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Article de méthode

Quantification de l’activité du système de sécrétion de Yersinia pseudotuberculosis de type III après une carence en fer et une croissance anaérobie

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DOI :

10.3791/66642

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31 mai 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

Dans cet article

Résumé

Les bactéries colonisent les tissus de l’hôte dont la biodisponibilité de l’oxygène et du fer varie, mais la plupart des approches d’étude des bactéries utilisent des milieux riches et aérés. Ce protocole décrit la culture de l’agent pathogène humain Yersinia pseudotuberculosis sous des concentrations de fer et une tension d’oxygène variables, et la quantification de l’activité du système de sécrétion de Yersinia de type III, qui est un facteur de virulence important.

Résumé

Un mécanisme clé de virulence pour de nombreux agents pathogènes à Gram négatif est le système de sécrétion de type III (T3SS), un appendice en forme d’aiguille qui transfère les protéines effectrices cytotoxiques ou immunomodulatrices dans les cellules hôtes. Le T3SS est une cible pour les campagnes de découverte d’antimicrobiens car il est accessible en dehors des cellules et largement absent des bactéries non pathogènes. Des études récentes ont démontré que les T3SS de Yersinia et de Salmonella sont régulés par des facteurs sensibles au fer et à l’oxygène, qui sont des signaux spécifiques importants rencontrés lors de l’infection des mammifères. La présente invention concerne une méthode de carence en fer chez Yersinia pseudotuberculosis, suivie d’une supplémentation facultative en fer inorganique. Pour évaluer l’impact de la disponibilité de l’oxygène, ce processus de carence en fer est démontré dans des conditions aérobies et anaérobies. Enfin, l’incubation des cultures à la température de l’hôte mammifère de 37 °C induit l’expression de T3SS et permet de quantifier l’activité de Yersinia T3SS en visualisant les protéines effectrices libérées dans le surnageant. Les étapes détaillées ici offrent un avantage par rapport à l’utilisation de chélateurs de fer en l’absence de carence en fer, ce qui est insuffisant pour induire une carence en fer robuste, probablement en raison de l’efficacité des systèmes d’absorption et de piégeage du fer de Yersinia . De même, la verrerie de laboratoire à lavage à l’acide est détaillée pour assurer l’élimination du fer résiduel, ce qui est essentiel pour induire une carence en fer robuste. De plus, l’utilisation d’un agent chélateur est décrite pour éliminer le fer résiduel des milieux et la culture des bactéries pendant plusieurs générations en l’absence de fer pour épuiser les réserves de fer bactériennes. En incorporant des protocoles standard de précipitation des protéines induite par l’acide trichloracétique, SDS-PAGE et coloration à l’argent, cette procédure démontre des moyens accessibles de mesurer l’activité T3SS. Bien que cette procédure soit optimisée pour Y. pseudotuberculosis, elle offre un cadre pour des études sur des agents pathogènes ayant des systèmes d’absorption du fer robustes similaires. À l’ère de la résistance aux antibiotiques, ces méthodes peuvent être étendues pour évaluer l’efficacité des composés antimicrobiens ciblant le T3SS dans des conditions pertinentes pour l’hôte.

Introduction

De nombreux agents pathogènes à Gram négatif cliniquement pertinents, tels que Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas et Shigella, codent pour le système de sécrétion de type III (T3SS) pour injecter des protéines effectrices dans les cellules hôtes1. Chez de nombreuses espèces bactériennes, le T3SS est soumis à un contrôle réglementaire strict2. Par exemple, la translocation des protéines effectrices de Yersinia T3SS dans les cellules hôtes cibles est essentielle pour subvertir les mécanismes de défense de l’hôte et permettre la colonisation bactérienne des tissus de l’hôte. Cependant, l’activité de Yersinia T3SS est métaboliquement lourde et peut déclencher la reconnaissance par les récepteurs immunitaires de l’hôte3. En conséquence, les régulateurs qui détectent des signaux environnementaux spécifiques contrôlent l’expression des gènes T3SS chez de nombreuses espèces bactériennes. Étant donné que les agents pathogènes tels que Yersinia subissent des changements environnementaux au cours de leur cycle d’infection qui ont un impact sur l’expression des facteurs de virulence critiques, il est important de développer des conditions de laboratoire qui imitent les caractéristiques saillantes des niches d’hôtes occupées par les agents pathogènes bactériens. Plus précisément, la tension d’oxygène et la disponibilité du fer diffèrent entre les différents sites tissulaires de manière spatio-temporelle et ont un impact sur l’expression des gènes de virulence tels que le T3SS 4,5,6. Par conséquent, l’objectif de cette méthode est d’évaluer l’impact de l’oxygène et du fer sur l’expression de Yersinia T3SS. Cela permettra de mieux comprendre la dynamique de l’interaction hôte-pathogène.

