Méthodes alternatives pour la détection de la génération d’anions superoxyde dans les plaquettes

Résumé

La génération d’anions superoxydes est essentielle pour la stimulation des plaquettes et, si elle est dérégulée, critique pour les maladies thrombotiques. Nous présentons ici trois protocoles pour la détection sélective des anions superoxyde et l’étude de la régulation plaquettaire dépendante de l’oxydoréduction.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules contenant de l’oxygène très instables. Leur instabilité chimique les rend extrêmement réactifs et leur donne la capacité de réagir avec des molécules biologiques importantes telles que les protéines, les acides nucléiques et les lipides. Les anions superoxydes sont des ROS importants générés par la réduction de la réduction moléculaire de l’oxygène (c’est-à-dire l’acquisition d’un électron). Malgré leur implication initiale exclusivement dans le vieillissement, les processus dégénératifs et pathogènes, leur participation à d’importantes réponses physiologiques est récemment devenue apparente. Dans le système vasculaire, il a été démontré que les anions superoxydes modulent la différenciation et la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires, la prolifération et la migration des cellules endothéliales vasculaires dans l’angiogenèse, la réponse immunitaire et l’activation des plaquettes dans l’hémostase. Le rôle des anions superoxydes est particulièrement important dans la dérégulation des plaquettes et les complications cardiovasculaires associées à une pléthore de conditions, notamment le cancer, les infections, l’inflammation, le diabète et l’obésité. Il est donc devenu extrêmement pertinent dans la recherche cardiovasculaire de pouvoir mesurer efficacement la génération d’anions superoxydes par les plaquettes humaines, de comprendre les mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’équilibre entre l’hémostase et la thrombose et, éventuellement, d’identifier de nouveaux outils pharmacologiques pour la modulation des réponses plaquettaires conduisant à la thrombose et aux complications cardiovasculaires. Cette étude présente trois protocoles expérimentaux adoptés avec succès pour la détection des anions superoxydes dans les plaquettes et l’étude des mécanismes dépendants de l’oxydoréduction régulant l’hémostase et la thrombose : 1) détection d’anions superoxydes à base de dihydroéthidium (DHE) par cytométrie en flux ; 2) visualisation et analyse des anions superoxydes à base de DHE par imagerie plaquettaire unique ; et 3) la quantification par sonde de spin de la production d’anions superoxydes dans les plaquettes par résonance paramagnétique électronique (EPR).

Introduction

L’anion superoxyde (O₂^•-) est le ROS le plus pertinent sur le plan fonctionnel généré dans les plaquettes¹. O₂^•- est le produit de la réduction de l’oxygène moléculaire et le précurseur de nombreux ROS ² différents. La dismutation de O₂^•- conduit à la génération de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) par des réactions spontanées en solution aqueuse ou des réactions catalysées par des superoxydes dismutases (SODs³). Bien que différentes sources enzymatiques aient été suggérées (par exemple, la xanthine oxydase⁴, la lipoxygénase⁵, la cyclooxygénase^{6 et} l’oxyde nitrique synthase⁷), la respiration mitochondriale ^8,9 et les nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxydases (NOXs⁾¹⁰ sont les sources les plus importantes d’anion superoxyde dans les cellules eucaryotes. Cela semble également être le cas dans les plaquettes, où la fuite d’électrons de la respiration mitochondriale^11,12 et l’activité enzymatique des NOX^13,14 ont été décrites comme les principaux contributeurs à la production d’anions superoxydes.

Bien que plusieurs études se soient intéressées à la régulation des plaquettes par l’O₂^•-, il n’y a pas de consensus sur les mécanismes moléculaires responsables. La modulation de l’activité des récepteurs de surface via l’oxydation directe et la formation de liaisons disulfure a été proposée pour différents récepteurs plaquettaires. La régulation positive de l’intégrine αIIbβ3 par les ROS via l’oxydation directe des résidus de cystéine a été suggérée 15,16,17. De même, étant donné que les réponses plaquettaires au collagène dépendent de la dimérisation dépendante du disulfure et de la dimérisation conséquente de la glycoprotéine VI (GPVI)¹⁸, la potentialisation de l’activité du récepteur par oxydation dépendante des ROS a été proposée¹⁹, bien que non entièrement prouvée expérimentalement. Enfin, il a été démontré que l’oxydation induite par les ROS des groupes sulfhydryles de la glycoprotéine Ib (GPIb) favorise l’adhésion plaquettaire et l’interaction plaquettes-leucocytes pendant l’inflammation²⁰. Inversement, comme conséquence possible de la diminution de l’oxydation du groupe sulfhydryle et de l’activation des récepteurs, l’élimination de l’ectodomaine de GPVI et GPIb est diminuée par les conditions réductrices²¹.

