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Article de méthode

Un modèle d’anévrisme de l’aorte abdominale chez la souris par infiltration péri-adventice de chlorure de calcium et d’élastase

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DOI :

10.3791/66674

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2 août 2024

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1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Key Laboratory of Birth Defects and Related Diseases of Women and Children of MOE, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Second University Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente un protocole permettant d’établir un modèle d’anévrisme de l’aorte abdominale chez la souris à l’aide de chlorure de calcium et d’élastase, combinant les avantages des méthodes de modélisation précédentes. Ce modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux anévrismes de l’aorte abdominale.

Résumé

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une maladie potentiellement mortelle associée à des taux de mortalité élevés. Elle se caractérise par la dilatation permanente de l’aorte abdominale avec une augmentation d’au moins 50% du diamètre artériel. Divers modèles animaux d’AAA ont été introduits pour imiter les changements physiopathologiques et étudier les mécanismes sous-jacents de l’AAA. Parmi ces modèles, les modèles AAA induits par le chlorure de calcium (CaCl2) et l’élastase sont couramment utilisés chez la souris. Cependant, ces méthodes ont certaines limites. La perfusion intraluminale traditionnelle d’élastase pancréatique pancréatique porcine (EPI) est associée à une difficulté technique élevée et à un taux de rupture élevé, tandis que l’administration péri-adventice d’EPI donne des résultats incohérents. De plus, le modèle AAA induit par CaCl2 ne présente pas de caractéristiques AAA humaines, telles que l’athérothrombose et la rupture d’anévrisme. Par conséquent, l’application combinée de CaCl2 et d’EPI a été proposée comme approche pour améliorer les taux de réussite et induire de plus grandes augmentations de diamètre dans les modèles animaux AAA. Ce manuscrit présente un protocole complet pour l’établissement d’un modèle d’AAA chez la souris par infiltration périaortique d’EPI et de CaCl2 dans le segment infrarénal de l’aorte abdominale. En suivant ce protocole, nous pouvons atteindre un taux de formation AAA d’environ 90% avec une simplicité technique et une reproductibilité. D’autres expériences échographiques et histologiques confirment que ce modèle reproduit efficacement les changements morphologiques et pathologiques observés dans l’AAA humain.

Introduction

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est défini comme une augmentation du diamètre de plus de 50 % ou un diamètre aortique maximal supérieur à 3 cm dans l’aorte abdominale. Cette condition représente une menace importante pour la vie, avec un taux de mortalité d’environ 90% lors de la rupture d’un anévrisme 1,2,3. À l’heure actuelle, la réparation chirurgicale ouverte et la réparation endovasculaire de l’aorte (EVAR) sont les seules interventions disponibles pour les patients atteints d’AAA 4,5,6. Cependant, il n’y a pas suffisamment de preuves pour soutenir l’efficacité des traitements médicaux dans l’inhibition de la formation d’anévrisme ou le ralentissement du taux de croissance de l’aorte abdominale chez les patients qui n’ont pas d’indications chirurgicales7. Néanmoins, des traitements non spécifiques, y compris la surveillance persistante du diamètre maximal de l’anévrisme, le contrôle de la pression artérielle, le traitement antiplaquettaire et les statines, sont utilisés pour réduire autant que possible le risque de rupture soudaine de l’anévrisme et d’événements cardiovasculaires et neurologiques potentiels. Malgré cela, le rôle des médicaments antiplaquettaires et des statines dans la prévention de la rupture d’anévrisme reste controversé et nécessite des études plusapprofondies 5,7,8,9,10.

Un modèle animal stable d’AAA est essentiel pour étudier la pathogenèse de l’AAA, et de nombreuses méthodes ont été introduites pour établir un tel modèle 11,12,13. Actuellement, le chlorure de calcium (CaCl2), l’élastase, l’angiotensine II (Ang II), les xénogreffes et les modèles transgéniques sont utilisés pour établir des modèles AAA de rongeurs 11,12,13. Parmi ceux-ci, l’Ang II est le plus couramment utilisé chez la souris, tandis que le CaCl2 et l’élastase sont également largement utilisés chez la souris et le rat 11,12,13,14. Le modèle AAA induit par l’Ang II est le seul modèle animal capable d’induire une athérosclérose qui ressemble étroitement à la pathologie AAA humaine, qui est simple et reproductible et évite la nécessité d’une laparotomie 11,12,13. Cependant, contrairement aux modèles induits par CaCl2 ou l’élastase, le site des anévrismes induits par l’Ang II est incertain et fréquemment observé dans l’aorte descendante ou l’aorte abdominale surrénale, avec un risque accru de rupture 11,12,13,14. Le taux d’incidence des anévrismes du modèle AAA induit par l’Ang II chez les souris déficientes en gènes peut atteindre 100%, alors que seulement 39% des souris C57BL/6 ont développé des anévrismes, et le temps et le coût économique d’obtention de souris déficientes en gènes sont élevés13,15.

