Article de méthode

Imagerie en direct pour quantifier la radiosensibilité cellulaire dans les organoïdes tumoraux dérivés de patients

DOI :

10.3791/66680

⸱

5 avril 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous détaillons une approche simple d’imagerie en direct pour quantifier la sensibilité des organoïdes tumoraux dérivés de patients aux rayonnements ionisants.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radiothérapie (RT) est l’un des piliers de la prise en charge clinique moderne du cancer. Cependant, tous les types de cancer ne sont pas aussi sensibles à l’irradiation, souvent (mais pas toujours) en raison des différences dans la capacité des cellules malignes à réparer les dommages oxydatifs à l’ADN provoqués par les rayons ionisants. Les tests clonogéniques sont utilisés depuis des décennies pour évaluer la sensibilité des cellules cancéreuses en culture à l’irradiation ionisante, en grande partie parce que les cellules cancéreuses irradiées meurent souvent d’une manière retardée qui est difficile à quantifier avec des techniques assistées par cytométrie en flux à court terme ou par microscopie. Malheureusement, les tests clonogéniques ne peuvent pas être utilisés en tant que tels pour des modèles tumoraux plus complexes, tels que les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO). En effet, l’irradiation des PDTO établies n’interrompt pas nécessairement leur croissance en tant qu’unités multicellulaires, à moins que leur compartiment semblable à celui d’une tige ne soit complètement éradiqué. De plus, l’irradiation de suspensions unicellulaires dérivées de PDTO peut ne pas récapituler correctement la sensibilité des cellules malignes à la RT dans le contexte des PDTO établies. Ici, nous détaillons une adaptation des tests clonogéniques conventionnels qui implique l’exposition de PDTO établis à des rayonnements ionisants, suivie d’une dissociation unicellulaire, d’un replacage dans des conditions de culture appropriées et d’une imagerie en direct. Des cellules souches non irradiées (témoins) dérivées de PDTO reforment des PDTO en croissance avec une efficacité spécifique à PDTO, qui est négativement influencée par l’irradiation de manière dose-dépendante. Dans ces conditions, l’efficacité et le taux de croissance de la formation des PDTO peuvent être quantifiés comme une mesure de la radiosensibilité sur des images en accéléré collectées jusqu’à ce que les PDTO de contrôle atteignent une occupation d’espace prédéfinie.

Introduction

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La radiothérapie externe (RT) est l’un des piliers de l’oncologie moderne, reflétant non seulement une activité anticancéreuse prononcée associée à un spectre bien défini d’effets secondaires généralement gérables1, mais aussi une disponibilité clinique exceptionnellement répandue (la plupart des centres de cancérologie des pays développés sont équipés d’accélérateurs linéaires modernes pour la RT externe)2. Conformément à cette notion, la RT est utilisée avec succès à l’échelle mondiale à des fins curatives, généralement dans le contexte d’une maladie à un stade précoce 3,4, et pour des applications palliatives, pour contenir les symptômes (par exemple, la douleur) des tumeurs métastatiques5. Cela dit, toutes les tumeurs malignes ne sont pas également sensibles à la RT, ce qui reflète un certain nombre de caractéristiques intrinsèques aux cellules cancéreuses et aux microenvironnements 6,7,8,9. À titre d’exemple isolé, diverses altérations génétiques et épigénétiques associées au cancer influençant la réparation de l’ADN et l’homéostasie redox ont été associées à une augmentation ou à une diminution de la radiosensibilité intrinsèque, reflétant en grande partie la capacité de la RT à tuer les cellules cancéreuses en causant des dommages directs et dépendants des espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’ADN et à d’autres macromolécules 10,11,12,13.