La méthode décrite ici détaille comment cultiver Yersinia pseudotuberculosis en aérobie et en anaérobie, ainsi que comment épuiser les réserves de fer de Yersinia pendant la croissance aérobie ou anaérobie. Quelques considérations importantes sont soulignées ici concernant la culture réussie de bactéries dans ces conditions variables. Tout d’abord, la culture anaérobie nécessite une supplémentation supplémentaire en glucose, une modification qui est notée dans la recette du milieu. Deuxièmement, étant donné que Y. pseudotuberculosis utilise des sidérophores et d’autres systèmes d’absorption du fer qui peuvent extraire vigoureusement le fer de l’environnement, une attention particulière est accordée à ce que les milieux de culture et la verrerie de laboratoire soient aussi exempts de fer que possible7. Des études antérieures ont utilisé des chélateurs de fer tels que le dipyridyle pour épuiser le fer à partir de cultures bactériennes riches en milieux afin d’imiter la carence en fer 8,9. Cependant, l’épuisement des réserves de fer de Yersinia pour induire une carence en fer nécessite l’élimination du fer résiduel dans la verrerie et les médias, ainsi qu’une croissance prolongée en l’absence de fer. Ce protocole détaille comment laver à l’acide la verrerie et les milieux chélatés pour éliminer le fer résiduel, en plus de cultiver les bactéries pendant plusieurs générations pour assurer une privation complète de fer. La carence en fer peut être assurée en mesurant les niveaux relatifs de transcription de gènes sensibles au fer bien caractérisés dans toutes les conditions, comme démontré ici avec yfeA et bfd.

L’aboutissement de ce protocole démontre comment précipiter les protéines effectrices T3SS sécrétées à partir de chacune de ces conditions en traitant le surnageant de culture avec de l’acide trichloracétique (TCA) et en visualisant les protéines sécrétées par SDS-PAGE. Enfin, l’activité relative de T3SS est évaluée en visualisant les protéines sécrétées via la coloration à l’argent et en quantifiant les niveaux relatifs de protéines effectrices de T3SS, appelées protéines externes de Yersinia (Yops)10.

Les dosages de l’activité T3SS utilisent généralement des anticorps spécifiques pour détecter les niveaux de protéines effectrices T3SS dans le surnageant de culture. Cependant, les anticorps Western blot pour les protéines effectrices T3SS ne sont souvent pas disponibles dans le commerce. Par conséquent, une attention particulière a été portée à ce que la visualisation finale de l’activité de T3SS dans cette méthode ne nécessite pas d’anticorps spécifiques, mais puisse plutôt tirer parti de la coloration à l’argent, qui permet de visualiser toutes les protéines sécrétées. Bien que cette méthode soit spécifiquement adaptée et optimisée pour Y. pseudotuberculosis, elle peut être adaptée à d’autres espèces bactériennes, bien que les conditions exactes des milieux et les temps d’incubation varient.

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Protocole

Les détails des réactifs, de la composition des milieux, des séquences d’amorces et de l’équipement sont répertoriés dans la table des matériaux. La figure 1 illustre le flux de travail expérimental global.

