Le protocole démontre une méthode permettant de prélever séquentiellement du sang des veines portes et de la veine cave inférieure de souris afin d’évaluer la production et l’absorption des métabolites microbiens intestinaux.
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Article de méthode
Prélèvement sanguin séquentiel de la veine cave inférieure suivi d’une veine porte pour évaluer les métabolites microbiens intestinaux chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les produits microbiens intestinaux sont connus pour agir à la fois localement dans l’intestin et être absorbés dans la circulation, où leurs effets peuvent s’étendre à de nombreux systèmes d’organes distants. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont une classe de métabolites produits par les microbes intestinaux lors de la fermentation des fibres alimentaires non digestibles. Ils sont maintenant reconnus comme des contributeurs importants à la façon dont le microbiome intestinal influence les systèmes d’organes extra-intestinaux via l’intestin-poumon, l’intestin-cerveau et d’autres axes intestinaux de l’hôte. Les AGCC sont absorbés du côlon, à travers le tissu intestinal, dans la veine porte (PV). Ils passent ensuite par le foie et sont consommés dans divers organes tels que le cerveau, les muscles, le tissu adipeux et les poumons. Les AGCC sont plus facilement mesurés dans les matières fécales expulsées, mais des mesures plus précises ont été obtenues à partir du contenu fécal intra-colique. Ici, nous proposons que l’échantillonnage du PV et du plasma circulant systémique d’un seul sujet puisse être préférable pour étudier l’absorption, le transport et les niveaux systémiques des AGCC chez la souris. Nous présentons une nouvelle technique de prélèvement sanguin efficace à partir de la PV et de la veine cave inférieure (IVC) qui permet de collecter des volumes relativement importants de sang à partir des circulations portale et systémique. Ceci est accompli en ligaturant le PV, permettant ainsi la dilatation ou l’élargissement du PV lorsqu’il se remplit à partir des veines mésentériques qui s’y écoulent. En utilisant cette méthode, nous avons pu améliorer le taux de réussite du prélèvement ainsi que la quantité totale de sang collectée (jusqu’à 0,3 mL de VCI et 0,5 mL de PV).
Introduction
Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont une classe majeure de métabolites produits par le microbiote intestinal. Leurs rôles critiques dans l’interaction entre le microbiome intestinal et d’autres organes distants1 ont été soutenus par des recherches décrivant comment ils modulent l’inflammation, signalent par le biais de récepteurs dédiés et servent de substrats dans le métabolisme cellulaire 2,3,4,5. Des travaux récents de notre groupe ont suggéré que les AGCC sont des régulateurs inflammatoires clés in vivo du tonus immunitaire pulmonaire in vivo via l’axe intestin-poumon 6,7. D’autres rapports ont décrit leur influence fonctionnelle sur le métabolisme via l’axe intestin-cerveau 8,9. Dans l’ensemble, l’influence des AGCC sur la physiologie et la pathologie de l’hôte fait l’objet d’études actives et intenses par de nombreux groupes de recherche couvrant un large éventail de processus pathologiques.
L’acétate (C2), le propionate (C3) et le butyrate (C4) sont les principaux AGCC et sont générés par le microbiote intestinal par la fermentation de fibres alimentaires ingérables dans le cæcum et le gros intestin. Les trois AGCC peuvent également être obtenus directement à partir de l’alimentation, et seul l’acétate peut également être produit par des cellules de mammifères. Les AGCC sont absorbés dans le côlon et sont partiellement utilisés par les cellules épithéliales intestinales (comme source d’énergie, pour la modulation immunitaire des tissus locaux et pour soutenir le maintien de la barrière intestinale). Ils sont également transportés dans la veine porte via le système veineux mésentérique10. Le butyrate est principalement consommé par les épithéliums intestinaux, le propionate par le foie11,12, et l’acétate aurait agi sur les tissus musculaires et adipeux après avoir pénétré dans la circulation périphérique13,14.