Au cours des dernières décennies, des tests clonogéniques ont été couramment utilisés pour évaluer la radiosensibilité de cellules cancéreuses humaines et murines en culture 14,15,16. En effet, alors que les chimiothérapies et autres facteurs de stress tuent souvent les cellules malignes de manière assez rapide, la RT utilisée à des doses cliniquement pertinentes provoque le plus souvent une forme retardée de mort cellulaire qui ne peut pas être simplement quantifiée avec des techniques assistées par cytométrie en flux à court terme ou par microscopie, telles que la mesure de l’absorption cellulaire des colorants vitaux (qui colorent sélectivement les cellules mortes) 24 à 72 heures après l’exposition à un stimulus cytotoxique17. En plus d’être simples et de s’appuyer sur des réactifs plutôt peu coûteux, les tests clonogéniques ont été particulièrement pratiques car ils permettent la mise en œuvre du modèle dit « quadratique linéaire », qui est un outil mathématique assez simple pour l’analyse quantitative de la relation dose-réponse RT18,19. Dans le même ordre d’idées, les cellules cancéreuses en culture (y compris les lignées cellulaires établies ainsi que les cellules primaires dérivées de patients) ont fourni une plate-forme pratique pour tester divers aspects de la biologie du cancer, y compris (mais sans s’y limiter) la sensibilité au traitement d’une manière plutôt simple mais simplifiée, l’une des principales limitations étant l’absence d’un microenvironnement tumoral structuré (TME)20, 21. Aéroport de Lyna En effet, les cultures de cellules cancéreuses bidimensionnelles sont intrinsèquement incapables de récapituler les communications et les interactions cellule-cellule avec la matrice extracellulaire et telles qu’elles se produisent dans le cancer22,23. Les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO) sont apparus comme des modèles tumoraux qui contournent au moins en partie cette limitation 24,25,26.

Malheureusement, les tests clonogéniques conventionnels ne peuvent pas être utilisés pour évaluer la radiosensibilité des PDTO. D’une part, l’irradiation des PDTO établies ne compromet pas nécessairement leur croissance en tant qu’unité multicellulaire, à moins que leur compartiment souche - qui est responsable de la formation et de la maturation des PDTO mais présente une résistance accrue aux dommages à l’ADN par rapport aux cellules plus différenciées composant des PDTO27 - ne soit complètement éradiqué. D’autre part, l’irradiation de suspensions unicellulaires dérivées de PDTO peut ne pas récapituler correctement la radiosensibilité des cellules composées de PDTO (y compris les cellules de type souches) telle qu’elle se manifeste dans le contexte des PDTO formés. Ici, nous détaillons une technique qui exploite l’imagerie en direct des PDTO du cancer du sein pour surveiller l’efficacité de la formation de PDTO et le taux de croissance des cellules dérivées de PDTO précédemment exposées à l’irradiation ionisante par rapport à leurs homologues non irradiés. Les variations requises reflétant en grande partie la biologie différentielle des PDTO individuelles (par exemple, les besoins en milieux de culture, le taux de croissance), nous nous attendons à ce que ce protocole soit adapté à l’étude de la radiosensibilité dans un large panel de PTDO d’origine mammaire et non mammaire.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Culture d’organoïdes

REMARQUE : Les PDTO TNBC#1 ont été établies dans notre laboratoire sur la base d’un tissu tumoral retiré chirurgicalement d’une patiente atteinte d’un cancer du sein triple négatif (TNBC) qui a fourni un consentement éclairé pour participer à un protocole de biobanque (IRB21-06023682). Après validation par histologie et séquençage de l’ARN (RNAseq), les PDTO TNBC#1 sont cultivés en gouttes de matrigel à 66 % (appelées « dômes ») dans un milieu de culture DMEM/F12 enrichi (tableau 1) et passés toutes les 2-3 semaines selon un rapport de 1:2-1:1028.

