Détection rapide d’agents pathogènes bactériens à l’origine d’infections des voies respiratoires inférieures grâce à une amplification isotherme médiée par boucle à base de puce microfluidique

Résumé

Divers agents pathogènes bactériens peuvent provoquer des infections des voies respiratoires et entraîner de graves problèmes de santé s’ils ne sont pas détectés avec précision et traités rapidement. La détection rapide et précise de ces agents pathogènes par amplification isotherme médiée par boucle permet une gestion et un contrôle efficaces des infections des voies respiratoires en milieu clinique.

Résumé

Les infections des voies respiratoires (IVR) sont parmi les problèmes les plus courants en milieu clinique. L’identification rapide et précise des agents pathogènes bactériens fournira des lignes directrices pratiques pour la gestion et le traitement des infections des voies respiratoires. Cette étude décrit une méthode permettant de détecter rapidement les agents pathogènes bactériens qui causent des infections des voies respiratoires par amplification isotherme médiée par boucle multicanal (LAMP). LAMP est un outil de diagnostic sensible et spécifique qui détecte rapidement les acides nucléiques bactériens avec une précision et une fiabilité élevées. La méthode proposée offre un avantage significatif par rapport aux méthodes traditionnelles de culture bactérienne, qui prennent du temps et nécessitent souvent une plus grande sensibilité pour détecter de faibles niveaux d’acides nucléiques bactériens. Cet article présente des résultats représentatifs de l’infection à K. pneumoniae et de ses multiples co-infections à l’aide de la LAMP pour détecter des échantillons (expectorations, liquide de lavage bronchique et liquide de lavage alvéolaire) des voies respiratoires inférieures. En résumé, la méthode LAMP multicanaux fournit un moyen rapide et efficace d’identifier un ou plusieurs agents pathogènes bactériens dans les échantillons cliniques, ce qui peut aider à prévenir la propagation des agents pathogènes bactériens et à faciliter le traitement approprié des infections des voies respiratoires.

Introduction

Les infections des voies respiratoires (IVR) causées par des agents pathogènes bactériens contribuent principalement à la morbidité et à la mortalité dans le monde¹. Il est défini comme tout symptôme des voies respiratoires supérieures ou inférieures accompagné d’une fièvre d’une durée de 2 à 3 jours. Bien que les infections des voies respiratoires supérieures soient plus fréquentes que les infections des voies respiratoires inférieures, les infections chroniques et récurrentes des voies respiratoires sont également des affections cliniques courantes, posant de grands risques pour les individus et imposant un fardeau important aux systèmes de santé². Les agents pathogènes bactériens courants des infections des voies respiratoires comprennent Streptococcus pneumoniae³, Haemophilus influenzae⁴, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia, entre autres. Ces bactéries pathogènes colonisent généralement les surfaces muqueuses du nasopharynx et des voies respiratoires supérieures de l’hôte, provoquant des symptômes typiques des infections des voies respiratoires telles que les maux de gorge et la bronchite. Ils provoquent une pneumonie lorsqu’ils se propagent des voies respiratoires supérieures aux zones stériles des voies respiratoires inférieures et peuvent se propager d’une personne à l’autre par les voies respiratoires⁵. Dans les cas graves, ils peuvent également entraîner des maladies bactériennes invasives, en particulier la pneumonie bactériémique, la méningite et la septicémie, qui sont les principales causes de morbidité et de mortalité chez les personnes de tous les groupes d’âge dans le monde.

Les tests traditionnels pour les infections respiratoires impliquent une culture microbiologique à l’aide d’écouvillons de gorge et d’échantillons respiratoires d’expectorations⁶. De plus, les tests sérologiques tels que le test immuno-enzymatique (ELISA) détectent des anticorps ou des antigènes dans le sérum, tandis que les tests d’agglutination observent la réaction d’agglutination des anticorps et des antigènes pour détecter l’infection⁷. La culture microbienne est considérée comme l’étalon-or pour diagnostiquer les infections des voies respiratoires, mais son faible taux de positivité des cultures, sa faible fiabilité et son long cycle de détection limitent l’efficacité du diagnostic⁸. En réalité, un diagnostic rapide et précis des infections respiratoires est crucial pour l’éradication précise de l’agent pathogène bactérien. Des méthodes de détection rapides et efficaces peuvent aider à réduire le taux de transmission des agents pathogènes, à raccourcir la durée de l’infection et à diminuer l’utilisation inutile d’antibiotiques ^9,10. Les méthodes basées sur la biologie moléculaire accélèrent considérablement la détection, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui amplifie la séquence d’ADN d’un gène cible pour détecter les agents pathogènes. Cependant, la PCR traditionnelle nécessite un équipement complexe de cyclage de température, ce qui est lourd et chronophage. De plus, chaque amplification d’ADN par PCR (à l’exception de la PCR en temps réel) se termine par une séparation électrophorétique du produit, ce qui prend également du temps. La visualisation du produit nécessite des colorants, dont beaucoup sont mutagènes ou cancérigènes. Par conséquent, il est impératif de développer en permanence de nouvelles méthodes et technologies pour diagnostiquer les agents pathogènes bactériens RTI.