Des modes d’action indépendants d’une oxydation directe des récepteurs de surface plaquettaire ont également été proposés. Il a été démontré que les ROS, y compris l’O₂^•-, modulent positivement le récepteur de collagène GPVI en atténuant l’activité de la protéine tyrosine phosphatase 2 (SHP-2), qui régule négativement la cascade de signalisation de ce récepteur²². De plus, l’O₂^•- peut générer de l’ONOO^- (peroxynitrite) par réaction rapide avec l’oxyde nitrique (NO), qui inhibe normalement les plaquettes par l’intermédiaire de la guanylyl cyclase sensible au NO (NO-GC) et la génération du régulateur plaquettaire négatif GMP cyclique (^GMPc)23,24. La diminution des niveaux de NO qui en résulte peut entraîner une potentialisation plaquettaire. Par ailleurs, il a été suggéré que la génération d’O₂^•- par NOX2 contribue à la peroxydation lipidique et à la formation d’isoprostane, ce qui est essentiel à l’activation et à l’adhésion des plaquettes²⁵. Enfin, la protéine kinase extracellulaire régulée par le signal 5 (ERK5), une protéine kinase proposée comme capteur de stress redox dans les plaquettes²⁶, est activée par O₂^•- et induit un phénotype procoagulant dans les plaquettes (tel qu’estimé par la mesure basée sur la cytométrie en flux de l’externalisation de la phosphatidylsérine)²⁷.

La dérégulation de la génération d’O₂^•- et d’autres ROS dans les plaquettes a été associée à une réponse hémostatique exagérée entraînant des complications cardiovasculaires thrombotiques associées à l’athérosclérose, au diabète sucré, à l’hypertension, à l’obésité et au cancer^28,29. Dans ces contextes pathologiques, la production de ROS par les plaquettes est augmentée, ce qui conduit à une potentialisation de leurs réponses adhésives et agrégatoires. En plus de l’effet sur les réponses plaquettaires, la production de radicaux libres par les plaquettes peut avoir des conséquences sur d’autres cellules sanguines et structures vasculaires, ce qui est un domaine^{de la santé} cardiovasculaire mal compris et sous-étudié. Malgré notre compréhension limitée des mécanismes moléculaires reliant le stress oxydatif aux conditions thrombotiques, la pertinence clinique des antioxydants pour la protection contre les maladies cardiovasculaires a fait l’objet d’une attention considérable. Il a été démontré que les niveaux d’antioxydants plasmatiques sont inversement corrélés avec le risque de développer des maladies cardiovasculaires, et il a été démontré que la consommation d’antioxydants alimentaires protège contre les maladies coronariennes^31,32. Par conséquent, l’utilisation d’antioxydants alimentaires a été préconisée comme une approche prometteuse pour la prévention des maladies cardiovasculaires 33,34,35. Parmi les effets de la génération de ROS dans les plaquettes, l’augmentation de l’apoptose peut avoir des effets physiopathologiques importants^36,37. Dans l’ensemble, des protocoles fiables pour détecter et quantifier la production d’O₂^•- par les plaquettes sont de plus en plus pertinents dans la recherche cardiovasculaire.

À l’heure actuelle, les techniques disponibles pour la détection des ROS présentent d’importantes limites en termes de spécificité (c’est-à-dire que la nature chimique des molécules oxydantes détectées est inconnue) et de fiabilité (c’est-à-dire que l’interaction indésirable avec les molécules biologiques et les réactifs expérimentaux conduit à des résultats non physiologiques biaisés)^38,39. L’approche la plus couramment utilisée pour la détection des ROS dans les plaquettes est basée sur l’utilisation du diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFDA), qui est converti en dichlorodihydrofluorescéine (DCFH) par les estérases intracellulaires et par conséquent en dichlorofluorescéine hautement fluorescente (DCF) par les oxydants cellulaires, y compris les radicaux hydroxyles et les intermédiaires de la peroxydase-H₂O₂ ^40,41. Malgré sa large utilisation, de sérieuses questions ont été soulevées quant à la fiabilité de cette approche pour la mesure des ROS³⁸ intracellulaires. L’oxydation du DCFH en DCF peut en effet être induite par des ions de métaux de transition (par exemple, Fe²⁺) ou des enzymes contenant de l’hème (par exemple, les cytochromes) au lieu de ROS⁴². De plus, le DCFDA est converti par les peroxydases cellulaires en sa forme de radical libre semiquinone (DCF^•-), qui est à son tour oxydée en DCF par réaction avec l’oxygène moléculaire (O₂) avec la libération de O₂^•-, ce qui conduit à l’amplification artificielle des réponses oxydatives 41,43,44. Par conséquent, la détection des ROS intracellulaires par le DCFDA est utile pour obtenir des informations initiales, mais nécessite une réflexion prudente et des contrôles expérimentaux approfondis^38,39.

Cette étude présente trois techniques alternatives pour la détection et la mesure du régulateur clé de la fonction plaquettaire O₂^•-1. La première technique est la détection à l’aide de la DHE et de la cytométrie en flux, qui offre des avantages de fiabilité et de spécificité par rapport à la DCFDA. La deuxième technique proposée ici utilise également la DHE, mais la méthode de détection est l’imagerie par fluorescence plaquettaire en direct, qui permet d’étudier la génération d’O₂^•- lors de la signalisation plaquettaire avec une cinétique rapide et une résolution unicellulaire. Enfin, un protocole basé sur l’utilisation de la sonde de spin d’hydroxylamine 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH) dans des expériences de résonance EPR offre la possibilité de quantifier le taux de génération d’O₂^•- par les plaquettes et de le comparer dans différentes conditions.