Une évaluation complète de la production, de l’absorption et de l’activité fonctionnelle des AGCC nécessite une connaissance des niveaux d’AGCC dans la lumière du côlon, dans la circulation porte et le sang périphérique. Cela peut être accompli par prélèvement sanguin de la veine porte (PV) et de la circulation systémique simultanément ou séquentiellement chez le même animal. Étant donné que les AGCC sont volatils15, la mesure de leurs niveaux dans les boulettes fécales expulsées peut ne pas refléter avec précision les niveaux dans le côlon. De plus, par rapport aux mesures du contenu colique, le niveau d’AGCC présent dans le PV peut refléter plus précisément la somme nette des niveaux à l’état d’équilibre absorbés par l’hôte par rapport aux niveaux inégaux produits par le microbiome intestinal sur toute la longueur du côlon11. Ces niveaux d’AGCC PV peuvent donc être plus pertinents et appropriés pour étudier les effets des AGCC sur la physiologie et la pathologie de l’hôte au-delà des effets locaux dans l’intestin.
Pour effectuer la collecte coordonnée et quasi simultanée du sang circulant PV et systémique, le diaphragme doit rester intact afin de maintenir une circulation sanguine normale et de favoriser la respiration spontanée. Par conséquent, la veine cave inférieure (VCI) présente un site idéal pour obtenir du sang circulant systémiquement tout en collectant du sang PV. Ce sang IVC peut également être utilisé à d’autres fins, telles que la mesure des cytokines circulantes pour évaluer l’inflammation systémique.
À l’heure actuelle, seules quelques méthodes de prélèvement de sang à la fois dans la circulation systémique et dans la PV ont été signalées chez des rongeurs de plus grandetaille 16,17. Les méthodes conventionnelles, qui nécessitent la canulation des vaisseaux chez le rat, sont techniquement difficiles à réaliser chez la souris. De plus, la quantité maximale de sang recueillie par ces méthodes ne dépasse généralement pas 0,3 mL18.
Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode qui simplifie le processus de double prélèvement sanguin à partir d’une VCI de souris suivie d’une PV chez le même animal. La caractéristique unique de la méthode est la ligature du PV près du hile hépatique juste avant le prélèvement sanguin du PV. Cette approche permet d’élargir les dimensions de la PV, améliorant ainsi considérablement le taux de réussite et augmentant le volume sanguin maximal collectable jusqu’à 0,5 ml.
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Protocole
Toutes les étapes de cette procédure de non-survie ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco. Le sexe et la souche de souris utilisés étaient des souris C57BL/6J mâles (pesant de 25 à 35 g et âgées de 12 à 15 semaines). Des souches de souris femelles et/ou d’autres souches de souris standard peuvent également être utilisées.
1. Anesthésie
- Essuyez la moitié inférieure de l’abdomen de la souris avec des cotons-tiges à 70 % d’éthanol. Administrer l’anesthésie en administrant une injection intrapéritonéale de tribromoéthanol (250-400 mg/kg). L’anesthésie à la kétamine/xylazine ou à l’isoflurane peut également être utilisée. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir les lésions cornéennes.
- Injecter de la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour l’analgésie.
REMARQUE : La buprénorphine est nécessaire en raison de la douleur associée à la procédure de laparotomie.
2. Laparotomie
- Placez la souris anesthésiée sur la surface chirurgicale (avec un coussin chauffant en dessous) en position couchée. Fixez tous les membres de la souris sur la planche chirurgicale avec du ruban adhésif. Confirmez que la profondeur appropriée de l’anesthésie a été obtenue par pincement des orteils sans réflexe de retrait de la pédale.
- Soulevez la peau et faites une incision longitudinale avec des ciseaux de dissection le long de la ligne médiane de l’ombilic à l’apophyse xiphoïde et caudalement vers la base de l’abdomen (organe génital externe).
- Faites une incision similaire dans le péritoine avec des ciseaux à dissection sans perforer ou endommager les intestins, le diaphragme ou le foie.
- Élargissez le champ opératoire en faisant une incision transversale sur toute la longueur (en étendant la largeur de l’abdomen) avec des ciseaux des deux côtés de l’ombilic.
- Déplacez le gros intestin et l’intestin grêle vers le côté droit du chirurgien à l’aide d’une gaze propre imbibée de PBS chaud pour exposer la VCI en dessous.
3. Préparation de la ligature pour la PV
- Manipulez doucement les segments intestinaux à l’intérieur du champ opératoire à l’aide d’un coton-tige pour localiser le PV à la racine du mésentère.