L’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) est une technologie moléculaire nouvelle et émergente initialement développée par Notomi et al. en 2000¹¹. LAMP peut amplifier l’ADN dans des conditions isothermes stables sans équipement de cyclage de température complexe, ce qui le rend adapté à une détection rapide et réduit la complexité et le coût de l’équipement¹². LAMP peut détecter de faibles concentrations d’ADN cible avec une sensibilité élevée¹³. Il utilise plusieurs amorces spécifiques pour améliorer la sélectivité des séquences cibles et réduire la possibilité de faux positifs¹⁴. LAMP est progressivement largement utilisé dans les laboratoires cliniques en raison de sa facilité, de sa rapidité et de son fonctionnement intuitif, même pour la détection des RTI. Dans cette étude, nous avons examiné l’efficacité de la LAMP dans la détection des IVR plus faibles dans les échantillons cliniques (expectorations, liquide de lavage bronchique et liquide de lavage alvéolaire), comme le montre la figure 1. Il est évident que LAMP offre des avantages tels que la vitesse, la sensibilité et la facilité d’utilisation par rapport aux tests traditionnels en matière de détection à faible RTI, ce qui en fait une application prometteuse.

Figure 1 : Illustration schématique de la méthode de détection LAMP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

Tous les échantillons de cette étude ont été évalués et approuvés par le comité d’examen de l’éthique de l’hôpital populaire provincial du Guangdong (numéro d’approbation : KY2023-1114-01). Tous les participants ont signé un consentement éclairé écrit avant les expériences. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux. Les abréviations utilisées dans le protocole sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1.

1. Prélèvement d’échantillons cliniques dans les voies respiratoires inférieures

1. Collecte d’expectorations
   1. Nettoyez la cavité buccale et les dents avec de l’eau claire, en veillant à ce que la prothèse dentaire soit retirée, le cas échéant. Toussez vigoureusement pour expulser les expectorations respiratoires profondes dans un contenant d’expectoration (minimum 0,6 ml).
   2. Évitez la contamination par la salive ou les écoulements nasaux. Si la toux est difficile, administrer l’inhalation d’une solution de NaCl de 100 g/L à 45 °C pour faciliter l’expectoration. Transférez l’échantillon dans un récipient stérile et refermable.
      REMARQUE : Assurez-vous que les échantillons d’expectorations sont prélevés le matin et avant toute utilisation de médicament antibactérien.
2. Liquide de lavage bronchique (BLF)
   1. Insérez la tête collectrice dans la trachée à partir de la narine ou du site de la trachéotomie (environ 30 cm de profondeur). Injectez 5 ml de solution saline, établissez une pression négative, tournez la tête du collecteur et retirez-la lentement.
   2. Prélever le mucus extrait et rincer une fois le collecteur avec une solution d’échantillonnage (solution saline physiologique ou eau stérile pour injection). Vous pouvez également connecter un cathéter urinaire pédiatrique à une seringue de 50 ml en remplacement du prélèvement.
3. Liquide de lavage alvéolaire (ALF)
   1. Identifier l’emplacement de la lésion grâce à des examens d’imagerie thoracique. Sélectionnez la zone la plus importante ou la plus rapide pour le lavage.
   2. Injecter 1 à 2 ml de lidocaïne à 2 % dans le segment bronchique par le canal de biopsie pendant le lavage, en fournissant une anesthésie locale pour le segment pulmonaire lavé¹⁵. Pour les patients sous anesthésie générale intraveineuse qui présentent toujours de fortes réactions des voies respiratoires, injecter 1 à 2 ml de lidocaïne à 2 %.
   3. Après une anesthésie locale, insérez un bronchoscope à fibre optique par la bouche ou le nez, en passant par le pharynx dans la bronche du lobe moyen droit ou le segment lingual du poumon gauche. Placez son extrémité à l’ouverture de la branche bronchique et introduisez lentement une solution saline physiologique stérile.
   4. Administrer 30 à 50 ml de solution saline par séance, avec un volume de 100 à 250 ml (max. 300 ml). Recueillir le mucus extrait dans un récipient stérile scellé.

