposé, séparez le péricarde adhérent du sternum à l’aide d’une dissection émoussée au doigt au niveau de la face caudale du sternum. Pour ce faire, placez votre doigt sur la face dorsale du sternum et séparez tout tissu adhérent entre le sternum et les viscères.
  9. Insérez un ciseau à la face caudale du sternum. Tout en appliquant une force vers le ciel au ciseau, utilisez un maillet pour faire avancer le ciseau à travers l’os sternal.
  10. Une fois la sternotomie médiane terminée, déterminée par la séparation complète du sternum (de la xiphoïde à l’encoche sternale), placez un écarteur sternal et ouvrez-le jusqu’à l’exposition complète.
  11. Inciser le péricarde crânien avec des ciseaux de Metzenbaum jusqu’à ce que l’aorte et l’artère pulmonaire soient visibles.
  12. Placez deux sutures de cordon de bourse (4-0 Prolene) sur l’aorte et fixez-les à l’aide d’un garrot. Veillez à ce que les sutures traversent la couche médiane de l’aorte mais pas la lumière. Les sutures superficielles ne parviendront pas à maintenir la canule de la racine aortique en place, et les sutures profondes feront saigner l’aorte.
  13. Administrer un bolus d’héparine (100 U/kg) par l’oreille IV et laisser circuler pendant 3 min.
  14. Insérez une canule de racine aortique 9F perpendiculaire à l’aorte entre les sutures du cordon de la bourse et fixez-la en serrant doucement le collet du garrot. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite autour du site de canulation. Laissez la ligne de cardioplégie de la canule de la racine aortique être désaérée en laissant le sang s’écouler de l’aorte.
  15. Connectez un sachet de solution cardioplégique à la connexion Luer Lock. Pressurisez le sac de cardioplégie à l’aide d’un sac de pression pour obtenir une concentration de 80 mmHg pendant le rinçage. Connectez une pompe péristaltique à la deuxième ligne de la canule de la racine aortique et utilisez-la pour extraire 1 L de sang directement de l’aorte.
  16. Séparez les globules rouges à l’aide d’un dispositif de récupération du sang (les globules rouges sont centrifugés et lavés avec une solution saline). Ajoutez des globules rouges dans le système de perfusion une fois qu’il a atteint la température souhaitée.
  17. Une fois qu’une quantité suffisante de sang est prélevée, utilisez une croix transthoracique pour clamper l’aorte et ouvrir la ligne de cardioplégie pour rincer l’organe.
  18. Immédiatement après l’initiation de la clampage croisée et de la chasse d’eau, ventilez le cœur par une incision de 5 cm sur l’appendice auriculaire gauche et en sectionnant complètement la veine cave inférieure. Ajoutez de la glace dans la cavité thoracique à ce moment pour aider à réduire la température de l’organe.
  19. Après une ventilation réussie, sévère ou attachez la veine cave supérieure pour empêcher le sang chaud de la tête d’atteindre le cœur refroidi.
  20. Une fois que le cœur a été rincé avec 1 L de solution de cardioplégie, divisez les gros vaisseaux, y compris l’aorte, l’artère pulmonaire principale, la veine cave supérieure et inférieure et les veines pulmonaires bilatérales. Celle-ci complète l’explant cardiaque. Retirez le cœur de la cavité.
    REMARQUE : Maintenez autant de longueur que possible des gros vaisseaux attachés à la greffe. Coupez les veines pulmonaires aussi près que possible des poumons.
  21. Enveloppez l’organe dans une éponge de laparotomie et placez-le sur de la glace.

4. Préparation du greffon

  1. Coupez les branches de l’arc aortique pour créer une voie d’évacuation. Insérez la canule aortique à travers ce faisceau et fixez-la à l’aide d’une attache zippée et d’une suture en soie 4-0 (Figure 2).
  2. Placez un fil de stimulation bipolaire sur la paroi postérieure du ventricule droit. Coupez les veines pulmonaires pour former une seule voie d’entrée dans l’oreillette gauche.
  3. Créez deux sutures proline 4-0 à cordon de bourse dans le périmètre de l’oreillette gauche. Fixez les sutures avec des collets à garrot et laissez-les détachées jusqu’au chargement.
  4. Fermez l’appendice de l’oreillette gauche à l’aide d’une simple suture continue (4-0 Prolene). Notez le poids cardiaque initial.