- À l’aide d’un microscope de dissection pour visualiser les vaisseaux et autres structures abdominales, passez soigneusement une suture prolène 7-0 derrière le PV près du hile hépatique (entre la veine duodénale et la veine splénique)19 afin qu’elle soit prête pour la ligature à l’étape 5 (Figure 1).
REMARQUE : L’utilisation d’un microscope à partir de cette étape n’est pas obligatoire mais améliore considérablement le taux de réussite global de la procédure.
4. Prélèvement d’échantillons de sang à partir de l’IVC
- Insérez l’aiguille 28G 1/2 pouce d’une seringue d’insuline héparinée de 1 cc dans l’IVC. Prélever 0,2 à 0,3 mL d’échantillon de sang.
REMARQUE : Si trop de sang est prélevé à cette étape, cela entraînera une diminution des volumes de sang PV collectés à l’étape 5. - Laissez l’aiguille à l’intérieur de la VCI afin d’éviter les saignements qui se produiraient lors du retrait.
5. Prélèvement d’échantillons de sang à partir du PV
- Attachez doucement la ligature prolène 7-0 autour du PV ; le PV devrait se dilater et se dilater au fur et à mesure qu’il se remplit. Insérez l’aiguille 28G 1/2 pouce d’une autre seringue d’insuline héparinée de 1 cc dans le PV.
- Aspirez lentement pour recueillir jusqu’à 0,3 à 0,5 ml de sang du PV. Le PV peut s’effondrer, mais il devrait se redilater progressivement avec le remplissage de sang du système veineux mésentérique.
6. Stockage des échantillons
- Retirez les aiguilles de la VCI et de la PV après le prélèvement sanguin.
- Transférez les échantillons de sang des seringues dans des tubes Eppendorf héparinés de 1,5 mL et placez-les sur de la glace pour les transformer ultérieurement en plasma à des fins de stockage et d’analyse au besoin.
- Euthanasier la souris en utilisant une surdose d’anesthésique suivie d’une luxation cervicale (selon les directives approuvées par l’UCSF IACUC).
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Résultats
En utilisant la méthode décrite ci-dessus, nous pouvons collecter des échantillons de sang de l’IVC et de la PV de manière séquentielle chez la même souris avec un taux de réussite de plus de 95%. Les volumes moyens d’échantillons de sang prélevés sont de 0,25 mL pour la VC et de 0,35 mL pour la PV.
À l’aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), nous avons mesuré la concentration d’AGCC dans les matières fécales, le sang PV et le sang IVC et avons ...
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Discussion
Cet article décrit une méthode in vivo innovante pour la collecte quasi simultanée d’échantillons de sang séquentiellement à partir de l’IVC et du PV chez la même souris expérimentale. Cette méthode est utile pour mesurer les niveaux de produits générés par le microbiote intestinal, tels que les AGCC, qui transitent par la circulation portale. Le volume maximal moyen de sang pouvant être prélevé lors d’une procédure terminale chez la souris (pesant de 25 à 30 g) est d’environ 1 ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
AP est financé par une bourse R01 du NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM est financé par une bourse T32 du NIH et par une bourse Trainee/Staff Pilot du Centre Benioff de l’UCSF pour la médecine du microbiome.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 Tribromoéthanol, 97 % (Avertin) | Sigma Aldrich ; | T48402-25G | Agent anesthésique ; |
| Chlorhydrate de buprénorphine injectable 0,3 mg/mL | PAR Pharmaceutical ; | NDC 42023-179-05 | Agent analgésique |
| Pince à pansement | Miltex ; | 6-100 | Dissection ; |
| Pince Graefe | Roboz | RS-5136 | Dissection ; |
| Hepatin sodium 1000 USP units/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 | Échantillon de sang seringues/tubes héparinisation |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Ligature de veine porte |
| Ciseaux | F.S.T | 14058-11 | Dissection ; |
| Étudiant Halsted-Mosquito Hemostats | F.S.T ; | 91308-12 | Dissection ; |
| Ruban chirurgical ; | 3M Transpore | 1527-1 | Fixation des membres de souris |
| U-100 Seringue à insuline 28G1/2 | EXEL | 26027 | Prélèvement d’échantillons de sang ; |
Références
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Réimpressions et autorisations