2. Extraction de l’ADN

1. En fonction de la viscosité des échantillons des voies respiratoires inférieures, ajoutez une quantité appropriée de 10 % de NaOH. Pour les échantillons à faible viscosité, ajoutez 2 à 3 fois le volume de l’échantillon de solution de liquéfaction. Pour les échantillons de viscosité modérée, ajoutez 5 à 6 fois le volume de l’échantillon de solution de liquéfaction. Pour les échantillons à viscosité élevée, ajoutez 8 à 10 fois le volume de l’échantillon de solution de liquéfaction.
   1. Ajustez le volume de 10% de NaOH en fonction de la viscosité de l’échantillon. Répartir les échantillons de la manière la plus uniforme possible à l’aide d’un mélangeur vortex pendant 15 s et incuber à 37 °C pendant 30 min pour la liquéfaction.
      REMARQUE : Pour des échantillons plus épais, augmentez le volume de NaOH ou prolongez le temps de liquéfaction. La qualité de liquéfaction des échantillons influence directement l’efficacité de l’extraction ultérieure. Idéalement, les échantillons liquéfiés doivent présenter une consistance constante et non collante.
2. Pipeter 1 mL de l’échantillon liquéfié dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Centrifuger à une vitesse de 15 777 × g pendant 5 min à 2-6 °C, puis utiliser une pipette pour retirer et jeter le surnageant.
   REMARQUE : Lors de l’aspiration de l’échantillon, évitez d’aspirer des impuretés du fond du tube ; S’il y a beaucoup d’impuretés, l’échantillon peut être centrifugé à 1 753-2 739 × g pendant 1 min avant l’aspiration.
3. Ajouter 1 mL de solution de lavage dans le tube de centrifugation et tourbillonner pour soulever le précipité du fond du tube. Il n’est pas nécessaire de le disperser complètement.
   1. Centrifugez la solution à 15 777 × g pendant 5 min, jetez le surnageant et essayez de ne pas toucher le précipité.
      REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer complètement la solution de lavage pour éviter d’affecter l’amplification ultérieure.
4. Ajouter 100 μL de solution d’extraction d’acide nucléique dans le tube à centrifuger. À l’aide d’une pipette, aspirez et mélangez bien le précipité. Transférez le liquide et précipitez ensemble dans un tube d’extraction d’acide nucléique. La composition de la solution d’extraction d’acide nucléique est présentée dans le tableau 1.
5. Placez les tubes d’extraction d’acide nucléique dans un mélangeur vortex et tourbillonnez à vitesse moyenne pendant au moins 5 min. Après le vortex, transférez les tubes d’extraction d’acides nucléiques dans un bain métallique à température constante et à une chaleur de 100 °C pendant 5 min.
6. Centrifuger à 15 777 × g à 2-6 °C pendant 5 min et réserver.
   REMARQUE : Si la réaction d’amplification de la PCR est effectuée dans les 24 heures, l’acide nucléique peut être stocké à 4 °C. Après l’amplification, stockez l’acide nucléique à -20 °C. Pour un stockage à long terme (au-delà de 24 h), stocker l’acide nucléique à -20 °C. Lorsque vous êtes à nouveau prêt à l’utiliser, décongelez l’échantillon naturellement, mélangez au vortex, chauffez-le dans un bain-marie à 95 °C pendant 5 min, centrifugez-le à 10 956 × g pendant 1 min et utilisez le surnageant pour l’amplification par PCR.

Solution	Composants	Nombre	Spécification
Solution de lavage	10 mM EDTA	1 bouteille	24 mL/bouteille
Réactif d’extraction d’acide nucléique	10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, conservateurs d’acides nucléiques	2 tubes	1,2 mL/bouteille
Tube d’extraction d’acide nucléique	Perles de verre	1 sac	24 bouteilles/sac

Tableau 1 : Composition du réactif d’extraction d’acide nucléique.

