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Article de méthode

Injection intracamérulaire chez le rat présentant un faible risque d’effets indésirables

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DOI :

10.3791/66662

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31 mai 2024

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1Ophthalmology Research Laboratory, Kaplan Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Kaplan Medical Center, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une technique d’injection intracamérale chez le rat à l’aide d’une incision cornéenne centrale et d’un long tunnel dans la chambre antérieure. Cette méthode d’injection minimise le risque d’induire des lésions tissulaires par inadvertance et améliore ainsi la précision et la reproductibilité.

Résumé

L’injection intracamérale est une routine d’administration standard en ophtalmologie. L’application de l’injection intracamérulaire chez les rongeurs pour la recherche est difficile en raison des dimensions et de l’anatomie limites de l’œil, notamment le petit volume de l’humeur aqueuse, la courbure du cristallin et l’épaisseur du cristallin. Les dommages potentiels lors des injections intracamérulaires introduisent des effets indésirables et une variabilité expérimentale. Ce protocole décrit une procédure d’injection intracamérulaire chez le rat, permettant précision et reproductibilité.

Des rats Sprague-Dawley ont été utilisés comme modèles expérimentaux. Étant donné que la position de la lentille chez le rat fait saillie dans la chambre antérieure, l’injection à partir de la périphérie, comme chez l’homme, est défavorable. Par conséquent, une incision est créée dans la région cornéenne centrale à l’aide d’une lame aiguille de 0,8 mm de calibre 31 pour former un tunnel auto-scellant dans la chambre antérieure. Une incision à un angle proche du plat permet de créer un long tunnel, ce qui minimise la perte d’humeur aqueuse et la profondeur de la chambre antérieure. Une nano-aiguille de calibre 34 est insérée dans le tunnel pour l’injection. Cela permet une pénétration avec une résistance minimale au frottement et évite de toucher l’objectif. L’injection de trypan-blue permet de visualiser par microscopie à fente la présence du colorant dans la chambre antérieure et d’exclure les fuites. La biodisponibilité pour la couche endothéliale cornéenne est démontrée par l’injection d’un colorant Hoechst, qui a coloré les noyaux des cellules endothéliales cornéennes après l’injection.

En conclusion, ce protocole met en œuvre une procédure d’injection intracamérale précise chez le rat. Cette procédure peut être utilisée pour l’administration intracamérale de divers médicaments et composés dans des modèles expérimentaux de rats, augmentant ainsi l’efficacité et la reproductibilité de la recherche ophtalmique.

Introduction

La biodisponibilité des composés délivrés par administration topique à la surface de l’œil est considérablement limitée, généralement <5 %1. Les composés administrés par les gouttes ophtalmiques sont principalement éliminés par drainage, larmoiement induit, renouvellement du liquide lacrymal et absorption conjonctivale. De plus, la perméation des composés à travers la surface oculaire est fortement limitée par la barrière cornée-conjonctive 1,2,3. La cornée est composée de trois couches principales : l’épithélium le plus externe, le stroma intermédiaire et l’endothélium le plus interne. L’épithélium cornéen superficiel est interconnecté par des jonctions fortes et serrées et crée une résistance paracellulaire élevée, qui est le principal obstacle à la perméabilité de la substance. Les multiples couches d’épithélium limitent en outre la perméation des molécules hydrophiles et de grande taille à travers les espaces intercellulaires de l’épithélium de la cornée. Succédant à l’épithélium, le stroma est composé de fibres de collagène et contient des pores aqueux. Contrairement à l’épithélium cornéen, le stroma permet le mouvement des médicaments hydrophiles ; Cependant, il est grandement imperméable aux composés lipophiles 1,2,3. Ensemble, l’épithélium cornéen et les couches stromales présentent d’importantes barrières tissulaires qui limitent l’absorption des médicaments. L’endothélium cornéen n’est pas considéré comme limitant le transport des médicaments.

L’alternative à la voie d’administration cornéenne est la voie conjonctivale. La conjonctive est une couche multi-épithéliale qui recouvre la face interne des paupières et la partie antérieure de la sclère. La conjonctive est caractérisée par moins de jonctions serrées que l’épithélium cornéen, ce qui permet une meilleure perméabilité des médicaments hydrophiles. Cependant, la vascularisation de la conjonctive entraîne une absorption systémique d’une grande fraction des molécules administrées, limitant à nouveau considérablement la biodisponibilité des composés délivrés dans la chambre antérieure 1,2. Un moyen efficace de contourner les barrières de perméabilité oculaire externes consiste à administrer le médicament directement dans la région d’intérêt. Par exemple, l’injection intravitréenne est courante pour l’administration dans l’humeur vitrée4. De même, l’injection intracamérulaire est utilisée pour l’administration dans la chambre antérieure5. L’établissement d’une concentration efficace au niveau de la chambre antérieure est essentiel dans diverses situations cliniques, telles que le traitement de l’infection par injection intracamérale d’antibiotiques et les traitements anti-inflammatoires postopératoires dans les chirurgies de la cataracte. Malgré l’avantage de l’amélioration de la biodisponibilité de la substance accordée par l’injection intracamérale, il existe des problèmes de sécurité majeurs qui doivent être pris en compte. Par exemple, l’injection intracamérulaire de drogues peut induire une augmentation de la pression intraoculaire, un syndrome du segment antérieur toxique et un syndrome de destruction des cellules endothéliales toxiques 5,6. Il est donc essentiel d’évaluer soigneusement dans les études précliniques l’efficacité et l’innocuité des médicaments administrés par injections intracamérales afin de maximiser l’efficacité du traitement et de minimiser les effets indésirables potentiels chez les patients.