5. Renaissance de la greffe cardiaque

  1. Clampez le tube de 3/8 de pouce juste avant l’orifice aortique pour arrêter l’écoulement du perfusat. Positionnez le cœur avec la paroi postérieure face à l’opérateur. Inclinez la chambre de l’orgue à environ 20°.
    REMARQUE : Cette position de la perfusion du greffon est choisie pour augmenter le drainage passif et est cohérente avec les données publiées précédemment démontrant une amélioration significative de la fonction par rapport à la suspension26.
  2. Placez la canule aortique à un angle de 90° par rapport à l’orifice aortique et dégrafez lentement la ligne aortique. Désaérer la canule aortique par l’écoulement progressif de perfusate dans celle-ci.
  3. Diminuez lentement l’angle de la canule aortique jusqu’à ce qu’elle soit alignée avec le port aortique et complètement connectée à la ligne aortique.
  4. Une fois complètement connecté, massez doucement le cœur par intermittence pour éviter la distension due au remplissage ventriculaire gauche. Pendant cette période, ventilez le ventricule gauche par l’oreillette gauche ouverte.
  5. En même temps, surveiller les pressions aortiques et les maintenir dans la plage acceptable (30 à 40 mmHg).
  6. Lancez l’acquisition des données et démarrez l’écoulement de l’adénosine à un débit de 333 uL/min
    REMARQUE : L’adénosine (2 mg/mL) est ajoutée au protocole de perfusion pour imiter les conditions actuelles de perfusion clinique. Cependant, il est important de souligner que la vasodilatation associée peut exacerber l’œdème organique indésirable 30,31,32.
  7. Connectez les fils de stimulation au boîtier de stimulation et réglez-le sur 60 bpm comme stimulation de secours.
  8. En cas de fibrillation, défibrillez le cœur à l’aide de palettes de 30 J. Délivrez autant de chocs que nécessaire jusqu’à l’obtention de contractions rythmées.
  9. Une fois qu’un rythme organisé est présent (rythmé ou intrinsèque), arrêtez la ventilation manuelle et placez les électrodes ECG directement sur le cœur à l’aide d’aiguilles à crochet.
  10. Serrez les vis du sac Windkessel jusqu’à ce que la forme d’onde affichée par le capteur de pression aortique imite une onde sinusoïdale. Perfuser le cœur en configuration Langendorff pendant 6 h comme décrit précédemment33.

6. Chargement du greffon cardiaque

  1. Connectez la canule à angle droit à l’orifice auriculaire de la chambre de l’organe. Une fois connecté, clampez la canule et laissez le fluide entrer dans le réservoir de chargement en relâchant la pince Hoffman dans la ligne entre l’oxygénateur et le réservoir de chargement.
  2. Remplissez le réservoir de chargement jusqu’à ce que la pression atteigne 15 - 20 mmHg. Augmentez le débit de la pompe pour maintenir la pression aortique et auriculaire.
  3. Insérez la moitié de l’embout métallique à angle droit dans l’oreillette gauche avec l’embout pointant vers l’appendice. Ce placement favorise le plus systématiquement la compétence de la valve mitrale.
  4. Insérez le capteur de pression à l’intérieur du ventricule gauche pour l’enregistrement de la pression ventriculaire gauche. Relâchez la pince de la canule et laissez l’oreillette gauche se remplir.
  5. Une fois désaéré, utilisez les sutures et les collets à garrot précédemment placés pour fermer complètement l’ouverture de l’oreillette gauche. Ajustez la canule et les collets au besoin pour minimiser les fuites de liquide.
  6. Après avoir fixé la canule dans l’oreillette gauche, arrêtez complètement la perfusion rétrograde vers l’aorte en serrant la ligne de l’oxygénateur à la WB.
  7. Déplacez la goutte d’adénosine de la ligne menant au WB vers la ligne entre le réservoir de chargement et l’orifice auriculaire.