  1. Implanter les PDTO selon un rapport de 1:2-1:10 environ 2 semaines avant l’irradiation dans des plaques séparées à 6 puits non adhérentes, une pour chaque dose de rayonnement testée (plus des témoins négatifs, qui seront fournis par les PDTO non exposés aux rayonnements ionisants).
  2. Ajouter 3 ml de milieu de culture DMEM/F12 frais enrichi aux PDTO tous les 3-4 jours.
    REMARQUE : Les conditions d’ensemencement et de culture peuvent nécessiter une certaine adaptation pour empêcher les PDTO d’acquérir une apparence très reconnaissable, en forme d’anneau, qui indique une nécrose du noyau au microscope et pour assurer une viabilité optimale à l’irradiation.

2. Rayonnement

  1. Les PDTO sont prêts pour l’irradiation une fois qu’ils atteignent la taille moyenne (environ 100 μm, comme déterminé provisoirement par la microscopie à champ clair avec une référence d’échelle) et l’occupation du dôme (environ 80 %). Adoptez les PDTO à ce stade pour éviter la surpopulation.
  2. Rayonnez les dômes contenant des PDTO à l’aide de l’irradiateur SARRP (ou d’un irradiateur alternatif pour les applications in vitro ou in vivo ) en mode champ ouvert (sans collimateur), en délivrant des doses uniques de 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy et 10 Gy. Les PDTO non irradiés offrent des conditions de contrôle négatif appropriées.
    REMARQUE : L’étalonnage des tests de dosimétrie doit être effectué avant chaque expérience pour s’assurer que les PDTO enfermés dans Matrigel reçoivent la dose de rayonnement prévue. Ces doses ont été choisies en fonction des évaluations préliminaires de la radiosensibilité des PDTO TNBC#1 et, par conséquent, peuvent nécessiter des ajustements pour d’autres PDTO.

3. La dissociation

  1. Immédiatement après l’irradiation, laver chaque dôme de matrigel contenant du PDTO avec 2 mL de milieu de culture DMEM/F12 enrichi et les remettre en suspension dans 1 à 3 mL de TrypL-E à l’aide d’une micropipette p1000. Répétez environ 30 fois pour chaque puits.
  2. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 mL et incuber pendant ~5 min dans un bain-marie à 37 °C.
  3. Granulez les cellules en les centrifugeant à 800 x g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Retirez l’excès de TrypL-E pour laisser ~1 mL dans le tube et ajoutez 3 fois le volume enzymatique d’origine (voir l’étape 3.1) de milieu enrichi en DMEM/F12 pour laver les cellules.
  5. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre à mailles de 40 μm. Cette étape permet de s’assurer qu’il ne reste pas d’amas de cellules au moment du placage et que chaque nouveau PDTO provient d’une seule cellule.
  6. Comptez les cellules dans un compteur de cellules automatisé lors de la coloration avec 10 % de bleu de trypan dans du PBS, et mettez-les en suspension pour obtenir 800 cellules dans 50 μL de milieu DMEM/F12 enrichi plus 66 % de matrigel à 4 °C (conditions pour 1 dôme).
  7. Plaquez chaque dôme dans un puits individuel à partir d’une plaque de culture de 48 puits compatible avec l’imagerie en direct tout en évitant la formation de bulles. Il est recommandé de tripler techniquement chaque dose de rayonnement.
  8. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 min pour solidifier le matrigel.
  9. Ajoutez 0,5 à 1 ml de milieu DMEM/F12 enrichi, éliminez les bulles potentielles et placez les plaques dans le système d’imagerie en direct à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire. Laissez la plaque s’équilibrer à la température réglée pendant environ 30 minutes avant d’imager.
    REMARQUE : Matrigel se solidifie à des températures de >4 °C, ce qui signifie que cette température doit être maintenue jusqu’à ce qu’une solidification soit nécessaire.

