Article de méthode

Enregistrement de base : une technique d’analyse des réponses des neurones gustatifs chez la drosophile

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DOI :

10.3791/66665

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1 mars 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Dans cet article

Résumé

Une méthode d’enregistrement électrophysiologique rarement utilisée, l’enregistrement de base, permet d’analyser des caractéristiques du codage du goût qui ne peuvent pas être examinées par les méthodes d’enregistrement conventionnelles. L’enregistrement de base permet également d’analyser les réponses gustatives à des stimuli hydrophobes qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide des méthodes électrophysiologiques traditionnelles.

Résumé

Les insectes goûtent le monde extérieur à travers les poils gustatifs, ou sensilles, qui ont des pores à leurs extrémités. Lorsqu’un sensillum entre en contact avec une source de nourriture potentielle, les composés de la source de nourriture pénètrent par les pores et activent les neurones à l’intérieur. Depuis plus de 50 ans, ces réponses ont été enregistrées à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes. Cependant, cette méthode présente des limites majeures, notamment l’incapacité de mesurer l’activité neuronale avant ou après le contact avec un stimulus et l’exigence que les arômes soient solubles dans les solutions aqueuses. Nous décrivons ici une technique que nous appelons enregistrement de base, qui permet de surmonter ces limitations. L’enregistrement de base permet de mesurer l’activité des neurones gustatifs avant, pendant et après le stimulus. Ainsi, il permet une analyse approfondie des réponses OFF qui se produisent après un stimulus gustatif. Il peut être utilisé pour étudier des composés hydrophobes tels que les phéromones à longue chaîne qui ont une très faible solubilité dans l’eau. En résumé, l’enregistrement de base offre les avantages de l’électrophysiologie monosensille comme moyen de mesurer l’activité neuronale - haute résolution spatiale et temporelle, sans avoir besoin d’outils génétiques - et surmonte les principales limites de la technique traditionnelle d’enregistrement des pointes.

Introduction

Les insectes, y compris les mouches drosophiles, sont dotés d’un système gustatif sophistiqué qui leur permet d’extraire des informations chimiques complexes de leur environnement. Ce système leur permet de discerner la composition chimique de diverses substances, en distinguant celles qui sont nutritives et celles qui sont nocives 1,2.

Au cœur de ce système se trouvent des structures spécialisées connues sous le nom de poils gustatifs ou sensilles, stratégiquement situées sur diverses parties du corps. Chez les mouches drosophiles, ces sensilles sont situées sur le labelle, qui est le principal organe gustatif de la tête de mouche 1,2,3,4, ainsi que sur les pattes et les ailes 1,2,5,6. Le labelle est situé à l’extrémité de la trompe et contient deux lobes4, 7 et 8. Chaque lobe est recouvert de 31 sensilles gustatives classées en courtes, longues et intermédiaires 4,7,8. Ces sensilles abritent chacune 2 à 4 neurones gustatifs1, 2, 9, 10. Ces neurones gustatifs expriment les membres d’au moins quatre familles de gènes différentes, à savoir les gènes 1,2,11,13 du récepteur gustatif (Gr), du récepteur ionotrope (Ir), du pickpocket (Ppk) et du potentiel de récepteur transitoire (Trp). Cette diversité de récepteurs et de canaux donne aux insectes la capacité de reconnaître un large éventail de composés chimiques, y compris les signaux non volatils et volatils 1,2,14.

Depuis plus de 50 ans, les scientifiques quantifient la réponse des neurones gustatifs et de leurs récepteurs à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Cependant, cette méthode présente des limites majeures. Tout d’abord, l’activité neuronale ne peut être mesurée que pendant le contact avec le stimulus, et non avant ou après le contact. Cette limitation empêche la mesure de l’activité de pic spontané et empêche la mesure des réponses OFF. Deuxièmement, seuls les arômes solubles dans les solutions aqueuses peuvent être testés.

Ces limitations peuvent être surmontées par une technique électrophysiologique alternative rarement utilisée appelée « enregistrement de base ». Nous décrivons ici cette technique, que nous avons adaptée d’une méthode utilisée par Marion-Poll et ses collègues24, et montrons les caractéristiques cruciales de codage du goût qu’elle peut maintenant mesurer commodément14.

Protocole

Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de soins aux animaux de l’Université de Yale.

1. Mouches

  1. Placez 10 à 15 mouches nouvellement levées dans des flacons de culture standard frais à 25 °C et à 60 % d’humidité relative selon un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
  2. Utilisez des mouches à l’âge de 3 à 7 jours.