Protocole

Le prélèvement de sang périphérique sur des volontaires consentants est approuvé par le comité d’éthique local et l’autorité nationale de recherche en santé du service national de santé (référence REC : 21/SC/0215 ; Numéro d’identification IRAS : 283854).

1. Méthode 1 : Détection des anions superoxydes à l’aide de la DHE par cytométrie en flux

1. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
2. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
3. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
4. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
5. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM d’acide sulfonique 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthane sulfonique (HEPES), 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH de 7,3) (37 °C) à une densité de 2 x 10⁸ plaquettes/mL.
6. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
7. Préparez la DHE dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration de matière première de 5 mM.
8. Ajouter la DHE à la suspension plaquettaire à une concentration finale de 5 μM (diluer la solution mère 1 à 1 000, avec une concentration finale de DMSO de 0,1 % v/v) et incuber pendant 15 min à 37 °C.
9. Traiter les plaquettes avec des agents pharmacologiques et/ou des piégeurs de ROS pendant 15 minutes avant la stimulation avec les stimuli physiologiques et les concentrations souhaités (par exemple, 0,1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène).
10. Après stimulation, diluer les suspensions plaquettaires 1 à 10 dans un tampon HEPES modifié glacé.
11. Pour la cytométrie en flux, utilisez le gain de diffusion latérale (SSC) et de diffusion directe (FSC) à 40 mV et 220 mV, respectivement, et utilisez des diagrammes de dispersion à l’échelle logarithmique pour visualiser la population de particules en suspension (exemple de la figure 1A).
12. (FACULTATIF) Immunocoloration d’une aliquote de suspension plaquettaire à l’aide d’un anticorps anti-CD41 pour identifier la population d’événements correspondant aux plaquettes (exemple sur la figure 1B).
13. Analysez des échantillons par cytométrie en flux en utilisant l’excitation à 405 nm (laser violet) et l’émission à la longueur d’onde de 580 nm, qui détecte sélectivement le produit spécifique de l’anion superoxyde 2-hydroxy-éthidium (2OH-Et+) (Figure 2).
    REMARQUE : La fixation avec du paraformaldéhyde et le stockage à long terme des échantillons ne sont pas conseillés.

2. Méthode 2 : Détection d’anions superoxydes à l’aide de la DHE par imagerie par fluorescence plaquettaire unique

1. Le jour de l’expérience, enduire une lame de μ à 8 puits avec 0,1 mg/mL de collagène fibrillaire I provenant de tendons équins (collagène Horm), 0,2 mg/mL de fibrinogène ou 1 mg/mL de poly-L-lysine (PLL) dans un tampon Tyrode modifié pendant 2 h à 37 °C.
2. Laver deux fois avec le tampon Tyrode modifié (10 min chacun).
3. Homologation de l’adhérence non spécifique par incubation dans un tampon de Tyrode modifié plus 5 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) pendant au moins 30 minutes (ou jusqu’à l’expérience).
4. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
5. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
6. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
7. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
8. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM d’HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucose, pH de 7,3) (37 °C) à une densité de 4 x 10⁷ plaquettes/mL.
9. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
10. Préparer la DHE dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration de stock de 10 mM.
11. Ajouter de la DHE à une concentration finale de 10 μM dans la suspension plaquettaire (diluer la solution mère 1 à 1 000, avec une concentration finale de DMSO de 0,1 % v/v) et incuber pendant 1 min (37 °C).
12. Après 1 min d’incubation avec DHE, retirez la solution de blocage des puits choisis, positionnez la lame de μ sur la platine du microscope prête pour l’imagerie et distribuez doucement les plaquettes.
13. Surveillez la conversion de la DHE en 2OH-Et+ par imagerie confocale inversée pendant 10 min (405/580 nm ex/em), avec des images collectées toutes les 10 s avec un objectif d’immersion dans l’huile 40x.
14. (FACULTATIF) Pour les puits recouverts de PLL, surveiller la production d’anions superoxyde en réponse à un agoniste soluble (p. ex., 0,1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène) en ajoutant l’agoniste 10 minutes après la distribution des plaquettes et la collecte d’images de fluorescence pendant 10 minutes supplémentaires, comme décrit à l’étape 2.13.
15. (FACULTATIF) Au besoin, ajouter des piégeurs d’anions superoxydes ou des inhibiteurs sélectifs (p. ex., inhibiteur de NOX) en distribuant doucement sur le côté du puits pendant la durée et recueillir des images de fluorescence comme décrit à la section 2.13 pendant 10 minutes supplémentaires.
16. Quantifiez l’analyse de fluorescence unicellulaire en sélectionnant la région d’intérêt (ROI) contenant des plaquettes uniques représentatives et en analysant l’intensité de fluorescence dans différentes images avec l’outil de mesure de la suite d’imagerie ImageJ 1.53t.