3. Amplification isotherme médiée par boucle et puce microfluide

1. Réactif et puce microfluidique
   1. Réaliser des réactions d’amplification isotherme sur une puce microfluidique en forme de disque (voir Tableau des matériaux). Effectuez l’amplification à température constante à 65 °C.
   2. Effectuez une analyse de fluorescence en temps réel à l’aide d’une méthode d’incorporation de colorant fluorescent¹⁴ sur l’analyseur d’acide nucléique à puce microfluidique à amplification à température constante. Observez une courbe d’amplification en forme de S pour les échantillons positifs à l’aide d’une polymérase avec fonctionnalité de déplacement de brin.
2. Amplification isotherme médiée par boucle
   1. Ciblez six régions de séquence avec quatre amorces spécifiques, dont deux amorces internes et deux amorces externes (fournies avec le kit LAMP).
      REMARQUE : L’ADN est répliqué et amplifié en continu à une température constante à l’aide d’une ADN polymérase avec fonction de déplacement de brin. Le processus de réaction implique l’étape de synthèse de matrice en forme d’haltère, l’étape d’amplification cyclique, l’étape d’allongement et l’étape de recyclage, formant finalement un mélange de fragments d’ADN avec des structures en forme de tige et de chou-fleur. Reportez-vous aux instructions de la trousse pour obtenir des renseignements détaillés (Fichier supplémentaire 1).
   2. Ajoutez des amorces à deux boucles au système réactionnel pour améliorer l’efficacité de la réaction, qui se lie aux structures de la boucle de tige, initiant la synthèse par déplacement de brin et la réplication cyclique. La composition du kit de détection des acides nucléiques pour les agents pathogènes des voies respiratoires est présentée dans le tableau 2.
      REMARQUE : Le kit de réactifs utilise la méthode LAMP. Le principe est basé sur l’équilibre dynamique de l’ADN à environ 65 °C, où toute amorce s’étendant par appariement de bases au site complémentaire de l’ADN double brin provoque la dissociation de l’autre brin, formant un seul brin.
3. Puce microfluidique
   REMARQUE : Chaque puce microfluidique (voir le tableau des matériaux) est équipée de 24 puits de réaction numérotés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, l’entrée et la sortie du puits 1 correspondant au puits de réaction 1 (Figure 2). Un ensemble spécifique d’amorces pour l’amplification et la détection d’une séquence cible d’acide nucléique particulière est intégré et fixé dans chaque puits de réaction.
   1. Mélangez l’ADN de l’échantillon avec le réactif d’amplification. Injecter le mélange dans la puce et le distribuer dans chaque centrifugeuse à 1 000 × g pendant 30 s à température ambiante.
      REMARQUE : Des réactions d’amplification isotherme indépendantes et une détection de fluorescence en temps réel coexistent dans chaque puits de réaction sur la puce. Si une courbe d’amplification en forme de S est détectée dans un puits de réaction particulier, l’indice de détection correspondant pour ce puits est positif.

Composants	Composition	Nombre
Puce	Amorces	12 lieux
Film d’étanchéité	/	1 feuille
Réactif d’amplification isotherme	Colorant fluorescent, Enzyme	270 μL/tube
Contrôle positif	ADN génomique d’Escherichia coli	160 μL/tube

Tableau 2 : Composition du kit de détection des acides nucléiques pour les agents pathogènes des voies respiratoires.

Figure 2 : Schéma de la structure de la puce du disque. Les puits de réaction sont numérotés séquentiellement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, l’orifice d’entrée/sortie 1 correspondant au puits de réaction numéro 1. Les puits de réaction 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 et 24 sont des témoins négatifs. Bien réactionnelle 6 est un témoin positif (E. coli). Le puits de réaction 12 est un contrôle positif interne, et le puits de réaction 23 est un contrôle positif externe. Le puits de réaction 2 détecte spn. Réaction bien 3 détecte sau. Le puits de réaction 5 détecte le SARM. Le puits de réaction 8 détecte kpn. Le puits de réaction 9 détecte l’alcoolémie. La réaction bien 11 détecte aba. La réaction bien 14 détecte la sma. La réaction bien 15 détecte hin. Veuillez consulter le tableau 5 pour obtenir des détails sur les échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Préparation des échantillons et détection des bactéries