Les modèles animaux expérimentaux sont indispensables dans les études précliniques pour étudier de nouveaux traitements. Les petits rongeurs, tels que les souris et les rats, sont les animaux de laboratoire les plus couramment utilisés à ces fins. Ces animaux présentent de nombreuses similitudes avec l’anatomie et la physiologie humaines, fournissant des informations précieuses. De plus, leur utilisation est économiquement avantageuse en raison de leur petite taille, de leur facilité d’entretien, de leur gestation rapide et de leur capacité à produire un grand nombre de descendants7.

Malgré l’utilisation généralisée de petits rongeurs dans les modèles de maladies oculaires, leurs dimensions oculaires et leur anatomie uniques posent des défis importants lors des manipulations expérimentales. Par exemple, des procédures telles que les injections intracamérales, qui sont relativement simples chez l’homme, deviennent techniquement exigeantes chez les souris et les rats. Les défis découlent de facteurs tels que le faible volume d’humeur aqueuse, le cristallin relativement grand et inflexible, ainsi que le positionnement obstructif et la courbure du cristallin dans les yeux des rongeurs (Figure 1)8. Ces défis augmentent le risque de dommages lors des injections intracamérulaires chez les rongeurs, entraînant des effets indésirables potentiels et introduisant une variabilité expérimentale qui peut avoir un impact sur la validité des conclusions de l’étude. Dans nos recherches, nous avons réussi à mettre au point une procédure d’injection intracamérulaire sûre chez le rat. La technique consiste à créer un long tunnel plat et auto-obturant dans la cornée jusqu’à la chambre antérieure. Cette méthode garantit non seulement la précision, mais améliore également la reproductibilité expérimentale, en répondant aux problèmes liés aux techniques d’injection chez les petits rongeurs.

Diagramme d’anatomie du rat et de l’œil humain ; Comparaison de l’iris, de la pupille, du cristallin, de la cornée, de la chambre antérieure.
Figure 1 : Représentation schématique des caractéristiques anatomiques du segment antérieur des yeux du rat et de l’homme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

Les expériences du protocole ont été approuvées par le Comité national des permis - pour la science animale et sont conformes à la déclaration de l’ARVO sur l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Des rats Sprague-Dawley femelles, âgés de 8 à 10 semaines, ont été utilisés pour la présente étude et ont été exposés à des cycles lumière-obscurité de 12/12 h. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation des animaux

  1. Préparez un mélange anesthésique de kétamine (80 mg/kg de poids corporel dans 0,8 ml) et de xylazine (4 mg/kg de poids corporel dans 0,2 ml) et injectez-le par voie intrapéritonéale en une seule injection pour anesthésier les rats.
  2. Injecter l’analgésique buprénorphine (0,03 mg/kg) par voie intrapéritonéale en une seule injection.
  3. Appliquez un anesthésique ophtalmique topique à 0,4 % d’oxybuprocaïne sur les deux yeux.

2. Création d’un tunnel cornéen auto-obturant

  1. Stabilisez l’œil en tenant la sclérotique supérieure sur la ligne médiane verticale à côté de la jonction cornéo-sclérale à l’aide d’une pince ophtalmique chirurgicale.
  2. Sous un microscope chirurgical, placez une lame aiguille stérile de 0,8 mm, 31 G dans la région cornéenne paracentrale sur la ligne médiane verticale (au-dessus du centre de la pupille) en position plate à un angle aussi proche que possible de l’horizontale (Figure 2).
  3. Dans cette position, percez la cornée pour faire une incision et créez un long tunnel (2-3 mm) jusqu’à ce qu’il pénètre dans la zone centrale de la chambre antérieure. Évitez de toucher l’objectif (Figure 2).
    REMARQUE : Un tunnel réussi n’induira pas de fuite de l’humeur aqueuse et de rétrécissement de la chambre antérieure.
  4. Appliquez localement 0,3 % de loxacine et 0,1 % de dexaméthasone dans l’œil injecté.
  5. Examinez au microscope à fente comme suit.
    1. Observez la profondeur de la chambre antérieure de l’œil injecté par rapport à l’œil non injecté.
      REMARQUE : La profondeur doit être similaire.
    2. Observez le cristallin de l’œil injecté par rapport à l’œil non injecté.
      REMARQUE : L’objectif doit être clair. L’opacité peut refléter des lésions du cristallin pendant l’intervention chirurgicale.