3. Méthode 3 : Détection de l’anion superoxyde par les plaquettes à l’aide de la résonance paramagnétique électronique (EPR)

1. Préchauffer (37 °C) la solution de citrate de sodium (4 % p/v) et l’utiliser comme anticoagulant en l’ajoutant directement au sang au moment de la ponction veineuse dans un rapport de 1:7 (0,5 % p/v final).
2. Prélever du sang humain périphérique de volontaires sains par ponction veineuse cubitale médiane.
3. Obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP) à partir du sang total par une étape initiale de centrifugation à 200 x g pendant 20 min.
4. Centrifuger le PRP à 500 x g pendant 10 min avec les inhibiteurs plaquettaires réversibles indométacine (10 μM) et PGE1 (40 ng/mL).
5. Remettre en suspension la pastille plaquettaire obtenue dans le tampon de Tyrode modifié (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glucose, pH 7,3) (37 °C) à une densité de 2 x 10⁸ plaquettes/mL.
6. Après l’isolement, laisser reposer les plaquettes pendant 30 min à 37 °C.
7. Ajouter 5 μM de diéthyldithiocarbamate (DETC) et 25 μM de déféroxamine à la suspension plaquettaire.
8. Sans incubation, ajouter 200 μM de 1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH).
9. Chargez les échantillons sur l’agrégateur à l’intérieur des cuvettes d’agrégation (y compris les aimants d’agitation recouverts de téflon).
10. Après 1 min, ajoutez les stimuli à la concentration souhaitée (par exemple, 1 unité/mL de thrombine ou 3 μg/mL de collagène). Incuber pendant 10 min.
11. (FACULTATIF) Obtenez la génération d’anions superoxydes à différents moments en passant à l’étape 3.12 au moment souhaité.
12. Transférez la suspension plaquettaire de la cuvette d’agrégation dans un tube de microcentrifugation et tournez-la rapidement à 6 000 x g pendant 10 s.
13. Chargez 50 μL du surnageant dans des micropipettes capillaires et scellez-les avec de la cire à cacheter EPR.
14. Transférez les échantillons vers le scanner EPR.
15. Réglez le scanner EPR comme suit : champ central 3 492,5 G, balayage de champ 60 G, amplitude de modulation 2 G, temps de balayage 10 s, nombre de balayages 10, fréquence micro-ondes 9,39 GHz, puissance micro-ondes 20 mW, temps de conversion 327,68 ms, constante de temps 5242,88 ms.
16. Estimez l’oxydation du CMH en CM^● comme l’aire sous la courbe (AUC) des pics EPR enregistrés à l’aide des paramètres ci-dessus.
17. Construisez une courbe d’étalonnage traçant l’intensité de l’EPR mesurée comme décrit à l’étape 3.16 sur l’axe des y et les concentrations du CM^● disponible dans le commerce sur l’axe des x (par exemple, 0, 0,3, 1, 3, 10 et 30 μM).
18. À partir de la concentration CM^● dans les échantillons, obtenir la quantité d’anion superoxyde générée par les plaquettes dans les échantillons à l’aide des formules décrites dans la section Résultats représentatifs.

Résultats

Pour la détection par cytométrie en flux de la fluorescence de la DHE, nous montrons des résultats représentatifs pour les plaquettes au repos (Figure 3A) ou stimulées avec 0,1 unité/mL de thrombine (Figure 3B). La production d’O₂^•- a été quantifiée en tant qu’intensité moyenne de fluorescence plaquettaire (MFI), comme le montre la stimulation avec 0,1 unité/mL de thrombine (figure 3C) ou 3 μg/mL de peptide lié au collagène (CRP) (figure 3D). Une augmentation de deux à trois fois de la coloration à la DHE a été observée à la suite de la stimulation plaquettaire. Pour confirmer que l’O₂^•- est mesuré, nous suggérons d’utiliser la superoxyde dismutase pégylée piégeuse O₂^•- perméable aux cellules (PEG-SOD, 100 unités/mL), tandis que pour identifier la source de l’O₂^•-, nous avons utilisé l’inhibiteur de NOX VAS2870 (10 μM). Pour le collagène et la thrombine, PEG-SOD et VAS2870 aboli l’augmentation de la fluorescence de la DHE causée par l’activation plaquettaire, confirmant que la mesure est spécifique de l’O₂^•- et que leurs sources dans ces conditions sont les enzymes NOX.