7. Fin de la perfusion

  1. Enregistrez les lectures biochimiques, la fréquence cardiaque, le débit aortique/auriculaire et les pressions toutes les 30 minutes pendant la durée de l’expérience (10 h). Obtenez des lectures biochimiques de la ligne auriculaire pour la mesure de l’écoulement entrant et directement de l’artère pulmonaire pour les lectures de l’écoulement sortant.
  2. À la fin de la perfusion, arrêtez l’acquisition de données, retirez le cœur et jetez-le.
  3. Mobilisez les parties non fixes du système dans un grand évier, démontez, rincez et nettoyez avec de grandes quantités d’eau.
  4. Une fois qu’aucun reste de sang n’est visible dans les composants, réassemblez le système. Ajoutez de grandes quantités d’eau au système à travers la chambre de l’orgue et environ 100 ml de détergent alcalin liquide pour faire circuler avec de l’eau.
  5. Une fois que le détergent a été bien mélangé avec l’eau, clampez les conduites du système pour maintenir tous les réservoirs remplis de la solution détergente.
  6. Débranchez l’oxygénateur du reste du système et rincez à nouveau à l’eau pour éliminer tout savon.
  7. Une fois le savon complètement éliminé, séchez l’oxygénateur en soufflant de l’air à travers le fluide entrant au taux le plus élevé possible.

Results

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Les cœurs de 4 porcs Yorkshire (30 à 35 kg) ont été récoltés et conservés via Langendorff NMP pendant 6 heures avant 4 heures de chargement continu. Cette condition expérimentale a été choisie puisque 6 h est la durée moyenne de conservation clinique (5,1 ± 0,7 h)34. Grâce à l’ajout de 4 heures supplémentaires de charge continue (total de 10 h de temps ex vivo ), un certain degré d’insuffisance cardiaque était attendu, car une corrélation claire entre le temps de perfusion et le déclin de la fonction myocardique a déjà été signalée35. En tant que tel, cela a été l’occasion de souligner l’importance des paramètres fonctionnels pour l’évaluation des greffes et leur capacité à discerner les cœurs viables et défaillants. À ce titre, la plupart des mesures basées sur Langendorff n’ont indiqué aucune différence perceptible dans la viabilité entre les greffons cardiaques, la résistance vasculaire (CVR, Figure 2C), le taux d’absorption d’oxygène (OUR, Figure 2D), l’accumulation de lactate (Figure 2E), la consommation de glucose (Figure 2F) et l’accumulation de potassium (Figure 2G) étant non statistiquement différents pendant toute la durée de la perfusion. De même, aucune différence n’a été observée dans le gain de poids des greffons (Figure 2H). Cependant, une baisse constante de la fréquence cardiaque a été observée pour les greffes défaillantes après 2 h de temps de charge (Figure 2A), l’aire sous la courbe étant non statistiquement différente jusqu’à 3 h de perfusion (Figure 2B). De plus, les mesures dépendantes de la charge présentées dans la figure 3 suggèrent une perte de la fonction cardiaque dès 30 minutes après le début du temps de chargement, la mesure de la contractilité (dP/dtmax) étant la première mesure à indiquer une perte de fonction (figure 3C). À l’instar de la fréquence cardiaque, une baisse constante de la pression du pouls ventriculaire gauche (Figure 3A) a été observée après 2 h de perfusion chargée, avec des différences statistiquement significatives entre la pression du pouls des greffons (Figure 3B) et la relaxation (dP/dtmin, Figure 3D) observées après 1,5 h de perfusion.

