Le protocole actuel décrit un modèle de rat d’occlusion/reperfusion de l’artère cérébrale moyenne qui préserve la structure anatomique des vaisseaux cérébraux sans causer de dommages.
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Article de méthode
Un modèle chez le rat d’occlusion/reperfusion de l’artère cérébrale moyenne sans endommager la structure anatomique des vaisseaux cérébraux
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’AVC ischémique est la principale cause d’invalidité et de mortalité à long terme chez les adultes dans le monde. Les modèles animaux d’AVC ischémique ont contribué de manière significative à notre compréhension de ses mécanismes pathologiques et au développement de traitements potentiels. À l’heure actuelle, il existe deux méthodes courantes impliquant des techniques de filament (suture endovasculaire) pour induire des modèles animaux d’ischémie cérébrale. Cependant, ces méthodes ont des limites inhérentes, telles qu’une perfusion sanguine réduite vers le cerveau, des dommages au système de l’artère carotide externe, une altération de la consommation de nourriture et/ou d’eau et un dysfonctionnement sensoriel du visage. Cet article présente une nouvelle méthode pour induire un modèle d’AVC ischémique chez le rat sans compromettre l’anatomie vasculaire cérébrale. Dans cette étude, l’artère carotide commune (ACC) de rats Sprague-Dawley a été exposée et une incision a été pratiquée. Un filament a ensuite été inséré à travers l’incision dans l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne. Après 1,5 h d’ischémie induite, le filament occlusif a été complètement retiré de l’artère carotide interne et de l’ACC. L’incision dans l’ACC a ensuite été suturée à l’aide de sutures microchirurgicales 11-0 au microscope (grossissement 4x). Grâce à l’utilisation de techniques microchirurgicales pour réparer l’ACC, cette étude a réussi à développer une méthode unique pour induire un modèle d’AVC ischémique chez le rat tout en préservant l’intégrité anatomique des vaisseaux sanguins cérébraux.
Introduction
Les accidents vasculaires cérébraux, principale cause de décès et de dysfonctionnement neurologique à long terme chez les adultes dans le monde, englobent différents types, l’AVC ischémique représentant environ 81,9 % des cas, tandis que l’hémorragie cérébrale et l’hémorragie sous-arachnoïdienne représentent respectivement 14,9 % et 3,1 %, respectivement1. L’AVC ischémique résulte souvent d’une athérosclérose ou d’une occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM), entraînant une réduction locale du flux sanguin cérébral et des lésions cérébrales ultérieures. Cette réduction de l’apport en nutriments aux cellules ischémiques déclenche l’épuisement de l’énergie, provoquant une perte d’intégrité membranaire, un gonflement des cellules et éventuellement une lyse. De plus, des facteurs tels que l’augmentation du calcium intracellulaire, la libération d’acides aminés excitateurs, l’augmentation de la production de radicaux libres et l’activation des cellules inflammatoires contribuent aux lésions des tissus cérébraux après un AVC2.
Les objectifs de traitement de l’AVC ischémique sont multiples : réduire les dommages neurologiques persistants et réduire la mortalité et l’invalidité à long terme, prévenir les complications découlant de l’immobilité et du dysfonctionnement neurologique, et minimiser le risque de récidive de l’AVC. Compte tenu de la complexité de la physiopathologie de l’AVC ischémique, un modèle d’AVC robuste est essentiel pour la recherche et le développement de traitements ciblant l’AVC ischémique.
Actuellement, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) est un modèle animal courant d’AVC ischémique3. Le MCAo est généralement réalisé en insérant un monofilament à pointe de silicium ou émoussé à la flamme à travers les vaisseaux cervicaux jusqu’à ce qu’il atteigne l’origine de l’artère cérébrale moyenne (ACM). En 1986, Koizumi et ses collègues ont mis au point une technique impliquant l’insertion d’un monofilament à pointe de silicium à travers une incision dans l’artère carotide commune (ACC), lui permettant d’atteindre l’entrée de l’ACM et de bloquer son flux sanguin4. En 1989, le groupe de Longa a rapporté une autre méthode MCAo qui impliquait l’introduction d’un monofilament à travers une incision dans l’artère carotide externe (ECA). Le monofilament traverse ensuite la bifurcation de l’artère carotide interne (ICA) et de l’ECA avant d’atteindre le point de départ de la classe MCA5.
Les limites des deux méthodes existantes pour induire le MCAo sont évidentes. La méthode de Koizumi nécessite le blocage permanent de l’ACC ipsilatéral, conduisant à une réduction de la perfusion de MCA puisque la reperfusion repose uniquement sur le cercle de Willis4. À l’inverse, la méthode de Longa consiste à couper l’ECA, ce qui entraîne des dommages au système ECA et une altération ultérieure de la fonction musculaire faciale5. Ces dommages peuvent avoir un impact sur l’apport en nourriture et en eau, ainsi que provoquer un dysfonctionnement sensoriel du visage, affectant la réadaptation et l’évaluation de la fonction neurologique après un AVC ischémique6.