2. Stimuli chimiosensoriels

  1. Obtenez des stimuli chimiosensoriels de la plus haute pureté disponible. Stockez-les selon les recommandations du fournisseur jusqu’à utilisation.
  2. Dissoudre les stimuli chimiosensoriels et les diluer aux concentrations souhaitées dans de l’eau ou un autre solvant non toxique tel que l’huile de paraffine. Agiter les solutions préparées pendant au moins 1 h dans le cas de composés solides dissous.

3. Stimulus capillaire en verre

  1. Tirez un capillaire en verre pour retenir le stimulus d’un capillaire en verre borosilicaté (100 mm de longueur, 1 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’un instrument d’extraction de pipette. Visez à atteindre un diamètre de pointe compris entre 3 μm et 10 μm.
  2. Remplissez le capillaire en verre avec la solution de stimulation préférée à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur. Veillez à éviter les bulles, qui peuvent être éliminées en tapotant doucement.
  3. Si le stimulus cristallise à l’extrémité, nettoyez ou remplacez le capillaire de stimulus en verre.

4. Électrodes de référence et d’enregistrement

  1. Utilisez des tiges de tungstène (127 μm de diamètre et 76,2 mm de longueur) pour les électrodes de référence et d’enregistrement. Affûter les électrodes de référence et d’enregistrement à environ 1 μm de diamètre à l’extrémité (les formes de ces électrodes sont décrites dans Delventhal et al.36) en les trempant à plusieurs reprises pendant plusieurs secondes dans une solution de KNO3 à 10 % (~1 M) ou une solution de KOH à 10 % (1,8 M).
    REMARQUE : Cette solution nécessite un courant (0,3-3 mA) pour faciliter ce processus.

5. Préparation de la mouche pour l’enregistrement de base

  1. Prélevez une seule mouche de la fiole dans un aspirateur. Retirez l’aspirateur et piégez l’animal en plaçant un doigt sur l’extrémité.
  2. Expulsez la mouche dans une pointe de pipette en plastique de 200 μL. En gardant l’extrémité de l’aspirateur dans la pointe de la pipette, utilisez l’extrémité pour pousser la mouche vers l’avant, la tête la première, vers l’extrémité étroite de la pointe de la pipette.
  3. Coupez la pointe de la pipette à chaque extrémité (c’est-à-dire à l’avant et à l’arrière de l’animal) à l’aide d’une lame de rasoir.
  4. Utilisez de l’argile ou un petit morceau de coton pour pousser la mouche vers l’avant, jusqu’à ce que la moitié de la tête dépasse de l’extrémité de la pointe de la pipette taillée. À l’aide d’une pince, poussez doucement jusqu’à ce que le labelle à l’avant de la tête soit exposé.
  5. Fixez la pointe de pipette taillée sur une lame de microscope en verre à l’aide d’argile (Figure 1).
  6. Au stéréomicroscope, placez le labelle latéralement sur une lamelle de manière à ce qu’un lobe, ainsi que ses 31 sensilles gustatives, soient exposés (figure 1). Le couvercle maintient l’étiquette en place.

6. Plate-forme d’électrophysiologie

  1. Choisissez une pièce pour l’installation de l’appareil de forage dont la température et l’humidité relative sont stables (<70 %) et qui est isolée des sources de bruit électrique et mécanique, telles que les réfrigérateurs et les centrifugeuses.
  2. Placez le microscope au centre d’une table antivibratoire.
  3. Fixez un micromanipulateur manuel à la table antivibratoire (Figure 2).
  4. Fixez un arbre en acier inoxydable qui maintient l’électrode de référence en tungstène au micromanipulateur manuel (Figure 2).
  5. Connectez des manipulateurs motorisés - l’un avec un support pour la sonde d’électrode d’enregistrement et l’autre avec un support relié à un arbre en acier inoxydable pour le capillaire de stimulation en verre - à la même table à l’aide de supports (Figure 2).
  6. Connectez la sonde d’électrode d’enregistrement à un système IDAC (Intelligent Data Acquisition Controller) ou à un autre système d’amplificateur/numériseur.
  7. Reliez ce système IDAC à l’ordinateur du poste de travail.
  8. Mettez à la terre les manipulateurs manuels et motorisés au même endroit dans la plate-forme.
  9. Installez le logiciel d’acquisition approprié pour le système IDAC sur l’ordinateur. Assurez-vous que les pilotes d’acquisition numérique sont compatibles avec le système d’exploitation (par exemple, Windows XP-7, -8 ou -10) de l’ordinateur.