Pour la détection par imagerie de la fluorescence DHE, nous présentons des données provenant d’expériences évaluant la génération de O₂^•- au moment de l’adhésion au collagène ou au fibrinogène (et les 10 minutes suivantes) (Figure 4A) ou d’expériences visant à évaluer la génération de O₂^•- à partir de plaquettes précédemment adhérées à la PLL lors d’une stimulation par la thrombine (Figure 4B). Comme prévu, l’adhésion à la PLL ne déclenche pas une production robuste de O₂^•-. Très probablement parce que cette forme d’adhésion dépend d’une interaction électrostatique sans l’initiation d’une réponse de signalisation⁴⁵, ce qui rend cette approche adaptée pour mesurer la sortie d’O₂^•- en réponse à l’ajout d’agonistes solubles. Pour confirmer que ce protocole permet la détection de l’O₂^•-, on peut utiliser des charognards ou des inhibiteurs sélectifs. Nous avons montré dans des études antérieures que la N-acétyl-cystéine (NAC) peut récupérer l’O,₂^•- et abolir la fluorescence plaquettaire dans ces^{expériences46}. Ici, nous montrons que l’inhibiteur sélectif des NOX VAS2870 efficacement et instantanément réduit la fluorescence des plaquettes adhérant au collagène ou au fibrinogène (Figure 4A) ou répondant à la thrombine (Figure 4B). Cela suggère que les NOX sont la source d’O₂^•- dans ces conditions expérimentales. Des films représentatifs de la fluorescence de la DHE (excitation de 405 nm) en réponse à l’adhésion au collagène ou au fibrinogène ou à la stimulation par la thrombine des plaquettes adhérant à la PLL sont inclus dans le fichier supplémentaire 1, le fichier supplémentaire 2 et le fichier supplémentaire 3, respectivement. Il convient de noter que le PEG-SOD, qui a été utilisé avec succès dans d’autres configurations expérimentales en tant que piégeur d’O₂^•- , n’est pas efficace dans ce type d’expérience. Nous n’avons pas d’explication claire à cela pour le moment. Nous pouvons émettre l’hypothèse que PEG-SOD atteint les compartiments cellulaires dans lesquels O₂^•- induit une fluorescence accrue dans les tests basés sur l’imagerie, soit avec une efficacité médiocre, soit avec une cinétique lente. D’autres investigations ciblées pourraient être nécessaires pour clarifier ce point.

Nous avons appliqué la mesure de l’O₂^•- par EPR dans les plaquettes dans différentes études publiées précédemment 1,13,47,48,49,50. Une étape cruciale pour cette technique est la préparation d’une courbe d’étalonnage à l’aide de CM^● disponible dans le commerce (c’est-à-dire le produit de la réaction entre la sonde de spin CMH et O₂^•- et l’espèce résonnante mesurée par EPR). La réaction du CMH et de l’O₂^•- est illustrée à la figure 5A, et la figure 5B montre des exemples représentatifs du signal EPR induit par différentes concentrations de CM^●. Les données de différentes concentrations de CM^● ont été utilisées pour construire une courbe d’étalonnage décrivant la corrélation linéaire entre la quantité de CMH oxydé et l’intensité du signal EPR dans les échantillons (Figure 5C). L’équation ci-dessous décrit la corrélation entre la concentration CM^● et l’intensité du signal EPR et constitue le point de départ du calcul de la courbe d’étalonnage pour les expériences de cette étude (équation 1) :

Comme les concentrations CM^● et l’intensité EPR correspondante ont été obtenues expérimentalement, la pente et l’ordonnée à l’origine de l’axe Y de la courbe d’étalonnage peuvent être calculées. Dans l’exemple de la figure 5C, pente = 1 002 169 et ordonnée à l’origine = 596 383. Par conséquent, l’équation de la courbe d’étalonnage peut être réécrite comme suit :

En réorganisant l’équation ci-dessus, il est possible de calculer la concentration CM^● pour différents échantillons en fonction de leurs valeurs d’intensité EPR (équation 2) :

Une fois que la concentration de CM^° dans les échantillons est connue, il est possible de calculer son taux de génération par plaquette et unité de temps avec l’équation ci-dessous (Équation 3) :

À l’aide de l’équation 2, l’équation 3 peut être réécrite comme suit (équation 4) :

Ce qui, dans l’exemple illustré à la figure 5C , peut être réécrit comme suit :

Le taux d’oxydation du CMH sera exprimé en attomoles de CM^● générés par plaquette et par minute. Cette valeur peut être utilisée pour comparer le taux de génération d’O₂^•- entre les expériences et les donneurs, ce qui n’est pas possible avec des sondes fluorescentes comme la DHE (ou DCFDA). Les sondes fluorescentes ne permettent généralement d’estimer l’effet de différentes conditions sur la génération d’O₂^•- que sous forme de changements d’intensité de fluorescence au sein d’une même expérience. Comme pour toutes les techniques décrites dans cet article, la spécificité de la détection a été confirmée avec des piégeurs de ROS (par exemple, PEG-SOD, NAC) ou des inhibiteurs sélectifs d’enzymes générant des anions superoxydes (par exemple, VAS2870 pour inhiber les NOX). Ici, nous présentons des données pour la stimulation plaquettaire (Figure 6) avec de la thrombine (Figure 6A,C,E) ou du collagène (Figure 6B,D,F). Pour les deux agonistes, le PEG-SOD a été utilisé pour confirmer que l’O₂^•- est détecté, tandis que l’absence d’effet de la catalase pégylée (PEG-Cat.) suggère que le peroxyde d’hydrogène n’est pas détecté par cette technique (figures 6C et D, respectivement). VAS2870 abolit les signaux EPR induits par la thrombine (Figure 6E) et le collagène (Figure 6F), suggérant que les NOX sont la principale source de plaquettes O₂^•- en réponse à ces deux agonistes.