Le protocole actuel cherche à remédier à ces limitations en développant une nouvelle méthode pour induire un modèle d’AVC ischémique sans endommager la structure anatomique des vaisseaux cérébraux. Cette nouvelle approche utilise des techniques microchirurgicales pour réparer l’ACC, évitant ainsi les inconvénients associés aux méthodes précédentes.
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Protocole
La procédure expérimentale a reçu l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yantai (numéro d’approbation : YTDX20230410) et a respecté les directives des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des rats Sprague-Dawley mâles pesant entre 300 et 350 g ont été utilisés pour cette étude. Une liste complète des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés est fournie dans la table des matériaux.
1. Préparation des animaux
- Hébergez les animaux dans un environnement où le cycle lumière/obscurité est de 12 heures, où la température et l’humidité sont contrôlées. Assurez-vous qu’ils ont un accès illimité à la nourriture et à l’eau.
2. Anesthésie
- Anesthésier les rats par injection intrapéritonéale avec un mélange contenant de la kétamine (80 mg/kg) et de la xylazine (20 mg/kg).
REMARQUE : Inclinez la tête et le corps des rats vers le bas. Le site d’injection se trouve dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen de l’animal. Tirez sur le piston avant d’injecter. Le volume moyen d’injection est de 0,4 mL. - Confirmer l’induction de l’anesthésie en évaluant le réflexe de retrait de la patte arrière et le réflexe de clignement des yeux. Si une profondeur d’anesthésie adéquate n’est pas atteinte, compléter avec de l’isoflurane pendant l’intervention chirurgicale.
3. Procédure de modélisation ischémique
- Stérilisez les outils chirurgicaux à l’aide d’un autoclave. Désinfectez les tables d’opération et les équipements associés avec de l’éthanol à 70 %.
- Préparez le site chirurgical en rasant la fourrure autour du site d’incision prévu. Désinfectez la peau au niveau du site chirurgical trois fois avec de la bétadine et de l’éthanol à 70 %.
- Faites une incision médiane sur la face ventrale, d’environ 1,5 cm de long, et ouvrez le fascia superficiel.
- Effectuez une dissection nette et contondante pour exposer l’artère carotide externe (ECA), l’artère carotide interne (ICA) et l’artère carotide commune (ACC) conformément à la méthode décrite précédemment 7.
- Placez trois sutures en soie 4-0 autour de l’ACC et une autre suture en soie à travers l’ECA près de la bifurcation de l’ICA. Faites un nœud coulant amovible sur le CCA proximal. Serrez la suture de l’ACC distal à l’aide d’un hémostat pour bloquer la circulation sanguine. Faites un autre nœud coulant autour de l’ACC pendant la suture pour vous assurer que le vaisseau n’est pas occlus
REMARQUE : Assurez-vous que le nœud coulant n’est pas trop serré, juste suffisant pour bloquer le flux sanguin, car il devra être libéré lors de la suture vasculaire. - Faites une incision de 0,5 mm entre la suture proximale de la soie et la suture moyenne sur l’ACC à l’aide de ciseaux.
REMARQUE : Assurez-vous que l’incision permet au filament (pointe recouverte de silicone) de pénétrer dans le CCA. - Introduire un filament 4-0 de 3 cm de longueur (pointe recouverte de silicium) dans l’ACC. Serrez les sutures en soie autour de l’ACC pour fixer le filament intraluminal et éviter les saignements ; ensuite, retirez la suture de l’ACC distale.
- Continuez à insérer le filament dans la lumière du MCA, en contrôlant les sutures autour de l’ECA pour vous assurer que le filament ne pénètre pas dans l’ECA. La longueur d’insertion est généralement de 18 mm à 20 mm.
- Démarrez une minuterie et enregistrez l’heure à laquelle l’occlusion commence. Suturez l’incision du cou avec des sutures en soie 3-0 et placez soigneusement l’animal dans une cage de récupération. Administrer 0,5 mL de solution saline normale par voie intrapéritonéale.
4. Suture microchirurgicale de l’ACC
- Ré-anesthésie le rat 1,5 h après l’ischémie. Désinfectez le site d’incision trois fois avec de l’éthanol à 70 % et rouvrez l’incision.
- Retirez doucement le filament d’occlusion jusqu’à ce que la pointe blanche soit clairement visible près de l’incision CCA. Placez une micro-pince horizontalement près du nœud de suture intraluminal fixé près de la bifurcation CCA.