Initialement introduit par Gertz et al., CaCl2 a été utilisé pour induire la formation d’anévrisme dans l’artère carotide et plus tard modifié par Chiou et al. pour établir un modèle AAA chez la souris16,17. Cependant, malgré sa capacité à induire la dégradation des fibres élastiques, l’inflammation des vaisseaux et la dégradation de la matrice extracellulaire, le CaCl2 manque de plusieurs caractéristiques AAA humaines, notamment l’athérothrombose, le thrombus intraluminal (ILT) et la rupture de l’anévrisme12,18. De plus, le taux de formation et le pourcentage d’augmentation du diamètre de l’application périaortique de CaCl2 restent instables13,19. Le modèle initial de perfusion d’élastase pancréatique porcine (EPI) intraluminale pour induire l’AAA a été développé par Anidjar et al. en 1990, suivi par le rapport de Bhamidipati et al. sur l’infiltration péri-adventice de l’EPI dans un modèle murin20,21. De nos jours, la majorité des modèles animaux d’AAA induits par l’élastase utilisent le protocole de Bhamidipati en raison de sa faisabilité et de sa nature peu invasive. Cependant, il est important de noter que le taux d’incidence et le diamètre maximal de l’AAA peuvent varier et sont généralement inférieurs à la perfusion intra-aortique de l’EPI. De plus, les anévrismes induits par l’application périaortique d’élastase présentent une tendance à cicatriser spontanément 11,12,20,21,22,23.

Pour remédier à ces limites, Tanaka et al. ont proposé une approche combinée impliquant la perfusion intraluminale d’EPI et l’infiltration de CaCl2 pour établir un modèle AAA chez le rat, qui a donné des résultats satisfaisants24. De plus, Zhu et al. ont démontré que le modèle PPE + CaCl2 offre des avantages tels que des taux de survie plus élevés et des taux de formation d’anévrisme plus élevés par rapport au groupe PPE unique et au groupe PPE + BAPN25. Cette approche combinée présente également une bonne stabilité et reproductibilité. De plus, Bi et al. ont réussi à établir un modèle AAA de lapin via la combinaison du CaCl2 périaortique et de l’incubation de l’élastase. Le taux de dilatation moyen était de 65,3 % ± 8,9 % le jour 5, qui a encore augmenté à 86,5 % ± 28,7 % le jour 15 et a considérablement augmenté à 203,6 % ± 39,1 % le jour 3026. Cependant, il n’existe actuellement aucune littérature faisant état de l’induction de l’AAA chez les rongeurs en combinant l’application périaortique de CaCl2 et d’élastase.

Ce manuscrit présente un protocole standard pour l’établissement d’un modèle murin d’AAA par l’utilisation combinée du CaCl2 péri-adventice et de l’infiltration d’élastase. Les sections suivantes fournissent des procédures chirurgicales détaillées et présentent des résultats représentatifs du modèle murin AAA.

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Protocole

Le protocole d’expérimentation animale était conforme au Guide du National Institute of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Pub No. 86/23, 1985) et a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (numéro d’approbation 202311300012). Des souris mâles C57/B6J âgées de huit à dix semaines ont été utilisées pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation préopératoire