Figure 1 : analyse par cytométrie en flux de suspensions plaquettaires. (A) Présentation typique des graphiques de diffusion directe (FSC) et latérale (SSC) pour les plaquettes isolées. (B) L’immunocoloration de la suspension plaquettaire avec un anticorps anti-CD41 confirme que >98 % des particules de la préparation sont des plaquettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Réaction chimique de la DHE avec l’anion superoxyde et d’autres ROS et propriétés spectrales de ses produits. Structure et propriétés spectrales de la DHE et de ses deux produits d’oxydation : le 2-hydroxy-éthidium (2OH-Et+), généré par réaction avec des anions superoxydes, et l’éthidium (Et+), généré par réaction avec d’autres types de ROS (par exemple, le radical hydroxyle et le peroxyde d’hydrogène). Le pic d’excitation à 405 nm, mis en évidence par un rectangle bleu pointillé sur la figure, est spécifique à 2OH-Et+ et peut donc être utilisé pour détecter/mesurer O₂^•-. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Génération d’anions superoxydes dépendante de la thrombine et du collagène détectée par DHE et cytométrie en flux. Histogrammes représentatifs de la coloration à la DHE des plaquettes (A) au repos et (B) stimulées par la thrombine. La barre indique des valeurs de coloration à la DHE inférieures à 500, soit 70,7 % et 16,1 % pour les plaquettes au repos et stimulées par la thrombine, respectivement. Cette technique a été utilisée pour estimer la génération d’anions superoxydes dans (C) 0,1 unité/mL de thrombine et (D) 3 μg/mL de plaquettes stimulées par le collagène. La PEG-SOD (100 unités/mL) a été utilisée pour confirmer que les anions superoxydes sont mesurés dans cette expérience, tandis que la VAS2870 de 10 μM a été utilisée pour identifier les enzymes NOX comme source des anions superoxydes. Chaque point de données a été calculé en fonction de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) à partir de 50 000 plaquettes, et chaque expérience a été répétée cinq fois indépendamment (n = 5), avec une ± moyenne SEM indiquée dans les graphiques. La signification statistique a été évaluée par ANOVA à un facteur avec post-test de Tukey pour des comparaisons par paires (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Génération d’anions superoxyde dépendante du collagène, du fibrinogène et de la thrombine détectée par imagerie par fluorescence DHE. (A) La cinétique de génération d’anions superoxydes a été évaluée pour les plaquettes adhérant au collagène ou au fibrinogène. Les plaquettes ont été distribuées sur des μ-lames enrobées 1 min après le début de l’imagerie, tandis que 10 μM VAS2870 ont été ajoutés 5 min après le début de la collecte d’images. (B) Cinétique de génération d’anions superoxydes pour les plaquettes lors de la stimulation par la thrombine. Les plaquettes ont pu adhérer à des μ-lames recouvertes de PLL pendant 10 minutes avant le début de la collecte d’images. Après 2 min, 0,1 unité/mL de thrombine a été ajoutée, et après 5 minutes supplémentaires, 10 μM VAS2870 ont été ajoutés (c’est-à-dire 7 min à partir du début de l’imagerie). Le schéma expérimental est présenté en haut des panneaux, tandis que des images représentatives de 0 min, 1 min, 3 min, 6 min et 9 min sont montrées au milieu des panneaux. La quantification de la fluorescence de la DHE plaquettaire unique est présentée au bas des panneaux et a été obtenue par analyse de l’intensité de fluorescence à l’aide d’ImageJ. Les données sont moyennes ± SEM de 8 à 12 plaquettes par condition dans 4 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Calcul de la courbe d’étalonnage et du taux d’oxydation du CMH. (A) Structure chimique et propriétés EPR du CMH et du CM^●. (B) Exemples représentatifs de données EPR pour différentes concentrations de CM^° (100 nM à 10 μM). (C) Courbe d’étalonnage de l’intensité de l’EPR en fonction de la concentration CM^●. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Détection de la production d’anions superoxydes par les plaquettes lors de la stimulation de la thrombine ou du collagène. La production d’anions superoxyde a été mesurée par EPR avec la sonde de spin CMH dans des plaquettes stimulées soit avec (A) 0,1 unité/mL de thrombine, soit (B) 3 μg/mL de collagène. (C, D) Une concentration de 100 unités/mL de la piégeur d’anions superoxyde PEG-SOD ou de 100 unités/mL de la catalase pégylée piégeuse de peroxyde d’hydrogène (PEG-Cat.) a été incluse dans les conditions testées pour les deux agonistes. La source de l’anion superoxyde a été étudiée par co-incubation avec l’inhibiteur de NOX VAS2870 (10 μM). La thrombine (E) et le collagène (F) dépendent tous deux de l’activité NOX pour la génération de l’anion superoxyde. Tout au long de la figure, la vitesse de réaction anionique CMH/superoxyde a été calculée à partir des traces EPR, comme décrit dans le manuscrit (équation 4). Les données sont des moyennes ± MEB de 5 (C, D) et de 4 expériences indépendantes (E, F). La signification statistique a été évaluée par ANOVA à un facteur avec post-test de Tukey pour des comparaisons par paires (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire 1 : Film représentatif de la fluorescence DHE (excitation à 405 nm) en réponse à l’adhésion au collagène. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Film représentatif de la fluorescence DHE (excitation à 405 nm) en réponse au fibrinogène d’adhésion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Film représentatif de la fluorescence de la DHE (excitation à 405 nm) en réponse à la stimulation par la thrombine des plaquettes adhérant à la PLL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce manuscrit, nous présentons trois techniques différentes ayant le potentiel de faire progresser la capacité d’étudier la régulation dépendante de l’oxydoréduction de la fonction plaquettaire via la détection sélective de O₂^•-. Les deux premières méthodes sont une amélioration par rapport aux techniques existantes en raison de la sonde redox utilisée (DHE au lieu de la DCFDA, plus courante mais moins fiable). Ces techniques sont donc facilement accessibles, et la plupart des laboratoires peuvent les adopter efficacement sans équipement particulier ni coûts de formation. La troisième technique est basée sur l’utilisation d’équipements spécialisés pour l’analyse de l’oxydation de la sonde de spin CMH par EPR. Cette technique nécessite l’achat d’équipements et de réactifs spécialisés et la formation dédiée de l’utilisateur du laboratoire. Par conséquent, il semble convenir aux laboratoires se concentrant spécifiquement sur l’étude des événements redox dépendants dans les plaquettes (ou d’autres cellules).

