Croissance de sphéroïdes tridimensionnels desmoplastiques du cancer du pancréas à partir de la co-culture

Résumé

Le cancer du pancréas reste l’un des cancers les plus difficiles à traiter. Par conséquent, il est essentiel que les modèles précliniques évaluant l’efficacité du traitement soient reproductibles et cliniquement pertinents. Ce protocole décrit une procédure simple de co-culture pour générer des sphéroïdes desmoplastiques reproductibles et cliniquement pertinents.

Résumé

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des cancers les plus meurtriers avec un taux de survie à 5 ans de <12 %. Le plus grand obstacle au traitement est la matrice extracellulaire desmoplastique dense (MEC) qui entoure la tumeur et réduit la vascularisation, généralement appelée desmoplasie. Une variété de combinaisons et de formulations de médicaments ont été testées pour traiter le cancer, et bien que beaucoup d’entre eux montrent un succès préclinique, ils échouent cliniquement. Il devient donc important de disposer d’un modèle cliniquement pertinent capable de prédire la réponse de la tumeur au traitement. Ce modèle a déjà été validé contre des tumeurs cliniques réséquées. Ici, un protocole simple pour cultiver des sphéroïdes de coculture tridimensionnelle (3D) desmoplastiques est décrit qui peut générer naturellement une ECM robuste et ne nécessite aucune source matricielle externe ou échafaudage pour soutenir leur croissance.

En bref, les cellules stellaires pancréatiques humaines (HPaSteC) et les cellules PANC-1 sont utilisées pour préparer une suspension contenant les cellules dans un rapport de 1:2, respectivement. Les cellules sont plaquées dans une plaque en U à 96 puits à faible fixation recouverte de poly-HEMA. La plaque est centrifugée pour permettre aux cellules de former une première pastille. La plaque est stockée dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂, et le milieu est remplacé tous les 3 jours. Les plaques peuvent être imagées à des intervalles désignés pour mesurer le volume des sphéroïdes. Après 14 jours de culture, des sphéroïdes desmoplastiques matures se forment (c.-à-d. un volume moyen de 0,048 + 0,012 mm³ (451 μm x 462,84 μm)) et peuvent être utilisés pour l’évaluation du traitement expérimental. Les composants matures de la MEC comprennent le collagène-I, l’acide hyaluronique, la fibronectine et la laminine.

Introduction

Le mauvais pronostic du cancer du pancréas est associé à diverses raisons, parmi lesquelles son manque de biomarqueurs facilement détectables conduisant à une détection tardive. Une autre raison majeure est l’épais stroma entourant le tissu, ce qui entraîne une réduction de l’apport sanguin. Le dépôt de grandes quantités de matrice extracellulaire (MEC), l’interaction cellule-cellule, les cellules endothéliales, diverses cellules immunitaires, les péricytes, les myofibroblastes en prolifération et la population de fibroblastes, et la présence de cellules non néoplasiques (constituant ensemble la réaction desmoplastique)

Protocole

1. Culture cellulaire 2D

1. Cultivez des cellules PANC-1 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans des conditions stériles. Cultivez jusqu’à 70%-80% de confluence avant les passages, et ne pas utiliser au-delà du 20ème^passage. Reportez-vous au processus décrit à l’étape 4.2.1.
   REMARQUE : À titre de référence, 1 x 10⁶ cellules dans 20 ml de milieu a besoin d’environ 2 à 3 jours pour atteindre une confluence de 70 à 80 %.
2. Cultivez des cellules HPaSteC dans des milieux cellulaires étoilés complétés par 2 % de FBS, 1 % de PenStrep et 1 % de supplément de c....

Résultats

Trois des étapes les plus critiques de la croissance des sphéroïdes sont le dénombrement initial des cellules, les étapes de mélange pendant l’ensemencement des sphéroïdes et l’exécution de changements de milieu en temps opportun pour permettre aux sphéroïdes de se développer (figure 1). De plus, il est essentiel de se familiariser avec la figure 2 sur les changements de supports après le jour 3 pour permettre des changements de supports efficac.......

Discussion

La durée et les rapports cellulaires choisis pour faire pousser les sphéroïdes ont été basés sur des études comme indiqué précédemment³⁸. En tentant d’optimiser ces études en substituant des cellules NIH3T3 aux cellules HPaSteC, on a constaté que les volumes sphéroïdes et les profils d’apoptose ressemblaient étroitement aux paramètres optimisés rapportés (rapportés pour PANC-1 : NIH3T3 : 120:12) lorsque les rapports PANC-1 : HPaSteC étaient de 120 : 60. Bien que c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Axio Observer microscope inversé	Carl Zeiss	0450-354
Cellomètre Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, poudre, haute teneur en glucose	Gibco	12100046
Âne anti-mouton conjugué avec Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Sérum fœtal de bovin  ;	Cytiva	SH3091003HI
IgG anti-lapin de chèvre étiqueté avec Alexa Fluor 488  ;	Abcam	ab150077
Solution saline équilibrée Hanks (HBSS)  ;	Gibco	14175145
Cellules stellaires pancréatiques humaines (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96 puits Polystyrène à fond rond Plaques à micropuits	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 laser confocal	Olympus	N/A	Produit arrêté de série
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Anticorps polyclonaux anti-laminine de lapin  ;	Abcam	ab11575
Anticorps polyclonaux de collagène anti-type I de lapin  ;	Abcam	ab34710
Anticorps polyclonaux anti-acide hyaluronique de mouton	Abcam	ab53842
Kit complet de milieux cellulaires stellaires  ;	ScienCell	5301
Trypsine  ;	MP Biomedicals, LLC	153571	Solution de trypsine préparée selon le protocole du fabricant et utilisée à 0,25 % p/v ;
Solution de neutralisation de la trypsine (TNS)	ScienCell	103