4. Imagerie en direct

  1. Sur le logiciel Incucyte, sélectionnez Planifier pour acquérir.
  2. Cliquez sur le signe plus dans le coin supérieur gauche de Lancer Ajouter un navire.
  3. Pour effectuer une analyse répétée ou une fois, sélectionnez Analyser selon un calendrier, puis cliquez sur Suivant.
  4. Pour créer ou restaurer un navire, sélectionnez Créer un nouveau navire, puis cliquez sur Suivant.
  5. Pour sélectionner le type de balayage, sélectionnez Organoïde, puis cliquez sur Suivant.
  6. Paramètres de numérisation : Choisissez QC < ' Phase + Couches d’image en fond clair. « Objectif 4x » est automatiquement sélectionné. Cliquez ensuite sur Suivant.
  7. Sélection du navire : Choisissez la plaque validée par logiciel appropriée en fonction du numéro de catalogue.
  8. Emplacement du navire : Sélectionnez l’emplacement de la plaque sur l’instrument en fonction de la disposition, puis cliquez sur Suivant.
  9. Modèle de balayage : Sélectionnez les puits en fonction de la disposition de la plaque, puis cliquez sur Suivant.
  10. Carnet de notes du navire : Plaque signalétique (facultatif : nom, type de cellule et passage). Créez une carte de plaque en cliquant sur le signe plus dans le coin supérieur droit de la disposition de la plaque, « Créer une carte de plaque ».
  11. Dans l’éditeur de carte de plaques, indiquez le type de cellule en cliquant sur l’icône Créer une nouvelle cellule dans la section Cellules , appliquez aux puits appropriés en cliquant sur l’icône plus et sélectionnez les puits appropriés. Facultatif : Le nombre de cellules et de passages ensemencés peut être indiqué. Répétez l’opération pour chaque lignée cellulaire.
  12. Indiquez le traitement en cliquant sur l’icône Créer une nouvelle cellule dans la section Conditions de croissance , appliquez aux puits appropriés en cliquant sur l’icône plus et sélectionnez les puits appropriés. Répétez l’opération pour chaque condition expérimentale. Ensuite, cliquez sur OK > Suivant.
  13. Configuration de l’analyse : l’option « Différer l’analyse à plus tard » est automatiquement sélectionnée ; cliquez sur Suivant.
  14. Calendrier de balayage : Choisissez de scanner deux fois par jour, indéfiniment. Cliquez sur Suivant. Surveillez l’obscurité des PDTO de contrôle pour obtenir un point final idéal, car ils ont tendance à s’effondrer lorsqu’ils sont envahis par la végétation.
  15. Résumé: Vérifiez le résumé et cliquez sur Ajouter au calendrier.
    REMARQUE : Les propriétés de numérisation peuvent être visualisées et la planification peut être modifiée si nécessaire en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la chronologie de la numérisation.