Pour les techniques utilisant la DHE, la sélection de la longueur d’onde pour l’excitation est cruciale pour obtenir la détection spécifique de O₂^•-. Le 2-hydroxy-éthidium (2OH-Et+) généré par la réaction de la DHE avec l’O₂^•- est excité à 405 nm, tandis que l’éthidium (Et+) généré par la réaction générale de la DHE avec les ROS (par exemple, le radical hydroxyle et le peroxyde d’hydrogène) a un pic d’excitation autour de 520 nm mais aucune excitation à 405 nm (Figure 1)⁵¹. L’utilisation de DHE au lieu de DCFDA protège des artefacts causés par la réaction directe de cette sonde avec des composants cellulaires tels que les peroxydases, d’autres enzymes contenant de l’hème et des agents réducteurs d’ions métalliques 42,43,44. La DHE a été suggérée comme un outil plus sûr pour les études d’oxydoréduction cellulaire^38,39. Ici, nous proposons l’utilisation de la DHE avec deux techniques de lecture différentes : 1) la cytométrie en flux et 2) l’imagerie de fluorescence.

La cytométrie en flux est généralement une technique qui permet de manipuler simultanément plusieurs échantillons avec un débit faible à moyen⁵². Malheureusement, l’approche utilisée dans cette étude ne permet pas la fixation de l’échantillon. Bien que la dilution des échantillons avec un tampon Tyrode modifié à froid comme de la glace stabilise la fluorescence dans les échantillons jusqu’à 30 minutes, l’analyse de tous les échantillons doit être effectuée dans ce délai. Cela limite considérablement le nombre d’échantillons par expérience. Il est possible de réaliser plusieurs expériences contrôlées en interne au cours de la même journée et en utilisant la même préparation plaquettaire, bien que les résultats doivent être normalisés par rapport aux témoins et ne pas être considérés comme des expériences indépendantes. Cette technique a été utilisée par les auteurs de ce manuscrit pour mettre en évidence le rôle de la modulation plaquettaire redox dépendante dans les réponses à différents agonistes et modulateurs^46,50. Cette méthode peut être modifiée en adoptant l’utilisation d’une version chimiquement modifiée de la DHE qui permet de cibler les mitochondries (c’est-à-dire Mitosox)⁵³, qui a été utilisé pour les études plaquettaires axées sur NOX2⁵⁴. Il s’agit d’une opportunité intéressante qui n’a pas encore été exploitée par nos laboratoires.

La technique d’imagerie par fluorescence par DHE proposée ici présente l’avantage de déterminer l’évolution temporelle de la génération d’O₂^•- dans les plaquettes lors de l’adhésion (agonistes absorbés à la surface du puits d’imagerie) ou de la stimulation (agonistes en suspension). Cela permet d’interpréter l’interaction des différentes phases du processus d’activation plaquettaire et d’évaluer la contribution de différentes sources d’O₂^•- (par exemple, différentes enzymes génératrices de ROS, par exemple, les NOX). Aucune technique existante ne permet ce type d’investigation. Cela a un coût en termes de débit de test, chaque condition testée prenant 30 minutes (ce qui comprend la configuration de μ lames, la mise au point et la sélection du terrain, l’imagerie et l’enregistrement des données). Par conséquent, cette technique permet de tester un petit nombre de conditions par jour de travail (c’est-à-dire moins de 10). Bien qu’un microscope confocal ait été utilisé pour les données présentées ici, nous avons confirmé que des résultats tout aussi bons peuvent être obtenus avec un microscope à épifluorescence avec une capacité d’excitation de 405 nm. Cela réduit le besoin de configurations de microscopie confocale coûteuses et rend cette technique plus abordable.