1. Préparation de la verrerie lavée à l’acide et des milieux M9 chélatés

REMARQUE : Avant de commencer, reportez-vous à la section des matériaux pour les réactifs et les recettes exacts qui seront utilisés. Le média M9 a été utilisé pour la première fois pour les tests Yersinia T3SS dans Cheng et al.11.

  1. Verser 100 mL de HCl 6 N dans une fiole en verre de 250 mL.
    ATTENTION : Le HCl est extrêmement dangereux ; s’assurer que des précautions appropriées sont prises lors de la manipulation de cette substance.
  2. Fermez l’embouchure du récipient en verre à l’aide d’un bouchon en verre et remuez soigneusement le ballon pendant 1 minute pour bien répartir le HCl, en changeant parfois de direction.
  3. Éliminez le HCl 6 N de manière appropriée.
  4. Rincez le récipient en verre en ajoutant 100 mL de H2O désionisé, en scellant la bouche, en secouant pendant 20 s, puis en vidant l’eau.
  5. Répétez l’étape de rinçage pour un total de 3 fois.
  6. Laissez sécher à l’air libre. Autoclave pour stériliser.
  7. Pour chélater le milieu, mélangez les composants M9 avec le réactif de chélation et agitez avec une barre d’agitation magnétique à température ambiante pendant ~18 h. Filtrez-stérilisez et ajoutez du MgSO4 à une concentration finale de 1 mM.

2. Culture de Y. pseudotuberculosis sous des niveaux de fer et une tension d’oxygène variables

  1. Striez Y. pseudotuberculosis (la souche IP2666pIB1 est utilisée dans cette étude) sur des plaques de gélose Lysogeny Broth (LB) et incubez à température ambiante.
    REMARQUE : L’incubation de Yersinia à 37 °C, en particulier dans un milieu pauvre en calcium, entraîne l’activité de T3SS, l’arrêt de la croissance et, en fin de compte, sélectionne la perte du plasmide pour la règle de Yersinia vi(pYV) qui code pour le T3SS12. Par conséquent, ce protocole utilise une incubation à 26 °C de Yersinia jusqu’à ce que l’activité de T3SS doive être mesurée.
  2. Après 48 h, une fois que des colonies visibles se forment, inoculer 4 mL de milieu M9 contenant 0,2 % de glucose, 1 mg/L de FeSO 4,7H2O et complété par des acides aminés (appelés ici milieux M9) à partir d’une seule colonie isolée et cultiver pendant une nuit à 26 °C avec aération à 250 tr/min pendant environ 18 h.
    REMARQUE : Utilisez de la verrerie lavée à l’acide en commençant par l’étape suivante et en continuant.
  3. Sous-culture dans un milieu M9 chélaté en suivant les étapes ci-dessous.
    REMARQUE : Pour toutes les étapes suivantes, un milieu M9 avec 0,9 % de glucose est utilisé plutôt que le glucose standard à 0,2 %.
    1. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique (OD600) de la culture de nuit.