7. Enregistrement à partir de la sensille gustative

  1. Placez la lame de préparation sur la platine du microscope avec un objectif à faible grossissement (par exemple, 10x) en position. Déplacez la platine jusqu’à ce que le labelle soit net au centre du champ de vision aux objectifs à faible et à fort grossissement (par exemple, 50x).
  2. Insérez l’électrode de référence dans l’œil à l’aide de l’objectif à faible grossissement. Pour insérer l’électrode de référence, ciblez l’œil du côté de la mouche opposé au côté avec l’électrode d’enregistrement, par exemple, si l’électrode d’enregistrement s’approche de la droite, placez l’électrode de référence dans l’œil gauche. Utilisez un micromanipulateur manuel pour une insertion précise.
  3. Faites la mise au point sur l’extrémité du capillaire de stimulus du verre au centre du champ de vision des objectifs à faible et à fort grossissement à l’aide d’un micromanipulateur motorisé (Figure 3).
  4. Sous un faible grossissement, approchez l’électrode d’enregistrement du labelle à l’aide d’un deuxième micromanipulateur motorisé.
  5. Sous un grossissement élevé, insérez l’électrode d’enregistrement dans la base d’un sensillum gustatif à l’aide du micromanipulateur motorisé jusqu’à ce que le son de l’activité neuronale de la sortie audio du système IDAC soit entendu.
  6. Une fois qu’un signal stable a été établi, commencez à enregistrer le signal à l’aide du logiciel fourni avec le système IDAC (Figure 4A-D). Pour démarrer l’enregistrement, appuyez sur le bouton Démarrer l’enregistrement.
  7. Amenez l’extrémité du stimulus capillaire en verre pour couvrir l’extrémité du sensillum gustatif à l’aide du manipulateur motorisé.
  8. Pour terminer le stimulus, retirez le capillaire de stimulation en verre du sensillum à l’aide du manipulateur motorisé.
  9. Marquez manuellement le début et la fin de la stimulation à l’aide d’une pédale. La pédale est connectée à l’IDAC, et sa communication avec le logiciel est facilitée par l’IDAC pour marquer le début/la fin du stimulus.

8. Analyse

  1. Utilisez les différentes fonctions du logiciel fourni avec le système IDAC pour trier les populations de pics par amplitude (lorsque cela est possible) et analyser la dynamique des réponses.
    1. Pour compter les pointes, faites un clic gauche sur l’enregistrement qui vous intéresse, faisant apparaître une fenêtre parmi laquelle choisir. Choisissez Jusqu’aux pics, en lançant une autre fenêtre nommée Convertir les vagues en pics. Entrez un nom dans le champ Nouveau et appuyez sur le bouton OK .
    2. La saisie du nom dans le champ Nouveau à l’étape 8.1.1 permet d’accéder à la vue Histogramme d’amplitude . Choisissez l’amplitude à compter, puis fermez cette vue. Faites un clic gauche pour ajouter un compteur.
    3. Examinez les pics manuellement pour confirmer les conclusions basées sur l’analyse à l’aide d’un logiciel.
      REMARQUE : Le logiciel permet également l’exportation de données dans différents formats pour une analyse plus approfondie.

Résultats

La figure 4A montre des pointes spontanées qui naissent d’un sensillum. Ils se divisent en deux classes en fonction de l’amplitude, les pointes les plus grandes dérivant du neurone sensible aux composés amers et les pointes plus petites du neurone qui répond aux sucres. La relation entre l’amplitude du pic et la spécificité fonctionnelle a été corroborée par des expériences génétiques 4,14,37,38,39 .

La figure 4B montre la réponse du neurone sensible à l’amertume du S5 sensillum à l’odeur du DEET ; cette réponse s’est produite sans aucun contact entre la solution de DEET et le sensillum. Une pointe semble être d’amplitude intermédiaire et peut résulter de la superposition de deux pointes plus petites, l’une du neurone à sucre et l’autre du neurone mécanosensoriel.

La figure 4C montre la réponse ON qui se produit après le contact entre un stimulus amer et le sensillum I1, suivie d’une réponse OFF qui se produit après la fin du contact. Non pas que l’amplitude de la réponse OFF, mesurée en pointes/s, soit supérieure à la réponse ON.