5. Analyse

  1. Sur le logiciel compatible, sélectionnez Afficher. Il peut également être commandé à partir d’un ordinateur connecté au système via l’intranet.
  2. Sélectionnez l’expérience souhaitée en double-cliquant dessus.
  3. Sélectionnez l’icône Lancer l’analyse .
  4. Sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse, puis cliquez sur Suivant.
  5. Type d’analyse : Sélectionnez Organoïde et cliquez sur Suivant.
  6. Canaux d’image : 'Phase + Fond clair' est sélectionné par défaut, cliquez sur 'Suivant'.
  7. Sélectionnez un ensemble d’images représentatives à analyser. Cliquez sur Suivant. Il est recommandé de choisir des moments précoces et tardifs et des conditions de traitement différentes, par exemple, un contrôle et différentes doses de rayonnement.
  8. Effectuez la définition de l’analyse pour TNBC#1 en suivant les étapes ci-dessous :
    1. Sur l’image : sélectionnez Aperçu actuel ou « Aperçu tout » pour visualiser le masque par défaut des images actuelles ou sélectionnées. Répétez l’opération lorsque les paramètres d’analyse sont modifiés pour mettre à jour le masque.
    2. Segmentation : définissez le rayon sur 300, la sensibilité d’arrière-plan sur 80, la division des bords sur ON et la sensibilité des bords sur 70.
    3. Nettoyage : réglez le remplissage des trous sur 5E+05 μm2 et ajustez la taille sur 0 pixels.
    4. Filtres: Définissez aucune surface minimale ou maximale, aucune excentricité minimale définie sur 0,19 et aucune excentricité maximale. Cliquez sur Suivant.
  9. Temps et puits de balayage : Sélectionnez tous les points et puits de temps de balayage souhaités. Cliquez sur Suivant. Facultatif : Sélectionnez Analyser les analyses futures.
  10. Enregistrer et appliquer la définition de l’analyse : Entrez le nom de la définition, puis cliquez sur Suivant.
  11. Visualisez le résumé et cliquez sur Terminer.
  12. Une fenêtre contextuelle s’affiche pour informer l’utilisateur que l’analyse est entrée dans la file d’attente d’analyse. Cliquez sur OK. Une fois la fenêtre File d’attente d’analyse ouverte, les tâches restantes peuvent être visualisées.
  13. Si nécessaire, récupérez l’analyse terminée dans View en sélectionnant la flèche bleue dans la colonne Analyses , à côté du nom du navire, et en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le nom de la définition de l’analyse. Ensuite, visualisez les données brutes sur le logiciel en cliquant sur Métriques d’analyse graphique, ou exportez-les pour une analyse plus approfondie en sélectionnant Exporter la définition de l’analyse.
    REMARQUE : L’exportation des données brutes peut être personnalisée dans la fenêtre Métriques d’analyse graphique . Le nombre d’organoïdes, la surface totale, l’excentricité moyenne et l’obscurité peuvent être exportés séparément, et les données peuvent être organisées dans le menu déroulant Sélectionner un regroupement en cliquant sur Aucun, Colonnes, Lignes ou Réplications de la carte de plaque. Pour TNBC#1, pour l’exportation de données brutes, les métriques d’analyse graphique et pour l’option déroulante Sélectionner un regroupement , l’option Aucun a été choisie. Ces paramètres d’importation ont été choisis sur la base d’évaluations préliminaires avec les PDTO TNBC#1. Ils peuvent donc nécessiter des ajustements pour d’autres PDTO, ce qui est possible sur le logiciel basé sur les fonctionnalités « Preview ». Nous recommandons d’adapter les paramètres d’importation sur (1) les premières images qui contiennent principalement des cellules uniques ou de petits PDTO, et (2) les images collectées à des moments tardifs pour s’assurer que les grands PDTO sont également acquis dans des conditions de contrôle et de traitement.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les PDTO TNBC#1 ont été exposés à une dose unique de rayonnement de 0 (témoins non irradiés), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy ou 10 Gy le jour 0. Immédiatement après, les PDTO ont été dissociés pour obtenir une suspension unicellulaire pour chaque condition expérimentale. Les cellules dérivées de PDTO ont ensuite été ensemencées dans des plaques de 48 puits à l’intérieur de dômes matrigels à 66 % (50 μL chacun) déposés au centre des puits, en 3 répétitions techniques par condition. Les plaques ont été placées dans un système d’imagerie en direct et imagées toutes les 6 h à l’aide de l’objectif 4X du module organoïde pendant un total de 30 jours. L’irradiation des PDTO TNBC#1 avec RT en une seule dose de 2 Gy a significativement retardé la repousse des PDTO, tandis que les doses de rayonnement ≥4 Gy (jusqu’à 10 Gy) ont empêché la régénération des PDTO en croissance (Figure 1).