    2. Diluer la culture de nuit à une valeur OD600 de 0,1 dans un total de 14 mL de milieu M9 chélaté stérile contenant 0,9 % de glucose et pas de FeSO 4,7H 2O dans un flacon de 250 mL lavé à l’acide sans supplémentation en fer.
    3. Incuber pendant 8 h à 26 °C avec aération à 250 tr/min.
  4. Sous-culture en cultures aérobies et anaérobies en parallèle.
    1. Mesurez la DO600 des cultures en croissance.
    2. Pour poursuivre l’incubation aérobie, sous-cultiver les cultures en croissance à une valeur deDO 600 de 0,1 dans 14 mL de milieu M9 chélaté stérile contenant 0,9 % de glucose et pas de FeSO4,7H 2O dans un flacon de 250 mL lavé à l’acide et cultiver avec aération à 26 °C pendant 12 h sans supplémentation en fer.
    3. Pour la culture anaérobie, sous-culture à une valeur OD600 de 0,1 dans 14 mL de milieu M9 chélaté stérile dans deux tubes de verre lavés à l’acide. Dans le premier tube, ajoutez du FeSO4,7H 2O stérilisé par filtre (à l’aide d’une membrane en polyéthersulfone de 0,22 μm) pour une concentration finale de 1 mg/L (appelée « haute teneur en fer »). Dans le deuxième tube, ajouter du FeSO 4,7H2O pour une concentration finale de 0,01 mg/L (appelée « faible teneur en fer »). Cela peut être fait en utilisant une solution mère de 10 mg/mL de FeSO4.7H 2O. Incuber les deux tubes en anaérobie dans une chambre anaérobie à température ambiante pendant 12 h.
      REMARQUE : 1 mg/L de FeSO4.7H 2O fournit des conditions riches en fer pour une croissance robuste de Yersinia . À l’inverse, l’ajout de seulement 0,01 mg/L de FeSO4,7H 2O aux cultures anaérobies assure une croissance suffisante dans des conditions anaérobies, mais permet tout de même des réponses de carence en fer, tandis que les cultures aérobies sont cultivées pendant 12 h en l’absence de fer ajouté pour stimuler les réponses de carence en fer avant la stimulation de l’activité de T3SS.
  5. Induire l’activité du système de sécrétion de type III.
    1. Déplacer les cultures anaérobies à 37 °C et poursuivre l’incubation anaérobie pendant 4 h pour induire le T3SS.
    2. Mesurez la DO600 de la culture en croissance aérobie.
    3. Dans deux flacons lavés à l’acide, la sous-culture des cultures en croissance aérobie jusqu’à une valeur deDO 600 de 0,2 dans 14 mL de milieu M9 chélaté stérile. Dans le premier flacon, ajoutez du FeSO4.7H 2O stérilisé par filtre pour une concentration finale de 1 mg/L. Dans le deuxième flacon, ajoutez du FeSO 4.7H2O pour une concentration finale de 0,01 mg/L. Incuber les deux flacons avec une aération à 26 °C à 250 tr/min pendant 2 h.
    4. Après 2 h, déplacer les cultures aérobies à 37 °C avec aération à 250 tr/min et incuber pendant 4 h pour induire le T3SS.