1. Préparer le système de réaction d’amplification isotherme
   1. Prenez le réactif d’amplification isotherme du kit et laissez-le décongeler complètement à température ambiante. Secouez doucement pour bien mélanger et centrifugez brièvement pour recueillir au fond du tube.
   2. Dans la zone de stockage et de préparation du réactif, pipeter 20 μL du réactif d’amplification isotherme dans un tube à centrifuger préparé de 200 μL. Couvrez le tube et déplacez-le vers la zone de préparation de l’échantillon à l’aide d’un tube à centrifuger par échantillon.
   3. Dans la zone de préparation de l’échantillon, ajoutez 34,5 μL de l’échantillon d’acide nucléique cible. Agitez doucement pour bien mélanger et centrifugez brièvement pour recueillir au fond du tube. Le volume total de chaque système de réaction d’amplification des acides nucléiques est de 54,5 μL (tableau 3).
2. Procédure de chargement des copeaux
   1. Sur l’emballage de la puce, étiquetez le numéro de l’échantillon. Ouvrez la puce microfluidique avec l’étiquette d’emballage vers le haut.
   2. Placez la puce avec les orifices d’entrée et de sortie vers le haut. À l’aide d’une pipette, prélevez 50 μL du système de réaction d’amplification préparé et ajoutez-le au canal principal de la puce par l’orifice d’entrée. Arrêtez d’ajouter lorsque le canal principal est rempli et essuyez rapidement tout excès de liquide autour des orifices d’entrée et de sortie avec un chiffon non pelucheux.
   3. À l’aide d’une pince à épiler, prélevez un film d’étanchéité et couvrez-le sur les orifices d’entrée et de sortie. Appuyez une pointe de pipette propre sur le film d’étanchéité dans une direction. Assurez-vous d’une étanchéité parfaite.
3. Réaction qPCR
   1. Une fois que la source lumineuse de l’analyseur d’acides nucléiques a terminé le préchauffage, cliquez sur le bouton Ouvrir le plateau . Placez la puce avec la face avant vers le haut sur le plateau, en veillant à ce que le petit cylindre de localisation émerge de l’espace central de la puce pour la fixer. Alignez le dispositif de positionnement central dans le plateau avec le grand trou central de la puce.
   2. Cliquez sur le bouton Fermer la barre d’état pour insérer la puce dans l’analyseur d’acides nucléiques.
   3. Dans la zone Informations sur l’échantillon de l’interface de détection, entrez les informations permettant de tester l’échantillon. Le numéro d’échantillon, le numéro de puce et le type d’échantillon sont obligatoires ; d’autres sont facultatifs.
   4. Cliquez sur le bouton Démarrer la détection dans la zone d’opération pour lancer la détection de l’échantillon. L’instrument effectuera des tests d’échantillonnage selon le programme prédéfini.
      REMARQUE : Une fois la détection terminée, le logiciel qui l’accompagne de l’appareil effectuera automatiquement l’analyse des données. Simultanément, l’analyseur d’acides nucléiques lancera un processus de refroidissement automatique. Une fois que la température descend à 37 °C, l’instrument ouvre automatiquement le plateau et éjecte la puce pour la récupération. Les résultats seront interprétés automatiquement par le système (Tableau 4).
4. Normes de contrôle de la qualité
   1. Un contrôle qualité positif et neuf contrôles qualité négatifs sont inclus dans chaque puce de ce kit de réactifs. Assurez-vous que les résultats de détection du contrôle qualité positif sont positifs et, simultanément, que les résultats des neuf contrôles qualité négatifs sont négatifs.
      REMARQUE : Les résultats sont affichés sur le côté droit de l’image indiquant « Résultats du contrôle de la qualité : Expérience normale (normale positive, normale négative) », indiquant que les résultats du test sont valides. Un nouveau test est nécessaire si un résultat est incorrect et que le résultat du test de l’échantillon est jugé invalide. Un contrôle interne positif utilisant des amorces spécifiques à l’homme est enfermé dans la puce, dont le résultat est positif pour les tests d’échantillons cliniques alors qu’il est négatif si l’échantillon a un faible contenu en ADN génomique humain, indiquant un nombre de cellules plus faible. Dans de tels cas, récupérez et analysez à nouveau les échantillons.
5. Analyse des résultats
   1. Une fois la détection terminée, utilisez la méthode du maximum de dérivée seconde combinée à des algorithmes protégés commercialement dans le logiciel pour calculer le premier point d’inflexion de la courbe d’amplification en forme de S pendant la phase d’amplification rapide. Les détails sont décrits dans la partie « Principes de l’essai » du Guide d’instructions de la trousse de détection des acides nucléiques des agents pathogènes respiratoires (fichier supplémentaire 1).
      REMARQUE : La valeur TP est la différence de temps entre le point d’inflexion et l’origine. Le résultat est interprété sur la base du TP et des valeurs de jugement positif. Si la valeur TP d’un indice de détection est inférieure ou égale à la valeur de jugement positif de cet indice, elle est interprétée comme positive. Si la valeur TP dépasse la valeur du jugement positif, elle est interprétée comme négative, selon les critères de « valeur de décision positive » dans les instructions. La « zone de la courbe de fluorescence » affiche la courbe normalisée, et la zone « Résultat de la détection » montre les résultats du contrôle de la qualité et de la détection pour chaque paramètre (Tableau 5).

Réactif	Volume (μl)
Réactif d’amplification isotherme	20
ADN matrice	34.5

Tableau 3 : Système de réaction d’amplification isotherme.

Pas	Un	Deux
Température (°C)	37	65
Temps (min)	3	47

Tableau 4 : Programme de réaction d’amplification des acides nucléiques.