figure-results-1
Figure 1 : configuration du système de perfusion. (A) Configuration de perfusion. Les lignes noires indiquent l’écoulement du perfusat pendant les deux modalités de perfusion. La ligne pointillée bleue indique le débit de perfusat pendant la perfusion de Langendorff seulement, et les lignes orange indiquent le débit de perfusat pendant la perfusion de charge. (B) Emplacement des capteurs de pression aortique (ligne continue) et auriculaire (ligne pointillée). Étant donné que le capteur de pression auriculaire est situé dans l’espace sous l’oreillette, la différence de hauteur a été prise en compte pour une pressurisation correcte de l’AL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Indicateurs d’évaluation conventionnels. Les métriques sont notées conventionnelles si leur acquisition est possible pendant la perfusion de Langendorff. (A) La fréquence cardiaque a été calculée à partir des ondes de pression obtenues à l’aide du capteur de pression intraventriculaire gauche. Cependant, comme cette métrique peut facilement être calculée à partir de traces ECG, également disponibles lors de Langendorff, elle est considérée comme une métrique conventionnelle. La ligne continue est la médiane et la région ombrée est l’écart interquartile (IQR). (B) Aire sous la courbe (AUC) des données de fréquence cardiaque pour chaque 30 min de temps de perfusion. (C) Résistance vasculaire (CVR) des greffons. (D) Taux d’absorption d’oxygène (OUR). (E) Accumulation de lactate. (F) Consommation de glucose. (G) Accumulation de potassium. (H) Pourcentage de gain de poids comme indicateur de l’œdème. Toutes les données sont exprimées en médiane ± écart interquartile (IQR, n = 4). Mesures répétées, analyse anova bidirectionnelle et analyse post-hoc HSD de Tukey-Kramer sur les moyennes des moindres carrés standard. * = p <0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Mesures d’évaluation non conventionnelles. Les métriques sont désignées comme non conventionnelles lorsque leur acquisition n’est possible que lors d’une perfusion chargée. (A) Pression d’impulsion ventriculaire gauche (VG) tracée dans le temps. La ligne continue est la médiane et la région ombrée est l’IQR. (B) L’aire sous la courbe (AUC) de la pression d’impulsion VG pour chaque 30 min de temps de perfusion. (C) L’ASC de la contractilité cardiaque a été obtenue à partir de la dérivée maximale de la pression d’impulsion VG pour chaque 30 min de perfusion. (D) L’AUC de la relaxation cardiaque a été obtenue à partir de la dérivée minimale de la pression d’impulsion VG pendant 30 minutes de temps de perfusion. Toutes les données sont exprimées en médiane ± écart interquartile (IQR, n = 4). Mesures répétées, analyse anova bidirectionnelle et analyse post-hoc HSD de Tukey-Kramer sur les moyennes des moindres carrés standard. * = p <0,01, ** = p <0,05, *** = p < 0,001, **** = p <0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

IonConcentration (mmol/L) 
Na+ 135-145
K + 3.5-6.0
Ca +2 1.0-1.3
Cl - 96-106

Tableau 1 : Plage acceptable de concentrations ioniques dans le perfusat.

Figure supplémentaire 1 : Configuration du système de perfusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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La perfusion mécanique normomère est une modalité puissante de préservation et d’évaluation des organes qui a eu un impact considérable sur le domaine de la transplantation cardiaque en élargissant le bassin de donneurs de cœurs adultes36. Cette expansion est le résultat de la capacité actuelle d’utiliser un petit nombre de cœurs auparavant considérés comme inaptes à la transplantation. La perfusion mécanique normamère préserve les greffons cardiaques à l’état de battement, offrant la possibilité d’une évaluation fonctionnelle et métabolique. Cependant, malgré son potentiel, l’application actuelle de la NMP reste limitée à un sous-ensemble limité d’organes marginaux (c’est-à-dire des organes donnés après une mort circulatoire avec < temps d’ischémie chaude de 30 minutes chez des donneurs < 55 ans et sans comorbidités). Cette limitation est causée par le manque de techniques d’évaluation précises et précises, qui entravent l’évaluation fiable d’un plus large éventail de cœurs marginaux.