3. Précipitation de l’acide trichloracétique (TCA) des protéines effectrices T3SS

  1. Une fois l’incubation anaérobie terminée, mesurez la DO600 des cultures.
  2. Normaliser tous les échantillons anaérobies pour obtenir une masse cellulaire égale (voir l’exemple fourni dans le tableau 1). Pour la culture anaérobie, attendez-vous généralement à une valeur OD600 de ~0,5 dans les cultures affamées de fer et de ~1 pour les cultures riches en fer. Dans ce cas, utilisez 6 ml de cultures affamées de fer et 3 ml de cultures remplies de fer.
    REMARQUE : La culture restante peut être utilisée à d’autres fins, telles que la récolte de l’ARN total et l’utilisation de la PCR quantitative pour mesurer les niveaux d’ARNm cible à l’état d’équilibre (non décrits ici).
  3. Transférez les volumes normalisés de chaque culture dans des tubes de 15 ml.
  4. Pour contrôler l’efficacité de la précipitation des protéines sécrétées, ajouter 4 μL d’albumine sérique bovine (BSA) de 0,5 mg/mL dans chaque tube.
  5. Cultures de granulés à 3200 x g pendant 15 min à 4 °C.
  6. Fixez un filtre en PVDF de 0,22 μm à une seringue de 10 mL et filtrez le surnageant de chaque culture en granulés dans un tube frais de 15 mL.
    REMARQUE : Cette étape de filtration minimise les risques de transfert de cellules bactériennes entières, ce qui entraînerait la présence de protéines cytoplasmiques indésirables dans l’échantillon.
  7. Ajouter 10 % du volume surnageant de 6,1 N TCA à chaque échantillon.
  8. Agiter vigoureusement pendant 1 min. Incuber les tubes sur de la glace dans une chambre froide à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : La durée de l’incubation peut être optimisée en fonction des besoins. Une incubation aussi courte qu’une heure peut fonctionner pour des conditions ou des souches où la sécrétion est robuste.
  9. Répétez les étapes de collecte des granulés et de précipitation du TCA avec les cultures aérobies une fois l’incubation de 4 h terminée.
    REMARQUE : Normalisez les cultures aérobies en granulant des volumes de masse cellulaire équivalente.
  10. Ajouter 2 ml de chaque échantillon dans un tube frais de 2 ml et centrifuger à 21 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  11. Aspirez le surnageant à l’aide d’un accessoire à vide et veillez à ne pas toucher le fond ou les côtés du tube.
    REMARQUE : La pastille peut être difficile à visualiser et peut apparaître comme une brume sur toute la longueur du tube.
  12. Répéter les étapes 3.10 et 3.11 jusqu’à ce que tout le contenu de chaque réaction de précipitation soit précipité dans un seul tube de 2 ml. Cela peut prendre trois ou quatre étapes de centrifugation séquentielles, mais permet de concentrer toutes les protéines sécrétées de chaque échantillon dans un tube de 2 ml.
  13. Pour laver les granules, ajoutez délicatement 1 ml d’acétone 100 % glacée dans chaque tube. Pour éviter la perte d’échantillon, ne remettez pas en suspension et ne touchez pas les côtés du tube.
  14. Centrifuger les échantillons à 21 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  15. Aspirez le surnageant et veillez à ne pas toucher le fond ou les côtés du tube.
  16. Répétez les étapes de lavage à l’acétone glacée 3.13 et 3.14.
  17. Après avoir aspiré le surnageant une dernière fois, ouvrez les tubes et laissez la pastille sécher complètement sur le banc pendant environ 1 h.
  18. Ajouter 50 μL de solution FSB :DTT à chaque échantillon séché. Pour éviter la perte de protéines, ne pas remettre en suspension.
  19. Agitez soigneusement chaque échantillon pendant 1 min, en vous assurant que la solution FSB :DTT recouvre les parois de l’ensemble du tube. Cela peut être optimisé en utilisant un accessoire vortex capable de contenir plusieurs tubes à la fois.
  20. Faire bouillir les échantillons à 95 °C pendant 15 min.
  21. Centrifuger brièvement les échantillons pendant 30 s à la vitesse maximale à température ambiante.
  22. Conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

4. SDS-PAGE et coloration à l’argent pour visualiser les protéines effectrices T3SS

  1. Chargez 15 μL de chaque échantillon anaérobie et 10 μL de chaque échantillon aérobie dans un gel SDS-PAGE à 12,5 %, ainsi que 3 μL d’un étalon non coloré disponible dans le commerce comme échelle.
  2. Faites fonctionner le gel pendant environ 90 min à 100 V. Ces paramètres peuvent varier en fonction de l’appareil utilisé.
  3. Suivez le protocole de coloration à l’argent en suivant les instructions du fabricant, ce qui permet d’obtenir un gel, comme illustré à la figure 2.

5. Quantifier l’activité relative des T3SS

  1. Positionnez le gel dans le système d’imagerie, en vous assurant que toutes les bandes destinées à la quantification se trouvent dans le cadre de l’image.
    REMARQUE : Le poids moléculaire de BSA est de ~66 kDa, tandis que le poids moléculaire de la protéine effectrice T3SS YopE est de ~23 kDa.
  2. Dans le logiciel, sélectionnez toutes les bandes YopE sur tous les puits.
  3. Réglez la bande YopE de référence sur l’échantillon approprié.
  4. Exportez les valeurs de quantification relatives calculées par le logiciel pour toutes les bandes YopE.
  5. En revenant dans le logiciel, sélectionnez toutes les bandes BSA sur tous les puits.
  6. Réglez la bande BSA de référence pour vous assurer qu’elle provient du même échantillon que la bande YopE de référence.
  7. Exportez les valeurs de quantification relatives calculées par le logiciel pour toutes les bandes BSA.
  8. Pour calculer les niveaux d’expression relatifs de YopE, divisez la valeur de quantité relative de YopE par la valeur de quantité relative BSA pour chaque échantillon.