  1. Prélevez les animaux et nourrissez-les avec de l’eau propre dans des conditions standard (température 24 °C, humidité 40 % à 50 %, cycle lumière-obscurité de 12 h).
  2. Coupez un coton en bandes de 40 mm x 4 mm et stérilisez-le avec des ciseaux, des pinces et d’autres équipements chirurgicaux.
  3. Placez l’animal dans la chambre d’induction de l’appareil d’anesthésie et utilisez de l’isoflurane à 3 % à 3,5 % pour induire rapidement l’anesthésie (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement). De plus, prescrire du butorphanol (1 mg/kg, injection intramusculaire) comme analgésie préventive.
    1. Retirez la souris de la chambre lorsqu’elle ne répond plus à la stimulation de la douleur, puis placez un masque sur la souris et maintenez la profondeur de l’anesthésie avec 1 % à 1,5 % d’isoflurane. Surveillez la fréquence respiratoire et la profondeur toutes les 5 à 10 minutes.
  4. Placez la souris en position couchée sur le coussin chauffant, utilisez du ruban adhésif pour immobiliser les membres et appliquez une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse.
  5. Utilisez un rasoir électrique ou une lotion dépilatoire pour éliminer complètement les poils de la région abdominale, puis désinfectez cette zone avec des cotons-tiges imbibés de povidone iodé et d’éthanol dans un mouvement circulaire au moins trois fois.

2. Intervention chirurgicale

  1. Placez la souris sous un stéréomicroscope. À l’aide de ciseaux, faites une incision longitudinale d’environ 2 à 2,5 cm le long de la ligne médiane de l’abdomen.
  2. Entrez dans la cavité péritonéale par la ligne blanche (approche transabdominale), placez un écarteur pour exposer la cavité péritonéale et emballez les intestins et le côlon dans la moitié droite de l’abdomen à l’aide d’une gaze normale imbibée de solution saline.
  3. Effectuez une séparation brutale du tissu conjonctif et adipeux adjacent à l’aorte abdominale infrarénale et à la veine cave inférieure (VC) à l’aide de pinces et de cotons-tiges. Disséquez doucement l’aorte abdominale et exposez l’espace entre l’aorte abdominale et le grand psoas sus-jacent, comme indiqué précédemment25.
    1. Insérez les bandes de coton stérilisées dans cet espace, en faisant extrêmement attention de ne pas endommager l’artère lombaire ou la veine. Il n’est pas nécessaire d’isoler l’aorte abdominale de la VC.
  4. Imbibez la boule de coton avec 0,9 M de CaCl2 et placez-la sur l’adventice de l’aorte abdominale pendant 15 min. Utilisez de la gaze stérilisée pour couvrir la cavité abdominale pendant le processus d’infiltration.
  5. Retirez délicatement la boule de coton imbibée de CaCl2 et lavez le segment infiltré avec une solution saline à 0,9 %.
  6. Diluez l’élastase à 2 mg/mL (8 U/mL) avec du jjH2O. À l’aide d’une seringue à insuline, appliquez 50 μL d’élastase diluée sur le segment infrarénal de l’aorte abdominale et enroulez les bandes de coton pour couvrir l’aorte abdominale et la VCI. Utilisez de la gaze stérilisée pour couvrir la cavité abdominale pendant le processus d’infiltration. Dans le groupe placebo, utilisez une solution saline normale à 0,9 % pour remplacer le CaCl2 et l’EPI.
  7. 15 min plus tard, retirez délicatement la gaze et les bandes de coton. Remettez les intestins et le côlon dans leur position d’origine, couvrez l’aorte traitée avec le mésentère et humidifiez les intestins pour éviter l’adhérence.
  8. Fermez la couche musculaire et la peau séparément à l’aide d’une suture en polypropylène non résorbable 6-0. Désinfectez la zone chirurgicale avec de la povidone iodée et de l’éthanol.
  9. Placez la souris sur un coussin chauffant et surveillez son état respiratoire jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Noter la durée de l’opération et le nombre d’animaux de laboratoire. Prescrire du carprofène (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) comme analgésie postopératoire pendant au moins 3 jours après l’opération, selon les recommandations vétérinaires.

3. Examen échographique

  1. 21 jours après la chirurgie, effectuez une échographie pour évaluer le taux d’incidence de l’AAA.
  2. Anesthésie la souris (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement) et enlève les poils abdominaux comme décrit précédemment.
  3. Placez la souris sur le coussin chauffant de l’appareil à ultrasons pour rongeurs. Appliquez du couplant à ultrasons sur l’abdomen et mesurez le diamètre maximal de l’anévrisme et le diamètre du segment normal de l’aorte abdominale.
    1. Calculez le pourcentage accru de l’aorte abdominale infrarénale. Le critère de réussite de la formation de l’AAA est que le diamètre maximal de l’AAA a augmenté de 50 % ou plus par rapport au diamètre du segment normal de l’aorte abdominale infrarénale.
  4. Utilisez une serviette pour essuyer le couplant à ultrasons restant après l’examen et placez la souris sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.