figure-results-1
Figure 1 : Imagerie en direct d’organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO). Les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO) atteints de cancer du sein TNBC#1 ont été laissés non traités ou exposés à la dose de rayonnement indiquée, suivis peu de temps après par dissociation, replacage et imagerie avec un système d’imagerie de cellules vivantes. Des images représentatives après ajustement du contraste (A) et évaluations quantitatives (B, moyenne ± MEB) sont rapportées. Échelle de l’image : 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Barre d’échelle : 400 μm ; inserts : 200 μm. ****p < 0,001 (ANOVA à deux facteurs, par rapport à 0 Gy) ; ####p < 0,001 (ANOVA à deux facteurs, par rapport à 2 Gy). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ComposantConcentration
DMEM F/121 fois
GlutaMax1 fois
Hepes10 millions d’euros
PenStrep100 U/mL
B271 fois
Cna1,25 million d’euros
Nicotinamide10 millions d’euros
Inhibiteur du récepteur TGFbêta A83-010,5 μM
Inhibiteur de p38 MAP p38i SB2021901 μM
Caboche10%
Médias Rspondin10%
FGF1020 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (Heregulin)5 nM
Primocin100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Facteur de croissance épidermique hEGF5 ng/mL

Tableau 1 : Composition du milieu de culture PDTO.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons une adaptation des tests clonogènes conventionnels qui exploite les PDTO du cancer du sein et l’imagerie en direct pour quantifier la radiosensibilité des PDTO en fonction de (1) la persistance des cellules souches formant des PTDO lors de l’irradiation des PDTO in vitro, et (2) le taux de croissance des PDTO que ces cellules (peuvent) générer. Les étapes critiques de ce protocole comprennent (1) l’établissement de PDTO à une occupation du dôme permettant une bonne viabilité, (2) l’exposition PDTO à l’irradiation ionisante à différentes doses, y compris des conditions de contrôle irradié simulées ; (3) dissociation PDTO en cellules uniques ; (4) le replaquage de cellules uniques dérivées de PDTO ; et (5) l’imagerie en direct jusqu’à une occupation prédéfinie du dôme dans des conditions de contrôle.

Avec des modifications minimes, principalement liées à l’efficacité de formation des PDTO et au taux de croissance des PDTO dans des conditions de contrôle (qui sont susceptibles de varier considérablement entre les différents PDTO), nous nous attendons à ce que ce protocole soit adaptable à plusieurs plates-formes d’imagerie en direct disponibles dans le commerce, ainsi qu’à de nombreux PDTO, de dérivation mammaire et non mammaire. D’une part, l’efficacité de base de formation de PDTO lors de la dispersion d’une seule cellule devrait influencer le nombre de cellules uniques à réensemencer pour obtenir de nouvelles PDTO à une densité qui permet non seulement la quantification des PDTO basée sur l’image, mais aussi la croissance normale des PDTO non traitées. D’autre part, le taux de croissance des PDTO devrait affecter la durée de l’essai, car la fusion des PDTO adjacents doit être évitée pour préserver des capacités analytiques optimales. Ainsi, la détermination de l’efficacité de formation de PDTO et du taux de croissance de PDTO dans des conditions de contrôle pour chaque PDTO individuel est essentielle pour la mise en œuvre correcte de ce protocole.

Bien que cette méthode soit assez simple, elle présente certaines limites. Premièrement, un nombre excessivement faible de cellules formant des PDTO peut entraver la régénération des PDTO en croissance normale lors de la dissociation d’une seule cellule. En effet, alors que le passage régulier de PDTO peut être réalisé par une dissociation incomplète, les évaluations quantitatives, telles que proposées par ce protocole, reposent sur la génération d’une suspension unicellulaire (qui peut être confirmée visuellement lors du comptage). Deuxièmement, un taux de croissance excessivement lent peut prolonger considérablement la durée du test et potentiellement entraîner une estimation imprécise de la radiosensibilité. Il est en effet concevable qu’un temps de culture prolongé, comme celui requis pour que les PDTO à croissance lente atteignent une taille compatible avec les points finaux, puisse offrir des chances supplémentaires aux cellules formant des PDTO irradiées sublétalement de se remettre du stress et de restaurer des PDTO détectables (bien que à croissance lente). Enfin, la dissociation des PDTO peu de temps après l’irradiation devrait imposer un stress supplémentaire aux cellules formant des PDTO, ce qui pourrait augmenter la radiosensibilité en raison de l’altération des communications cellule-cellule dans les premières phases de récupération. Le fait de retarder la dissociation de 24 à 72 h peut fournir des informations sur la contribution relative des communications cellule-cellule préservées à la capacité des cellules formant PDTO à se remettre des dommages macromoléculaires imposés par la RT.