REMARQUE : Évitez de serrer l’embout du filament blanc pour éviter le détachement du silicone et la thrombose ultérieure. - Relâchez le nœud de suture intraluminal sécurisé et retirez complètement le filament.
- Placez une autre micro-pince près du côté de l’extrémité du cœur du nœud CCA proximal. Par la suite, retirez le nœud de suture autour du CCA.
REMARQUE : Le bon placement des pinces est crucial pour élever les vaisseaux fixes dans les étapes ultérieures afin de faciliter la suture microvasculaire. Placez les pinces horizontalement sur les muscles environnants pour éviter tout glissement. - Rincez le site d’incision avec une solution saline normale et séchez la zone avec une boule de coton stérile pour éliminer le sang et obtenir un champ opératoire clair.
- Au microscope (grossissement 4x), suturez l’incision CCA à l’aide de sutures microchirurgicales 11-0 selon un schéma interrompu, nécessitant généralement deux points de suture en fonction de la taille de l’incision.
- Après la suture, retirez les micro-pinces des deux extrémités de l’ACC pour rétablir la circulation sanguine.
- Appliquez une pression avec une boule de coton stérile sur le site de suture de l’ACC pendant 30 s. Observez l’ACC pendant 2 minutes pour vous assurer qu’il n’y a pas de saignement. Suturez l'incision du cou du rat et placez l'animal dans une boîte de soins à 35 °C pour la récupération de l'anesthésie avant de le remettre dans la cage.
REMARQUE : Administrer par voie intrapéritonéale avec du méloxicam à une dose de 2 mg / kg pour l’analgésie postopératoire.
5. Coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC)
- Trois jours après l’ischémie-reperfusion, euthanasier les animaux sous anesthésie profonde avec 4 % d’isoflurane et luxation cervicale.
- Retirez les cerveaux et coupez-les en sections coronales de 2 mm d’épaisseur à l’aide d’une lame de scalpel8.
- Incuber les sections cérébrales avec 2 % TTC pendant 20 min à 37 °C.
- Rincez deux fois les sections du cerveau avec du formol à 10 %, puis fixez-les avec du formol à 10 % pendant 30 minutes à température ambiante.
- Capturez des photographies numériques de coupes consécutives et mesurez quantitativement les zones d’infarctus à l’aide du logiciel Image J.
6. Test de la fonction neurologique
REMARQUE : La fonction neurologique a été évaluée à l’aide du test de Garcia, suite à un précédent rapport9.
- Évaluez l’activité spontanée, la symétrie dans le mouvement des quatre membres, l’étirement de la patte avant, l’escalade, la proprioception corporelle et la réponse au toucher des vibrisses. Attribuez des scores en fonction des critères du test Garcia, avec un score maximum de 18 points indiquant une fonction neurologique normale.
7. Analyse statistique
- Utilisez GraphPad Prism pour effectuer une analyse statistique à l'aide du test t de Student. Exprimez les données sous forme de moyenne ± d’écart-type. Considérez les différences entre les moyennes comme statistiquement significatives si P < 0,05.
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Résultats
Le processus de microsuture
Le filament a été retiré vers l'incision de l'ACI jusqu'à ce que la pointe blanche du filament soit visible (Figure 1A). Des pinces microchirurgicales ont ensuite été placées sur l'ACI (Figure 1B). Sous microscope à un grossissement de 4x, l'incision de l'ACI a été suturée à l'aide de fils microchirurgicaux selon un motif discontinu (Figure 1C). Ensuite, les micro-pinces ont été retir...
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Discussion
MCAo est une méthode largement utilisée pour créer des modèles animaux d’AVC, reproduisant efficacement le processus d’AVC observé chez les patients en rétablissant le flux sanguin après une ischémie 10,11,12. Notre laboratoire a mis au point un modèle d’AVC ischémique qui permet la reperfusion à partir de l’ACC sans causer d’endommagement à l’ECA. Suite à l’induction de l’ischémie, une réparation microchirurgicale de l’ACC est ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts potentiellement conflictuels à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le projet d’introduction du renseignement étranger de la province du Hebei en 2023. Nous remercions Lisa Kreiner, PhD, de Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), pour avoir édité le texte anglais d’une ébauche de ce manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 % de formol | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BL913A | |
| 11-0 sutures microchirurgicales | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3/8 1& fois ; | |
| 2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 suture en soie | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| 4 % isoflurane ; ; | Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd. | ||
| 20221102 Suture en soie 6-0 | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 6-0 | |
| 70 % d’éthanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Filament | Xinong Technologies Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Kétamine ; ; | Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. | 230613BL | |
| Rats mâles Sprague Dawley | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Microclips | Shanghai Jinzhong Medical Device Factory | W40150 | |
| Microscope | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Boîte d’allaitement | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Xylazine | SIGMA | PHR3263 |
Références
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Réimpressions et autorisations