La charge ventriculaire gauche pendant la NMP est apparue comme une technique d’évaluation prometteuse, car les paramètres hémodynamiques obtenus pendant la charge peuvent être fortement corrélés aux résultats post-transplantation 15,16,18. En effet, l’incorporation de la charge cardiaque pendant la NMP comme technique d’évaluation pourrait faciliter l’évaluation et l’utilisation probable d’organes à critères élargis, élargissant ainsi davantage le bassin de donneurs. Malgré l’immense impact potentiel, les capacités de charge ne sont actuellement pas disponibles dans les systèmes cliniques NMP37. Afin de simplifier et de normaliser l’intégration des capacités de charge dans les systèmes NMP établis, ce protocole démontre la faisabilité de la pressurisation passive de l’oreillette gauche (c’est-à-dire la pressurisation dépendante de la gravité), une approche rarement utilisée dans la perfusion cardiaque de grande envergure. Cette méthode de pressurisation élimine le besoin de pompes secondaires, simplifiant considérablement la mise en œuvre de la charge cardiaque. Cependant, comme la gravité est le principal déterminant de la pression AL, la connaissance de l’emplacement spatial du réservoir de charge et du capteur de pression qui l’accompagne (capteur de pression auriculaire) est essentielle pour une charge cardiaque réussie. Une extrême prudence doit être prise en compte pour les différences de pression induites par l’altitude, car la surpression et la sous-pression de l’AL entraînent des conditions de charge sous-optimales et peuvent entraîner l’échec de la greffe par différents mécanismes.

L’exposition de l’AL à des pressions anormalement élevées entraîne des pressions de remplissage cardiaque élevées (c’est-à-dire l’ouverture de la valve mitrale avant la relaxation complète du ventricule gauche), un phénomène connu pour causer des lésions du greffon cardiaque et un mauvais pronostic38. De plus, et de manière moins évidente, les pressions élevées exposent l’AL à des étirements non physiologiques, entraînant une mécanomodulation anormale et une augmentation potentielle de la sécrétion de peptides natriurétiques auriculaires (ANP)39. La mécanomodulation et les ANP sont des causes connues de la fibrillation auriculaire40,41. D’autre part, des pressions auriculaires gauches non physiologiquement basses peuvent entraîner un remplissage inadéquat du ventricule gauche pendant la diastole, entraînant une diminution du débit cardiaque. Comme ce protocole utilise une postcharge passive (c’est-à-dire pas de perfusion rétrograde à l’aorte pendant la charge avec une dépendance totale du flux sanguin coronaire sur la perfusion antérograde du ventricule gauche), une diminution du débit cardiaque peut entraîner une réduction de la perfusion myocardique et une ischémie relative. Une sur/sous-pression de l’AL peut également se produire pendant le processus de chargement, ce qui rend essentiel de pré-remplir le réservoir de chargement et de vérifier soigneusement sa pression avant de fermer l’atrium autour de la canule de chargement. Une pressurisation auriculaire incorrecte est la source la plus probable de lésion du greffon dépendante de la technique. C’était également la section la plus difficile à exécuter correctement, avec de nombreuses itérations effectuées pour déterminer la séquence la plus performante et la taille idéale de la canule de chargement.

Un autre élément particulièrement important pour le succès et la pertinence du protocole est l’utilisation d’une postcharge passive qui imite l’effet Windkessel observé dans la circulation in vivo. Dans des conditions physiologiques, l’effet Windkessel fait référence à la capacité des grandes artères centrales, en particulier l’aorte, à agir comme réservoir pendant la systole et comme conduit pendant la diastole. Au cours de la systole, les parois élastiques de l’aorte se dilatent pour s’adapter à une augmentation du volume sanguin42. Ce sang stocké est ensuite libéré progressivement lors de la diastole, aidé par le recul élastique des parois artérielles. Ce mécanisme réduit la variabilité temporelle du flux sanguin, assurant une perfusion d’organes quelque peu continue43. Ceci est particulièrement important pour le cœur car43 contrairement à d’autres organes, la perfusion du myocarde se produit presque exclusivement pendant la diastole44. En tant que tel, l’incorporation de l’effet Windkessel dans les systèmes de perfusion ex vivo fournit une source plus physiologique de perfusion coronaire, bénéfique pendant les modes de perfusion rétrograde et chargée. De plus, la mise en œuvre de ce système dans la perfusion en charge à des fins d’évaluation semble augmenter les capacités prédictives, les performances cardiaques des greffons perfusés avec une postcharge basée sur Windkessel étant plus fortement corrélées aux résultats post-transplantation, comme l’ont montré d’autres18. L’effet Windkessel dans cette configuration est obtenu à l’aide d’un sac IV modifié enfermé entre deux plaques acryliques reliées par un ressort à visser (figure supplémentaire 1), un système relativement plus simple que les autres appareils Windkessel rapportés 18,19,20. De plus, la possibilité de serrer ou de desserrer le ressort de charge offrait un immense contrôle sur la pression de recul, facilitant ainsi le réglage fin des paramètres expérimentaux.