La figure 4D montre une réponse ON et une réponse OFF au composé amer berbérine à partir d’un sensillum I1 d’une autre espèce de mouche, Drosophila virilis. L’un des avantages de cette technique est qu’elle peut être réalisée sur d’autres espèces, y compris les moustiques, sans qu’il soit nécessaire d’y introduire des transgènes.

La figure 4E illustre deux problèmes qui peuvent survenir pendant l’enregistrement. Tout d’abord, si le labelle n’est pas correctement fixé, il peut se déplacer, produisant des pointes à partir du neurone mécanosensoriel du sensille. Deuxièmement, l’électrode d’enregistrement peut se déloger du sensil, souvent à la suite d’un mouvement du labelle. Dans ce cas, le contact est perdu et l’électrode doit être réinsérée pour enregistrer les pointes.

figure-results-1
Figure 1 : Préparation du vol pour l’enregistrement de base. Une pointe de pipette taillée contenant une mouche femelle avec l’étiquette solidement placée sur une lamelle en verre. (A) La pointe de la pipette et la lamelle sont maintenues en toute sécurité sur des monticules d’argile. (B) Grossissement plus élevé du labelle reposant sur une lamelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Configuration du banc d’électrophysiologie. (A) Vue d’ensemble montrant les positions d’un micromanipulateur manuel pour l’électrode de référence, d’un micromanipulateur motorisé pour le capillaire de stimulus en verre et d’un micromanipulateur motorisé pour l’électrode d’enregistrement. (B) Vue d’ensemble montrant les supports de l’électrode de référence, du capillaire de stimulus en verre et de l’électrode enregistreuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Le labelle et la sensille. (A) Le labelle sous un microscope inversé. Gros plan du labelle montrant la sensille gustative d’un lobe du labelle. Il montre également le stimulus capillaire en verre proche de l’une des grandes sensilles connues sous le nom de L2 (Large type 2) et d’une électrode enregistreuse à la base de ce sensille. (B) Accessibilité de la sensille labellaire. Le labelle montrant des sensilles qui sont facilement accessibles à l’enregistrement de base et des sensilles qui sont moins accessibles en raison de leur position dans la préparation que nous utilisons généralement. Abréviations : A = antérieur ; M = médial ; P = postérieur ; L = latéral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Exemple de traces de pointes spontanées, de réponses neuronales amères et d’enregistrement sous-optimal. (A) Exemple de trace de pointes spontanées. Les pointes proviennent d’un neurone sensible à l’amertume (points rouges) et d’un neurone sensible au sucre (points verts) dans un sensillum I1. Dans le dessin du sensillum, les neurones amers, sucrés et mécanosensoriels sont colorés respectivement en rouge, vert et noir. (B) Exemple de trace de la réponse du neurone amer (points rouges) dans un sensillum S5 à la vapeur de 1 mM de DEET. Notez que les petits pics d’amplitude proviennent du neurone à sucre et des neurones mécanosensoriels, qui dans cet exemple sont difficiles à distinguer par amplitude. Abréviation : DEET = N,N-diéthyl-méta-toluamide. (C) Exemple de trace des réponses ON et OFF d’un neurone amer dans la sensille I1 à 1 mM de benzoate de dénatonium. Des pics sont observés avant (déclenchement spontané), pendant (réponse ON) et après le contact (réponse OFF) avec le stimulus. Abréviation : DEN = benzoate de dénatonium. (D) Exemple de trace des réponses ON et OFF d’un neurone amer dans la sensille I1 de D. virilis à 0,5 mM de chlorure de berbérine. Des pointes sont observées avant, pendant et après le contact. Abréviation : BER = chlorure de berbérine. (E) Exemple de trace d’un enregistrement sous-optimal. Le contact a été perdu au milieu de l’expérience en raison du mouvement du labelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans les enregistrements de certains types de sensilles, il peut être difficile de différencier les pointes de différents neurones. Par exemple, les neurones à sucre et les neurones mécanosensoriels des sensilles S et I produisent des pointes d’amplitudes similaires, ce qui rend difficile leur distinction 4,14. Nous constatons que l’utilisation d’une électrode d’enregistrement en tungstène très tranchante réduit l’activation du neurone mécanosensoriel, tout comme le placement judicieux de l’électrode d’enregistrement. L’insertion de l’électrode d’enregistrement dans le collier de la cavité sensillique (c’est-à-dire dans la base mais pas en profondeur) entraîne souvent une réduction de la stimulation mécanosensorielle. De plus, nous constatons que si un enregistrement a un niveau élevé de décharge du neurone mécanosensoriel, le retrait de l’électrode enregistreuse et son placement dans une position différente par rapport au sensillum conduit souvent à un niveau de décharge plus faible.