Nom de l’indicateur	Valeur de contrôle positif
Streptococcus pneumoniae (sp)	30
Staphylococcus aureus (sau)	34
Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)	22
Klebsiella pneumoniae (kpn)	29
Pseudomonas aeruginosa (pae)	36
Acinetobacter baumannii (aba)	36
Stenotrophomonas maltophilia (sma)	27
Haemophilus influenzae (hin)	36

Tableau 5 : Valeur de contrôle positif pour l’indicateur d’infection.

Résultats

Cette expérience utilise la technologie d’amplification isotherme, en effectuant des réactions sur une puce de disque microfluidique. La réaction se produit sur un analyseur d’acide nucléique à puce microfluidique, en utilisant une méthode d’insertion de colorant de fluorescence. La réaction isotherme est réalisée à une température constante de 65 °C, et l’analyse de fluorescence en temps réel est effectuée simultanément. Les échantillons positifs subissent une amplification sous l’action de la polymérase avec une fonctionnalité de déplacement de chaîne, ce qui entraîne une courbe d’amplification en forme de S. Ce processus en une étape complète l’amplification et la détection du gène cible. Cette étude a sélectionné 7 échantillons avec des résultats expérimentaux différents pour démontrer la fiabilité du plan expérimental. La lettre majuscule S représente un échantillon. S1 est un échantillon infecté par une seule souche de K. pneumoniae. Les échantillons S2 à S7 sont des échantillons atteints d’infections polymicrobiennes, tous infectés par K. pneumoniae. Pour obtenir des résultats de détection efficaces, l’interprétation peut être faite à l’aide des courbes de fluorescence normalisées affichées dans les images. Un indicateur positif est représenté par une courbe d’amplification en forme de S, tandis qu’une ligne horizontale représente un indicateur négatif (Figure 3).

Figure 3 : Résultats représentatifs de l’amplification des acides nucléiques via LAMP. La lettre majuscule S signifie échantillon. S1 est un échantillon infecté par une seule souche de kpn. Les échantillons S2 à S7 sont des échantillons atteints d’infections polymicrobiennes, tous infectés par le kpn. S2 représente un échantillon infecté par kpn et sma. S3 désigne un échantillon infecté simultanément par kpn, sau et SARM. S4 signifie qu’il s’agit d’un échantillon infecté simultanément par kpn, sau, SARM et aba. S5 indique un échantillon infecté simultanément par kpn, sma, sau, SARM et aba. S6 désigne un échantillon infecté simultanément par kpn, sma, pae, sau, SARM et aba. S7 représente un échantillon infecté simultanément par kpn, sma, pae, sau, SARM, aba et E. coli. Veuillez consulter le tableau 5 pour obtenir des détails sur les échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce kit de réactifs utilise la méthode ROC pour calculer les valeurs seuils positives pour huit indicateurs de test. Lorsque la valeur TP d’un indicateur de détection est inférieure ou égale à sa valeur seuil positive correspondante, elle est interprétée comme positive. À l’inverse, lorsque la valeur TP d’un indicateur de détection est supérieure à sa valeur seuil positive, elle est interprétée comme négative. Les valeurs seuils positives pour chaque indicateur sont détaillées dans le tableau 5. Les valeurs de TP réellement positives que nous avons détectées pour les 7 échantillons avec des résultats expérimentaux différents sont présentées dans le tableau 6.

ÉCHANTILLON	KPN	Sma	PAE	Sau	SARM	hin	ABA	éco
	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)
S1	19.68 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S2	17.73 (+)	18.30 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S3	16.73 (+)	U (-)	U (-)	18.05 (+)	12.18 (+)	U (-)	U (-)	U (-)
S4	21.66 (+)	U (-)	U (-)	27.07 (+)	19.61 (+)	U (-)	18.29 (+)	U (-)
S5	16.16 (+)	20.85 (+)	U (-)	23.80 (+)	17.13 (+)	U (-)	15.22 (+)	U (-)
S6	11.20 (+)	16.79(+)	17.18(+)	23.09 (+)	16.14 (+)	U (-)	14.28 (+)	U (-)
S7	14.69 (+)	24.84(+)	19.70(+)	24.07(+)	14.16 (+)	- (+)	15.23 (+)	20.12 (+)
Chaque échantillon+/-, résultat qualitatif ; +, résultat positif ; -, résultat négatif.

Tableau 6 : Tableau des valeurs de TP pour la détection après infection.