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Résultats

Cette méthode permet de comparer relativement les Yops sécrétés dans diverses conditions par rapport à une condition de référence d’intérêt. Le flux de travail expérimental global est illustré à la figure 1. Le tableau 1 présente une représentation de la façon dont la normalisation de la culture cellulaire se produirait généralement dans le cas de chaque condition de culture et du volume de TCA qui serait ajouté à chaque surnageant. Ici, des résultats représentatifs sont pré...

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Discussion

Le T3SS est un facteur de virulence important chez de nombreuses bactéries pathogènes ; Par conséquent, le développement de techniques de laboratoire pour étudier sa régulation est important pour comprendre la pathogenèse et développer des thérapies potentielles1. Le fer et l’oxygène sont connus pour être des signaux d’hôte importants détectés par les agents pathogènes bactériens pour réguler l’expression de T3SS5 ; par conséquent, cette mé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Images graphiques créées à l’aide de BioRender.com. Cette étude a été financée par la subvention des National Institutes of Health (www.NIH.gov) R01AI119082.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue Luer-Lok Tip de 10 mLBD301029
10x tampon de fonctionnement SDS  ;Tris 0,25 M faite maison, 1,92 M Glycine, 1 % SDS dans un volume de 1 L
12,5 % SDS-Page GelTubes
de 15 mLFalcon352059Pour la nuit initiale  ;
15 mL Tubes FalconFalcom352196Pour le prélèvement de surnageants
Flacon de cultureBelco251000250
500 mL Système de filtrationCorning431097
6 N Solution d’acide chlorhydriqueFisher Scientific7732185
AcétoneFisher ChemicalA949-44 L
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging SystèmeBio RadNuméro de modèle : Universal Hood III
Tubes de culture en verre borosilicateFisherbrand14-961-34Pour la culture anaérobie
Chelex 100 RésineBio Rad142-1253
Chelex M9 +0,9 % Glucose Médiafaitmaison6 g/L de Na2HPO4, 3 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1 % d’acides caminogènes, 0,9 % dextrose, 0,0005 % thiamine, 5 g/L de résine Chelex 100. Agiter le média pendant 18 h à température ambiante, filtrer à l’aide de l’unité de filtration Corning de 500 mL, puis ajouter du MgSO4 pour 1 mM de MgSO4 solution
finale Tampon d’échantillon final (FSB)Faitmaison0,1 M de Tris-HCl, 4 % de SDS, 20 % de glycérol, 0,2 % de bleu de bromophénol
FSB : Solution DTTLogicielTNT FSB+0.2M
Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8ZLogiciel
Isotemp Heat BlockFisher Scientific88860021
LB Plaques de gélosefaites10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl, 15 g de gélose dans un volume total de 1 L. Milieu de glucose autoclavé
M9+0,2 %Fait6 g/L de Na2HPO<>4, 3 g/L de KH2PO<>4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1 % d’acides casaminés, 0,2 % de dextrose, 0,0005 % de thiamine.
Millex-GP PES 0.22um Accessoire de filtre pour seringueMilliporeSLGPR33RSPour la filtration FeSO47H2O
Millex-GV PVDF 0.22um Accessoire de filtre pour seringueMilliporeSLGVR33RSPour la filtration surnageante
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
Appareil de gel SDS-PAGERadNuméro de modèle : Mini PROTEAN Tetra Cell
Kit de coloration à l’argent SilverXpress  ;InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI ScientificBDRAA1155 Solution d’acide
trichloracétique 6.1NSigma AldrichT0699
Vinyl AnaérobieChamber Coy Lab Produitshttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Primer sequences  ;
yfeA avant - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd forward - ccagcatcagccccatacag
bfd reverse - tggcttgtcggatgcacttc
yopE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE inversé - CTTGGCATTGAGTGATACTG
Base de culture maison de laboratoire d’images Bio maison maison Bio

Références

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