À l’aide de notre système, la méthode de perfusion peut être facilement alternée entre le mode Langendorff et le mode chargé. Le mode chargé a permis l’acquisition de données fonctionnelles à partir du ventricule gauche des greffons (c’est-à-dire la pression du pouls ventriculaire gauche, la contractilité, la relaxation, Figure 3). Ces données fonctionnelles ont révélé une différence distincte dans la viabilité du greffon qui n’était pas apparente dans les tendances biochimiques (Figure 2), y compris le lactate (Figure 2B), la norme clinique pour l’évaluation du greffon cardiaque dans les systèmes de perfusion ex vivo 10. De plus, la perfusion en mode chargé, comme décrit dans ce protocole, permet de mesurer le débit cardiaque (CO = fréquence cardiaque * volume systolique), fournissant une mesure supplémentaire et plus conventionnelle de la fonction cardiaque45,46. Le volume systolique, la variable la plus difficile à acquérir dans la configuration actuelle, pourrait être obtenu en quantifiant le débit coronaire, qui, avec le flux auriculaire et aortique, peut être utilisé pour calculer les volumes diastolique et systolique finaux. De même, le volume systolique peut être obtenu via des mesures d’échocardiogramme ou des boucles pression-volume. Il est important de souligner que cette configuration n’est capable de charger que le côté gauche du cœur, ce qui entraîne des données fonctionnelles du ventricule gauche. Cette méthode ne fournit aucune information concernant la fonction ventriculaire droite. Il s’agit probablement de la plus grande limitation du protocole actuel, d’autant plus que la dysfonction ventriculaire droite est plus fréquente chez les personnes transplantées que chez les personnes transplantées47. Cependant, le dysfonctionnement ventriculaire droit se résoudrait après quelques semaines après la transplantation, ce qui pourrait réduire sa priorité47.

Notamment, les quatre greffons présentés dans les résultats de ce manuscrit ont été obtenus et perfusés à l’aide de Langendorff pendant 6 h de la même manière. Cette condition expérimentale a été choisie car 6 h est la durée moyenne de conservation des greffons perfusés par machine normothermiques, et l’ajout de 4 h supplémentaires de charge continue (total de 10 h de temps ex vivo ) devait entraîner un certain degré d’échec du greffon. Cet échec attendu a été l’occasion de souligner la nécessité de disposer de mesures fonctionnelles et de démontrer leur capacité d’évaluation par rapport aux mesures basées sur Langendorff. En effet, les résultats de ce manuscrit démontrent la capacité de certains paramètres fonctionnels acquis via la pressurisation passive de l’AL et la charge passive de postcharge à démasquer les différences de viabilité des greffes cardiaques DBD avec des temps de conservation prolongés. Bien que cela n’ait pas été démontré ici, il est raisonnable de supposer que l’efficacité de cette évaluation peut être reproduite pour déterminer la viabilité des greffons présentant d’autres blessures et/ou déficiences fonctionnelles connues (c.-à-d. TDC, donneurs plus âgés, comorbidités), mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les caractéristiques fonctionnelles et les différences au sein de ces greffons. De même, des travaux supplémentaires sont également nécessaires pour déterminer comment les paramètres fonctionnels sont corrélés avec les greffes cardiaques transplantables par rapport aux greffes non transplantables, ainsi que d’autres sources possibles d’indices de viabilité. Par exemple, la différence entre les pressions de charge aortique et auriculaire peut être un indice de viabilité fiable, car la différence entre ces lectures de pression peut indiquer une absence ou une présence de choc cardiogénique48.