Tableau supplémentaire 1 : Liste des abréviations. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1 : Instructions de la trousse de détection des acides nucléiques des agents pathogènes respiratoires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les infections des voies respiratoires sont des infections nosocomiales répandues, qui ont de graves conséquences sur les patients et font grimper les taux de mortalité¹⁶. L’identification rapide et précise des agents pathogènes potentiels, suivie d’antibiotiques efficaces, est la clé du succès du traitement et de l’amélioration du pronostic, en particulier compte tenu des limites inhérentes aux méthodes de culture traditionnelles¹⁷. Dans cette étude, nous avons utilisé une méthode basée sur LAMP pour déterminer une ou plusieurs infections afin une détection rapide et précise des infections des voies respiratoires. Ce système de détection rapide est établi en combinant la technologie LAMP avec la technologie microfluidique. L’acide nucléique des échantillons cliniques, tels que les expectorations, le BLF et l’ALF, peut être extrait rapidement. Ce matériau extrait facilite la détection rapide et précise des agents pathogènes bactériens, guidant les pratiques cliniques pour améliorer le contrôle et le traitement des infections des voies respiratoires.

Des études antérieures ont montré que, par rapport aux méthodes basées sur la culture et à la réaction en chaîne par polymérase, les résultats de la LAMP atteignaient une sensibilité de 100 %, une spécificité et aucune réaction croisée avec d’autres bactéries dans des cultures pures et des échantillons de sang¹⁸. Les tests LAMP peuvent également détecter les agents pathogènes directement à partir de fluides biologiques, tels que le sang, le liquide pleural et péritonéal et le liquide céphalo-rachidien¹⁹. Il a déjà été démontré que l’ADN exogène et les inhibiteurs peuvent réduire considérablement la sensibilité de la PCR, et pour les tests LAMP, la purification de l’ADN des échantillons cliniques n’est pas nécessaire²⁰. Cette technique utilise des gènes et des amorces de levure pendant le processus d’amplification pour évaluer la normalité de l’amplification, déterminant ainsi la qualification du contrôle de qualité externe. Des contrôles internes, utilisant des amorces de gènes humains, déterminent la normalité des processus d’échantillonnage, d’extraction des acides nucléiques et d’amplification. L’utilisation simultanée de contrôles internes et externes garantit la fiabilité des résultats. Dans le même temps, plusieurs puits de contrôle positifs et négatifs sont également mis en place, ce qui garantit grandement la précision du test. La puce microfluidique LAMP a des capacités similaires à celles de la qPCR pour détecter les échantillons cliniques. Il présente les caractéristiques d’une sensibilité élevée et d’une forte capacité de détection, fournissant une base fiable pour une détection clinique rapide et un traitement précis²¹. La culture microbienne prend de 3 à 5 jours, voire plus, et certains agents pathogènes, tels que Chlamydia pneumoniae et Legionella pneumophila, ne peuvent pas être cultivés. En revanche, LAMP détecte plusieurs agents pathogènes bactériens, même incultivables, en moins de 3 h, ce qui augmente considérablement la vitesse de détection.

Il peut également effectuer plusieurs détections. La puce microfluidique LAMP est divisée en différentes unités de réaction qui détectent plusieurs agents pathogènes en parallèle, garantissant l’indépendance de chaque réaction et la précision des résultats^22,23. Les données du Centre de surveillance antibactérienne du réseau chinois ont montré que la prévalence de K. pneumoniae se classait au premier rang des isolats bactériens provenant d’échantillons respiratoires en 2022¹⁵. Parmi les échantillons respiratoires collectés par l’hôpital populaire de la province du Guangdong en 2022, le taux de positivité de K. pneumoniae testé par le LAMP était de 18,6 %, ce qui est également l’une des bactéries les plus prévalences. Dans tous les échantillons positifs pour K. pneumoniae, 30,6 % étaient des infections causées uniquement par K. pneumoniae, et 29,7 % étaient des infections où K. pneumoniae coexistait avec d’autres espèces bactériennes. De plus, il y avait des infections triples (23,9 %) et des infections quadruples (10,5 %) impliquant une infection à K. pneumoniae, constituant la majorité des échantillons positifs à la KP, soit environ 95 %. Il y a eu très peu de cas d’infections quintuples et sextuples, et jusqu’à présent, les infections au-delà du sextuplé n’ont pas été détectées. Les résultats démontrent six scénarios représentatifs, chacun représentant les résultats de détection d’infections causées par K. pneumoniae seul ou coexistant avec 1 à 5 autres espèces bactériennes.