Assurer la stabilité de l’électrode d’enregistrement tout au long des expériences est un autre problème critique (voir Figure 4E). Les perturbations mécaniques ou les décalages de la position des électrodes peuvent nuire à la qualité des enregistrements. Il est essentiel d’investir du temps et des efforts dans une préparation minutieuse, comme spécifié dans le protocole décrit ci-dessus, pour prévenir la frustration qui peut résulter du mouvement du labelle.

Nous notons un autre problème que nous avons observé avec certains composés qui produisent à la fois des réponses ON et OFF à partir de la sensille I de la classe I-a14. Parfois, une deuxième livraison d’un stimulus provoque la réponse OFF mais pas la réponse ON. La raison de cette réduction de la réponse à l’Ontario est inconnue.

Un autre défi rencontré lors de l’enregistrement de base est que toutes les sensilles ne sont pas facilement accessibles pour l’enregistrement en raison de leur position sur le labelle. Sur les 31 sensilles labellaires, seules 26 sont pratiques à enregistrer, ce qui présente une limitation de la technique, comme illustré à la figure 3B. Cependant, en principe, ces sensilles (I8, I9, I10, L9 et S10) peuvent être rendues accessibles par rotation de la platine mécanique XY du microscope Olympus.

Enfin, nous soulignons l’importance d’investir des efforts dans la préparation des mouches. Une mouche bien préparée est beaucoup plus susceptible de produire des enregistrements fiables et de haute qualité tout au long de l’expérience. De plus, le saccharose peut être utilisé comme contrôle positif pour assurer la qualité de l’enregistrement ; Il suscite une réponse chez toutes les sensilles labellaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Zina Berman pour son soutien, Lisa Baik pour ses commentaires sur le manuscrit et les autres membres du laboratoire Carlson pour la discussion. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH K01 DC020145 à H.K.M.D ; et le NIH accorde les DC02174 R01, R01 DC04729 et R01 DC011697 à J.R.C.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MicroscopeOlympusBX51WIéquipé d’un objectif 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) et d’oculaires 10X.
Table antivibratoireTMC63-7590E
Micromanipulateurs motorisésHarvard Apparatus et Mä ; rzhä ; utilisateur MicromanipulateursMicromanipulateur Micromanipulateur PM 10 Micromanipulateur
manuel Mä ; rzhä ; utilisateur MicromanipulateursMM33 Micromanipulateur
Supports magnétiquesENCOModèle #625-0930
Référence et enregistrement Porte-électrodeOckenfels Syntech GmbH
Support capillaire en verre StimulusOckenfels Syntech GmbH
Sonde universelle asymétriqueOckenfels Syntech GmbH
CONTRÔLEUR D’ACQUISITION USB 4 CANAUX, IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
ContrôleurOckenfels Syntech GmbHCS 55
Ordinateur personnelDellVostroVérifiez la compatibilité avec le système d’acquisition numérique et le logiciel
Tige de tungstèneA-M SystemsCat#716000
Feuille d’aluminium et/ou cage de FaradayBlindage contre le bruit électromagnétique
Capillaires en verre borosilicatéWorld Precision Instruments1B100F-4
Extracteur de pipetteInstrument Sutter Modèle de la sociétéP-97 Extracteur de micropipette flamboyant/brun
Conseils pour les microchargeurs  ;EppendorfE5242956003
SeringueGénérique
Pinces
crocodiles Transformateurs de puissanceSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssemblé à partir de pointes de pipette P1000, de tubes en plastique flexible et de maille
PâtePince générique
Générique
Tube en plastiqueSaint GobainTygon S3&trade ; E-3603
Flacons de culture standardArchon ScientificVailles étroites en polystyrène de 1 oz, chacune avec 10 mL de milieu de glucose, préchargées avec des bouchons d’acétate de cellulose
Chlorure de berbérine (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# Référence 36542
piézoélectrique Contrôleurs de stimulus de stimulus Stéréomicroscope Olympus VMZ 1x-4x Pour la préparation des mouches p200 Pointes de pipette Générique 1 ml à modeler

Références

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