Schéma de chirurgie oculaire montrant l’incision de la cornée ; Lentille étiquetée, chambre antérieure, lame médicale.
Figure 2 : Représentation schématique de l’angle et de la position de la lame et de l’incision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Option 1 : Injection intracamérulaire de bleu de trypan pour évaluer la réussite de l’injection dans la chambre antérieure

  1. Chargez 5 μL de bleu trypan dans une seringue Hamilton en verre stérile de 10 μL avec une aiguille émoussée de 34 G.
    REMARQUE : L’injection de bleu de trypan est décrite comme un moyen d’évaluer le succès de l’injection pendant les étapes d’étalonnage ou de configuration du modèle. Dans les contextes expérimentaux, la seringue peut être chargée d’une solution du composé de votre choix.
  2. Insérez l’aiguille de la seringue chargée dans le tunnel créé à la section 2 dans la chambre antérieure.
  3. Injectez et maintenez l’aiguille en place après l’injection pendant 2 à 3 secondes jusqu’à ce que tout le liquide disparaisse.
  4. Retirez l’aiguille en la tirant doucement et lentement pour éviter les fuites du tunnel cornéen.
  5. Examen au microscope à fente. Évaluez la profondeur de la chambre antérieure pour exclure les eaux peu profondes et vérifiez la présence de bleu de trypan dans la chambre antérieure.
  6. Répéter l’examen de la fente après 24 h, 48 h et 72 h.

4. Option 2 : Injection intracamérulaire de Hoechst pour évaluer la biodisponibilité du matériau injecté dans la couche de cellules endothéliales

  1. Chargez 5 μL de Hoechst dans une seringue Hamilton en verre stérile de 10 μL avec une aiguille émoussée de 34 G.
    REMARQUE : L’injection de Hoechst est décrite comme un moyen d’évaluer la biodisponibilité du matériau injecté par absorption dans la couche de cellules endothéliales et est utile pendant les étapes d’étalonnage ou de configuration du modèle. Dans les contextes expérimentaux, la seringue peut être chargée d’une solution du composé de votre choix.
  2. Insérez l’aiguille de la seringue chargée dans le tunnel créé à la section 2 dans la chambre antérieure.
  3. Injectez et maintenez l’aiguille en place après l’injection pendant 2 à 3 secondes jusqu’à ce que tout le liquide disparaisse.
  4. Retirez l’aiguille en la tirant doucement et lentement pour éviter les fuites de l’incision du canal cornéen.
  5. Environ 15 à 20 minutes après l’injection, euthanasier les rats par injection intrapéritonéale de 500 mg/kg de pentobarbital sodique.
  6. Énucléer les deux yeux et isoler les cornées. Prélevez la cornée non injectée comme contrôle.
  7. Teindre les deux cornées avec 0,5 % de rouge d’alizarine S selon les instructions du fabricant pour identifier les cellules endothéliales.
  8. Examiner au microscope optique pour imager la coloration rouge d’alizarine des cellules endothéliales et au microscope fluorescent pour observer la coloration de Hoechst, par rapport à la cornée non injectée comme témoin.

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Résultats

Des rats Sprague-Dawley ont reçu une injection intracamérale de 5 μL de bleu de trypan selon le protocole décrit ci-dessus. L’examen à la lampe à fente immédiatement après l’injection a montré que la chambre était colorée au bleu trypan, ce qui indique que le matériau injecté a atteint la chambre antérieure (figure 3). De plus, la profondeur de la chambre antérieure était intacte, ce qui suggère que l’injection n’a pas causé de fuite d’humeur aqueuse et de rétrécissement de la chambre.

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Discussion

Les modèles de recherche préclinique doivent fournir un environnement contrôlé et reproductible pour garantir la fiabilité et l’applicabilité des résultats. Dans la recherche en ophtalmologie, les modèles d’injection oculaire sont couramment utilisés dans divers aspects de la recherche, allant de l’établissement de modèles de maladies, à la mise à l’essai de nouveaux traitements et à l’évaluation des réactions tissulaires et des effets indésirables potentiels.

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Déclarations de divulgation

Marcovich A. L. détient des brevets chez Steba Biotech, Yeda Weizmann, EyeYon Medical et Mor Isum et est consultant pour EyeYon Medical et Johnson & Johnson. Tous les autres auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par les subventions 2670/23 et 1304/20 de la Fondation israélienne des sciences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Rouge alizarine  ;Alpha Aesar042040.5
Buprénorphine  ;Richter pharma102047
Dexaméthasone 0,1 %·s ;Fisher Pharmaceutical393102-0413
Seringue en verre Hamilton 10 &mu ; L  ;Comté de Hamilton
HoeschstMerckB2261
KétamineBremer pharma GMBH (medimarket)17889
Ofloxacine 0,3 % gouttes ophtalmiquesAllerganE92170
Chlorhydrate d’oxybuprocaïne 0,4Fisher PharmaceuticalN/A
Pentobarbital sodique 200 mg/mLCTSN/A
Microscope à fente  ;Haag-streit bernb-90019115
Sprague-Dawley RatsEnvigoN/A
Stiletto blade 31 G 0.8 mm  ;Tecfen medical (skymed)QKN2808
Microscope chirurgicalZeissOPMI-6 CFC
Trypan BlueSartorius03-102-1B
XylazineEurovet Animal Health  ;
721711 %615648

Références

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