De plus, la technologie de puce LAMP utilisée dans cette étude peut également détecter la résistance bactérienne. Il détecte le SARM résistant à la méthicilline via le gène mecA . Lorsque les puits représentant Staphylococcus aureus et les puits représentant le gène mecA sont positifs, ils représentent une infection à la méthicilline-SARM. Les chercheurs explorent en permanence des méthodes permettant de détecter rapidement les agents pathogènes et les traits de résistance aux antibiotiques. Par exemple, une méthode de diagnostic rapide de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques est basée sur l’amplification en chaîne par polymérase quantitative (qPCR)²⁴. Une autre approche consiste à prédire rapidement la résistance multirésistante de K. pneumoniae grâce à l’analyse par apprentissage profond des spectres de diffusion Raman améliorée en surface (SERS)²⁵ et à une méthode de détection des gènes de K. pneumoniae et de la carbapénémase à l’aide des spectres SERS²⁶. De plus, il existe une méthode de classification et de prédiction pour différents profils de typage de séquences multilocus (MLST) des souches de K. pneumoniae basée sur l’analyse des spectres SERS²⁷. Nous développerons également par la suite une détection sensible et précise des gènes de K. pneumoniae et de la carbapénémase, avec des performances comparables à celles des méthodes cliniques de référence qui prennent du temps ou qui sont basées sur des instruments spécialisés coûteux. De plus, l’approche diagnostique idéale est rapide, précise, rentable et conviviale¹⁸. Une étude estimant le coût des réactifs pour les technologies de diagnostic actuelles a montré que les tests d’échantillons basés sur la technologie PCR coûtent jusqu’à 6,4-7,7 dollars, contre seulement 0,71-2 dollar pour la technologie LAMP²⁸.

La méthode d’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) multicanaux, bien qu’elle offre des avantages significatifs pour la détection rapide des agents pathogènes bactériens dans les infections des voies respiratoires, a ses limites. La sensibilité élevée du LAMP présente un risque de contamination croisée, où une contamination minimale de l’ADN peut conduire à des résultats faussement positifs²⁹ ; Par conséquent, des protocoles rigoureux de manipulation des échantillons et de procédure sont nécessaires pour atténuer ce risque. Malgré la simplicité de la méthode, l’interprétation des résultats nécessite une expertise et une expérience spécifiques pour éviter les erreurs d’interprétation ou de diagnostic, ce qui met l’accent sur la nécessité d’un personnel bien formé. La reconnaissance de ces limites est essentielle pour l’application efficace et le développement ultérieur de la méthode LAMP dans le domaine du diagnostic clinique. L’ensemble de la méthode LAMP combinée à une puce microfluidique permet de détecter rapidement et en parallèle divers pathogènes bactériens. Il présente les avantages d’une sensibilité élevée et d’une forte spécificité ainsi que les caractéristiques de faible coût, de rapidité et de commodité. Il montre une importance pratique considérable pour la prévention et le contrôle des infections respiratoires causées par des infections pathogènes en milieu clinique. La caractéristique importante du test LAMP proposé dans cette étude est qu’il est facile à maîtriser pour le personnel de laboratoire, ce qui est d’une grande aide pour les hôpitaux primaires, la prévention des maladies, les centres de contrôle et les services d’inspection et de quarantaine. En résumé, le système de puce microfluidique LAMP est un outil de détection puissant dans les laboratoires cliniques, qui peut résoudre les problèmes de dépenses élevées et de faible délai d’exécution dans le diagnostic clinique des infections et a des valeurs d’application importantes dans les environnements cliniques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur de bain (MK2000-2)	ALLSHENG		Fournir un environnement à température constante
Tête collectrice de liquide de lavage bronchique	TIANPINGHUACHANG	SEDA 20172081375	Collecte de liquide de lavage broncho-alvéolaire
Bronchoscope à fibre optique	OLYMPUS	SEDA 20153062703	Un bronchoscope flexible équipé d’une source lumineuse à fibre optique et d’une caméra, pour examiner visuellement les voies respiratoires et les structures à l’intérieur des poumons. Aide à la collecte du lavage broncho-alvéolaire
HR1500-B2	Haier	SEDA 20183541642	Enceinte de biosécurité
NAOH	MACKLIN	S817977	Échantillon visqueux liquéfié des voies respiratoires inférieures
Kit de détection d’acides nucléiques pour agents pathogènes des voies respiratoires	Capitalbio Technology	SEDA 20173401346	Tests d’infection
Réactif d’extraction d’acide nucléique	Capitalbio Technology	SEDA 20160034	pour l’ADN extraction
RTisochip-W	Capitalbio Technology	SEDA 20193220539	Amplification isotherme médiée par boucle
THERMO ST16R	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20180585	Centrifuger le liquide résiduel de la paroi du tube.
Mélangeur vortex VM-5005	JOANLAB		Pour le mélange de réactifs