Article de méthode

Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

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DOI :

10.3791/66690

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21 juin 2024

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1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement de cellules endothéliales de souris à partir de pancréas entier.

Résumé

Le pancréas est un organe vital pour le maintien de l’équilibre métabolique dans le corps, en partie en raison de sa production d’hormones métaboliques telles que l’insuline et le glucagon, ainsi que d’enzymes digestives. Le pancréas est également un organe hautement vascularisé, une caractéristique facilitée par le réseau complexe de capillaires pancréatiques. Ce vaste réseau capillaire est composé de cellules endothéliales (CE) hautement fenestrées importantes pour le développement et la fonction du pancréas. En conséquence, le dysfonctionnement des CE peut contribuer à celui du pancréas dans des maladies comme le diabète et le cancer. Ainsi, la recherche sur la fonction des CE pancréatiques (pEC) est importante non seulement pour comprendre la biologie du pancréas, mais aussi pour développer ses pathologies. Les modèles murins sont des outils précieux pour étudier les maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, il n’y a pas eu de protocole établi avec suffisamment de détails décrits pour l’isolement des CEp de souris en raison de la population relativement petite de CE, et de l’abondance d’enzymes digestives potentiellement libérées par le tissu acineux qui peuvent entraîner des lésions cellulaires et, par conséquent, un faible rendement. Pour relever ces défis, nous avons conçu un protocole permettant d’enrichir et de récupérer les pEC de souris, en combinant une dissociation physique et chimique douce et une sélection médiée par les anticorps. Le protocole présenté ici fournit une méthode robuste pour extraire des CE intactes et viables de l’ensemble du pancréas de la souris. Ce protocole convient à plusieurs tests en aval et peut être appliqué à divers modèles de souris.

Introduction

Le pancréas, clé du contrôle métabolique et de l’homéostasie, est un organe hautement vascularisé. Le pancréas a à la fois des fonctions endocriniennes et exocrines, contrôlant la régulation de la glycémie et des enzymes digestives, respectivement. Ces deux compartiments sont reliés entre eux par le vaste réseau de vaisseaux sanguins pancréatiques, facilitant l’échange et le transport d’oxygène, d’hormones et d’enzymes. Ce réseau capillaire dense pénètre dans l’îlot de Langerhans, un groupe de cellules régulatrices d’hormones au sein du pancréas responsables de sa fonction endocrine, composé des cellules alpha (α) sécrétant du glucagon, des cellules bêta sécrétant de l’insuline (β) et des cellules delta sécrétant de la somatostatine (δ) 1,2. Bien que les îlots ne représentent que 1 à 2 % de la masse pancréatique, ils reçoivent 20 % du flux sanguin total3, ce qui souligne l’importance de la vascularisation des îlots. Les capillaires pancréatiques sont principalement constitués de cellules endothéliales (CE) hautement fenestrées, qui sont entourées de péricytes muraux. Ces CE capillaires jouent un rôle essentiel dans le développement, la maturation et la (dys)fonction des îlots et forment des interactions intimes avec diverses cellules endo- et exocrines4 (Figure 1).

Un dysfonctionnement endothélial a été observé dans le diabète de type 1 et de type 2, les affections les plus courantes causées par le dysfonctionnement des îlots pancréatiques 5,6. La densité microvasculaire et la morphologie des îlots peuvent être modifiées dans le diabète7. De plus, le cancer du pancréas, une tumeur très agressive qui peut également se manifester par le diabète, est caractérisé par une densité microvasculaire élevée avec une faible perfusion8. Étant donné les rôles structurels et fonctionnels essentiels des CE dans le tissu pancréatique normal et malade, il est pertinent d’étudier les CEP dans le développement, la physiologie et la pathologie afin de dévoiler les mécanismes qui régissent la santé ou les maladies.

De nombreux protocoles ont été développés pour l’isolement des CE à partir de différents tissus murins (par exemple, cerveau 9,10, poumon11, cœur12, foie13, muscles squelettiques14 et tissus adipeux15) et humains (par exemple, cerveau16, tissu adipeux viscéral17,18, nerfs périphériques19, poumon 20,21,22 et artère mésentérique 23) tissus. Ces protocoles impliquent généralement l’utilisation de digestions enzymatiques (par exemple, par la collagénase, la trypsine24, la dispase24,25 et la libérase26), suivies d’une étape d’enrichissement à base d’anticorps. De plus, ces protocoles ont tendance à reposer sur des durées prolongées de digestion dans de fortes concentrations d’enzymes avec une agitation vigoureuse à 37 °C (Tableau 1). En raison des caractéristiques uniques du pancréas, notamment le fait qu’il abrite une pléthore d’enzymes digestives endogènes, ces protocoles existants ne peuvent pas être directement appliqués pour isoler les pEC. Tout d’abord, la composition de la matrice extracellulaire (MEC) du pancréas est différente de celle des autres tissus. Bien que la collagénase soit couramment utilisée pour l’isolement de la CE, il existe plusieurs sous-types avec différentes capacités de dissociation spécifiques aux tissus, nécessitant ainsi une optimisation. Deuxièmement, et c’est crucial pour l’isolement de la pEC, la libération et l’activation d’enzymes endogènes pancréatiques peuvent entraver considérablement le processus d’isolement. À cette fin, des précautions doivent être prises pour minimiser la rupture des cellules acineuses exocrines (la principale source de zymogènes, de protéases et de RNase27), qui peuvent induire d’autres dommages cellulaires et entraîner une faible viabilité cellulaire et affecter globalement la récupération 27,28,29.