Disclosures

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DV est un employé et fondateur de VentriFlo, Inc., Pelham, NH, et a déposé des demandes de brevet pertinentes pour cette étude. Pour plus d’informations, reportez-vous à la https://ventriflo.com/patents/. SNT a déposé des demandes de brevet pertinentes pour cette étude et siège au conseil consultatif scientifique de Sylvatica Biotech Inc., une société axée sur le développement de technologies de préservation d’organes. Tous les intérêts concurrents sont gérés par l’HGM et Partners HealthCare conformément à leurs politiques en matière de conflits d’intérêts. AR et AAO reçoivent des fonds de recherche de Paragonix Technologies Inc.

Acknowledgements

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Nous sommes reconnaissants au SNT de la part de l’Institut national de la santé des États-Unis (K99/R00 HL1431149 ; R01HL157803 ; R01DK134590 ; R24OD034189), la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n°. EEC 1941543, le prix Claflin Distinguished Scholar au nom du comité exécutif de la recherche de l’HGM et le prix de la famille Polsky pour les leaders en chirurgie. Nous reconnaissons le financement de la recherche à l’AAO par la Fondation de la famille Hassenfeld, le Comité exécutif de la recherche de l’HGM et le Centre pour la diversité et l’inclusion de l’HGM. Nous reconnaissons le financement de la recherche à GO par la Fondation de recherche cardiovasculaire Sarnoff.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Robinet d’arrêt à 4 voies  ;Smiths Medical  ;
4-0 Sutures Prolène  ;Ethicon·s ;8711
5-0 SutureOutils scientifiques fins18020-50
Connecteur aortique  ;VentriFLO Inc  ;
Canule radiculaire aortiqueMedtronic Inc  ;10012
Albumine sérique bovineSigmaA7906
Chlorure de calciumSigmaC7902
Cell Saver  ;Medtronic Inc  ;Cartouches ATLG
Cell Saver  ;Medtronic Inc  ;ATLS00
DextranSigma31389
électrocardiogramme, électrocardiogrammes, sondes épicardiques  ;VentriFLO Inc  ;
Support et supports d’équipement sur mesure  ;VentriFLO Inc  ;
Stimulateur cardiaque externe sur mesure  ;Medtronic Inc  ;5392
Falcon High Clarity 50mL Tubes coniquesFisher Scientific14-432-22
Sondes de débit  ;TranSonic Systems inc  ;1828
Héparine sodique InjectionMedplusG-0409-2720-0409-2721
Oxygénateur à fibres creuses et veineux  ; ReseviorMedtronic Inc  ;BBP241Affinity Pixie, 1L
HTP 1500  ; pompe de thérapie thermiqueHTP6826619
insulineHumulin RMGH Pharmacie
Iworx Système d’acquisition de donnéesIworxIX-RA-834
Krebs-Henseleit BufferSigmaK3753
Filtre leucocytaireHémonétiqueSB1E
Chambre d’organeVentriFLO Inc  ;
Fils de stimulation sur mesure BiopolarMedtronic Inc  ;6495
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher Scientific15140122
Transducteurs de pression  ;IworxBP100
VentriFLO Inc  ;2100-0270
Tubes en PVC  ;Medtronic Inc  ;
Canule à pointe métallique à angle droit 20FMedtronic Inc  ;67318
Bicarobonate de sodiumSigma5761
Standard PHD ULTRA CP Pompe à seringueHarvard Aparatus88-3015
Kit de garrot 7in  ;Medtronic Inc  ;79006
Transonic Flow boxTranSonic Sytems Inc  ;T402
Résurgence veineuse  ;Medtronic Inc  ;CB841Affinity Fusion, 4L
WIndKessel SacVentriFLO Inc  ;
Adaptateur en YMedtronic Inc  ;Référence 10005
MX9341L sur mesure Pompe pulsatile HY10Z49R9 sur mesure

References

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