4. Prélèvement de l’aorte abdominale et expériences pathologiques

  1. Sacrifier la souris par surdosage d’isoflurane le jour suivant l’échographie (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
  2. Ouvrez les cavités thoracique et abdominale et effectuez une perfusion avec 1x PBS à travers le ventricule gauche jusqu’à ce que les poumons et le foie deviennent blancs, en suivant la procédure décrite dans la littérature précédente27.
  3. Utilisez un pied à coulisse numérique pour mesurer le diamètre externe de l’aorte infrarénale. Prélever l’aorte abdominale infrarénale au microscope et stocker le récipient dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 à 48 h.
  4. Retirez le tissu conjonctif et adipeux entourant l’aorte abdominale. Incorporez l’aorte dans de la paraffine pour préparer des sections, en coupant les sections en tranches de 3 à 5 μm comme décrit précédemment18,28.
  5. Effectuer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), au trichrome de Masson et à l’élastique de Van Gieson (EVG) sur les tranches déparaffinisées à l’aide des kits de coloration respectifs selon les instructions du fabricant.
    1. Analysez la structure des vaisseaux et l’inflammation avec la coloration H&E, observez la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) et les fibres de collagène avec la coloration trichrome de Masson, et examinez les fibres élastiques avec la coloration EVG.

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Résultats

Dans cette étude, un total de 24 souris ont été incluses et assignées au hasard : 12 dans le groupe Sham et 12 dans le groupe PPE + CaCl2 , respectivement. Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes ± d’écarts-types, sauf indication contraire. La durée moyenne de l’opération était de 55,67 min ± 4,08 min. Il n’y a pas eu de décès peropératoires ni de ruptures d’anévrisme, et le taux de survie dans les 21 jours suivant la chirurgie était de 100 %. Aucune adhérence intestinale sévère ou complicati...

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Discussion

La recherche sur les mécanismes moléculaires de l’AAA nécessite un modèle animal stable. Par conséquent, de nombreux modèles animaux AAA ont été établis depuis son développement initial par Economou et al. dans les années 196029. Parmi ces modèles, le CaCl2 est fréquemment utilisé chez les rongeurs en raison de sa rentabilité, de sa simplicité technique et de sa reproductibilité fiable. Cependant, l’infiltration périvasculaire de CaCl2 s’est ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les Fondations nationales des sciences naturelles de Chine (n° 82300542, 81770471), le Programme des sciences et technologies du Sichuan (n° 2022YFS0359, 2019JDRC0104) et le Projet de recherche postdoctorale, Hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan (n° 2023HXBH108). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte, l’analyse et l’interprétation des données, ni dans la rédaction du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Machine d’anesthésieRWDR550
ButorphanolJiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd220608BP1ml : 1mg
C57BL / 6JGpt Souris mâlesGemPharmatechN000013
Chlorure de calciumSigma AldrichC4901100 g
CarprofèneMCEHY-B1227100 mg
Chow DietDossy Animaux Expérimentaux Co.Ltd
Pied à Coulisse NumériquePlus VertIP54
ÉthanolJinhe Pharmaceutique Co.Ltd53968275 %/500 mL
EVG Kit de colorationSolarbioG1597
GraphPad PrismGraphpadVer 9.0.0
H& E Kit de colorationServicebioG1076
Seringue à insulineBD2143420
IsofluraneRWDR510-22-4100 mL
Kit de coloration MassonServicebioG1006
Saline normaleServicebioG4702500 mL
ParaformaldéhydeBiosharpBL539A4 %/500 mL
PBS, 1xServicebioG4202500 mL
Élastase pancréatique porcineSigma AldrichE1250100 mg
Povidine IodeYongan Pharmaceutique Co.Ltd5 %/100 mg
Prolene Polypropylène SutureEthicon LLC8709H
Rongeurs Système d’échographieFujifilmVevo 3100LT
StéréomicroscopeOlympusSZ61
de couplant à ultrasonsKepplerKL-250250 g
Huile

Références

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