Alors que les plates-formes d’imagerie en direct offrent une méthode pratique pour surveiller la formation et la croissance de PDTO de manière longitudinale, les images d’un seul point final peuvent également être utilisées pour le même objectif. Dans ce cas, il faut veiller à ce que les PDTO adjacents ne fusionnent pas avant l’imagerie, et le taux de croissance peut être évalué en fonction de la taille des PDTO normalisée à la durée de l’essai.

À l’ère de la médecine personnalisée du cancer, l’évaluation de la sensibilité des tumeurs individuelles au traitement est de la plus haute importance car elle fournit des indices pour la conception de stratégies thérapeutiques individualisées avec une efficacité améliorée29. Le protocole décrit dans le présent document s’inscrit dans cette entreprise en fournissant une approche pratique pour estimer la sensibilité cellulaire des PDTO individuels aux rayonnements ionisants (seuls ou combinés à d’autres modalités thérapeutiques). Cela dit, il reste à déterminer si la mesure de la radiosensibilité des cellules cancéreuses à partir des PDTO permet de prédire avec précision la réponse des patients atteints de cancer à la RT focale. La corrélation entre la radiosensibilité de PDTO distincts et l’irradiation avec la réponse clinique à la RT de leurs donneurs respectifs fournira des informations importantes sur cette possibilité.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sans rapport avec ce travail, SCF détient ou a détenu des contrats de recherche avec Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai et Eli-Lilly, et a reçu des honoraires de consultant/conseiller de Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray et Nanobiotix. Sans lien avec ce travail, SD a reçu des honoraires de consultation de Lytix Biopharma, d’EMD Serono, d’Ono Pharmaceutical, de Genentech et de Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., et détient ou a conclu des contrats de recherche avec Lytix Biopharma, Nanobiotix et Boehringer-Ingelheim. Sans lien avec ce travail, LG détient ou a conclu des contrats de recherche avec Lytix Biopharma, Promontory et Onxeo, a reçu des honoraires de consultation et de consultation de Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom et la Fondation Luke Heller TECPR2, et détient des options d’achat d’actions Promontory.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Raymond Briones et Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, New York, NY, États-Unis) pour leur aide dans le développement de ce protocole. Ce travail a été soutenu par une subvention du Transformative Breast Cancer Consortium du US DoD BCRP (#W81XWH2120034, PI : Formenti).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
40 et micro ; m filtre à maillesThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellomètre Auto T4 Compteur de cellules à champ clairNexcelom
DMEM F/12Corning  ;12634-010
Facteur de croissance épidermique hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Microscope numérique à fluorescence inversée  ;Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech  ;100-19
GlutaMaxInvitrogen  ;
HepesInvitrogen  ;15630-080
Logiciel IncuCyte 2021Aversion Sartorius: 2021A
Incucyte SX1SartoriusSX1
Incucyte validé 48 puitsplaque Corning  ;3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich  ;A9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636
NogginAcheté à l’Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, États-Unis
Plaque à 6 puits non traitéeCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 Inhibiteur de MAP p38i SB202190Sigma Aldrich  ;S7067
PBSCorning  ;21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaAcheté auprès de l’Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, États-Unis
Plateforme de recherche sur le rayonnement des petits animaux (SARRP)  ;Xstrahl Ltd
Inhibiteur du récepteur TGFbêta A83-01Tocris2939
Bleu trypan Colorant (0,4 %)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061 Modèle

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
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