Le protocole EPR a été développé sur la base d’études antérieures dans différents types de cellules⁵⁵. Cette technique est largement reconnue comme l’outil le plus fiable pour l’étude de la génération de ROS et l’étude des événements dépendants de l’oxydoréduction dans les cellules³⁸. En plus d’une fiabilité supérieure par rapport à d’autres techniques en raison de la spécificité de la réaction des sondes de spin d’hydroxylamine avec les radicaux libres d’oxygène⁵⁶, l’EPR permet la quantification du taux de génération d’O₂^•- et sa comparaison entre différents individus et expériences. Cela n’est pas possible avec les techniques basées sur la fluorescence, qui ne nous permettent d’estimer l’effet de conditions sélectionnées sur l’intensité de la fluorescence qu’au sein d’une seule expérience et d’une seule préparation plaquettaire. Bien que ce protocole EPR ait été développé comme une technique à combiner avec l’agrégation plaquettaire pour la surveillance parallèle de l’activation plaquettaire et de la génération¹ d’O₂^•, ces expériences peuvent être réalisées sans l’analyse parallèle de l’agrégation. Même sans analyse parallèle de l’agrégation plaquettaire, nous suggérons d’effectuer l’incubation dans un agrégateur pour garantir une stimulation plaquettaire efficace, qui nécessite la contrainte de cisaillement fournie par un brassage continu. Si les expériences doivent être réalisées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL sans agitation, les niveaux de production d’O₂^•- sont nettement inférieurs. Par conséquent, si cette approche expérimentale est choisie, nous suggérons d’effectuer l’incubation du CMH sur une roue rotative et avec des plaquettes plus densément concentrées (c’est-à-dire 1 x 10⁹/mL), ce qui conduit à un signal suffisamment fort pour être détecté par le spectromètre EPR.

En résumé, nous présentons ici trois techniques validées pour la détection de l’O₂^•- dans les plaquettes. Ils offrent différents avantages et peuvent être choisis en fonction des objectifs et des priorités expérimentaux. La première technique basée sur l’utilisation de la DHE par cytométrie en flux est la moins laborieuse et la moins chronophage et peut donc être choisie comme analyse d’entrée de gamme. La deuxième technique, basée sur l’utilisation de la DHE par microscopie à fluorescence, permet d’apprécier la cinétique rapide de la génération d’O₂^•- et d’étudier comment différentes cascades de signalisation peuvent affecter la réponse oxydative à l’échelle de temps de quelques secondes (alors que d’autres techniques ne permettent d’étudier que les événements se produisant dans les minutes suivant la stimulation). Enfin, l’EPR permet de quantifier le taux de génération d’O₂^•- et de le comparer entre expériences et individus. Pour cette raison, cette dernière technique est particulièrement utile pour les études cliniques visant à caractériser la réponse oxydative dans les plaquettes de différents individus (par exemple, comparaison entre patients ou patients par rapport à des témoins sains). Dans l’ensemble, ces trois techniques offrent des avantages significatifs par rapport aux méthodes existantes et représentent une avancée significative dans les outils expérimentaux à notre disposition pour étudier les événements redox dépendants dans les plaquettes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-hydroxy-3-méthoxycarbonyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Réactif pour EPR (sonde de spin)
BD FACSAria III	BD Biosciences  ;	NA	Cytomètre en flux
Albumine sérique bovine	Merck/Sigma	A7030	Pour le revêtement de lames
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	; NOX-E.11-BES  ;	Spectromètre EPR
Catalase&ndash ; polyéthylène glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Piégeur de peroxyde d’hydrogène (contrôle de la spécificité)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg  ;	Réactif pour EPR (contrôle d’étalonnage)
déféroxamine  ;	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg  ;	Réactif pour EPR
diéthyldithiocarbamate (DETC)  ;	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g  ;	Réactif pour EPR
Dihydroéthidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Sonde anionique superoxyde
Diméthyl sulfoxyde	Merck/Sigma	34869	Pour la préparation de la solution mère  ;
Plaques de cire d’étanchéité EPR	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consommable pour eau de
qualité EPR	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L  ;	Réactif pour EPR
Fibrinogène issu du plasma humain	Merck/Sigma	F4883	Pour le revêtement sur lames
FITC anti-CD41 humain Anticorps	BioLegend	303704	Coloration spécifique aux plaquettes pour la cytométrie en flux
Cuvettes en verre  ;	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consommable pour l’incubation dans l’agrégateur
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	Pour la stimulation plaquettaire
ImageJ  ;	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indométacine	Merck/Sigma	I7378	Pour l’isolement plaquettaire
Micropipettes DURAN 50µ ; l	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µ ; L	Consommable pour EPR
Chlorhydrate de poly-L-lysine	Merck/Sigma	P2658	Pour le revêtement en lames
Prostaglandine E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	Pour l’isolement plaquettaire
Citrate de sodium (solution à 4 % p/v)	Merck/Sigma	S5770	Pour l’isolement plaquettaire
Barres d’agitation (recouvertes de téflon)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consommable pour l’incubation dans l’agrégateur
Superoxyde dismutase&ndash ; polyéthylène glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Piégeur d’anions superoxyde (contrôle de la spécificité)
Thrombine du plasma humain	Merck/Sigma	T6884	Pour la stimulation plaquettaire et l’enrobage de lames
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	Inhibiteur de NOX
Microscope confocal Zeiss 510 LSM	Microscope confocal	Zeiss	NA