Pour relever ces défis, nous avons adapté les méthodes des protocoles d’isolement EC existants et établi un nouveau protocole adapté à l’isolement des CE à partir du pancréas de souris. Plus précisément, nous décrivons ici un flux de travail (Figure 2) utilisant la collagénase de type I (généralement mise en œuvre pour l’isolement de la CE pulmonaire), des températures de digestion plus basses et sans agitation (pour empêcher l’activation des zymogènes pancréatiques), et une supplémentation en DNase 30,31,32 (pour prévenir l’apoptose induite par l’ADN et améliorer la viabilité cellulaire, et un anticorps pour CD3133 (PECAM1, un marqueur pan-CE). Le protocole décrit produit des populations EC isolées du pancréas de souris qui peuvent être utilisées pour le profilage de l’expression génique et les dosages protéiques.

Protocole

L’isolement des tissus a été effectué selon le protocole d’étude approuvé #17010 par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Californie, États-Unis). Ici, nous utilisons Tie-2CreERT2 ; Ligne de souris Rosa26-TdTomato en fond C57BL/6 à l’âge de 8 à 12 semaines. Dans cette ligne, les CE sont marqués avec TdTomato lorsqu’ils sont induits avec du tamoxifène comme décrit précédemment34. Cependant, ce protocole peut être adapté à tous les âges de souris adultes avec des génotypes et des antécédents génétiques différents.

1. Prélèvement de tissus (temps estimé : 1-2 h)

REMARQUE : L’estimation du temps est de 15 min/animal, maximum recommandé de 3 animaux regroupés par échantillons de dissociation.

  1. Euthanasier les animaux par surdose de dioxyde de carbone (CO2), suivie d’une confirmation secondaire de la mort. Avant la dissection, vaporisez tout le corps avec de l’éthanol à 70 % (EtOH), désinfectant complètement la zone opératoire.
  2. Étirez et fixez les membres à l’aide d’épingles. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision médiane à travers la peau et le péritoine en partant de la région abdominale inférieure et en s’étendant vers la région thoracique.
  3. Exposez la cage thoracique en coupant à travers le diaphragme et soulevez la cage thoracique pour exposer le cœur.
  4. Insérez une aiguille (25G-30G) reliée à une seringue contenant du PBS stérile glacé, dans le ventricule gauche du cœur.
  5. Commencer la perfusion en injectant le PBS à travers le cœur à un débit de 5 à 10 mL/min. Arrêtez après l’injection de 10 ml, ou jusqu’à ce que le foie et les reins se décolorent.
  6. Après la perfusion, localisez le pancréas (sous l’estomac et attaché au duodénum)35 (Figure 3A) et retirez-le soigneusement à l’aide de ciseaux à dissection et d’une pince.
  7. Une fois isolé, transférez le pancréas dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de PBS glacé + 0,2 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine, et conservez-le sur de la glace (figure 3B).
    REMARQUE : Le pancréas d’un maximum de 3 souris peut être regroupé à cette étape et transféré dans 1 tube. Les échantillons peuvent être conservés sur glace pendant une durée maximale de 2 h.

2. Préparation de la collagénase (temps estimé : 15-30 min)

  1. Préparez les solutions et les tampons comme décrit ci-dessous.
    1. Solution de dissociation : Ajouter la collagénase de type I dans un tube de 50 mL jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+ ; voir le tableau des matériaux) et 0,001 U/mL de DNase I + 0,2 mg/mL d’inhibiteur de trypsine.
    2. Solution d’arrêt de la dissociation : Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x, sans Ca2+, Mg2+ ; idem pour tous les autres PBS dans ce protocole ; voir tableau des matériaux), 5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,001 U/mL de DNase I ou DMEM + 10 % de FBS + 0,001 MU/mL de DNase I.
    3. Tampon de lavage : Ajouter du PBS 1x, 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,001 U/mL de DNase I + 0,05 mg/mL d’inhibiteur de trypsine.
  2. Dissoudre complètement les tampons et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Réservez et gardez sur glace.

3. Digestion (temps estimé : 40 min-1 h)

  1. Retirez le pancréas du PBS glacé et placez-le sur une boîte de Pétri sur de la glace. Retirez soigneusement l’excès de tissu (p. ex. rate, graisse, débris) à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler (figure 3C).
    REMARQUE : Il est crucial d’éliminer les graisses, car l’excès de lipides peut interférer avec la digestion des tissus.
  2. Transférez le pancréas de souris paré dans un tube de 5 ml contenant 1 ml de solution de dissociation.
  3. Gardez le tube sur de la glace et émincez les tissus pancréatiques avec des ciseaux à dissection en petits morceaux pipetables, par exemple 0,5 mm ou 1 mm. Transférez le lysat dans un tube de 50 ml et conservez-le sur de la glace.
  4. Ajoutez du pancréas supplémentaire dans le tube de 5 ml utilisé pour émincer initialement le tissu pancréatique et ajoutez 1 ml de collagénase. Répétez l’opération au besoin pour plusieurs préparations de pancréas.
  5. Ajoutez 2 ml de solution de collagénase dans le tube de 5 ml pour éliminer tout tissu pancréatique résiduel et transférez dans un tube de 50 ml. Le volume total de collagénase doit être de 5 ml pour 3 pancréas ou de 3 ml pour un seul pancréas.
  6. Une fois que tous les échantillons ont subi une dissociation mécanique, transférez les tubes de 50 mL contenant les lysats tissulaires homogénéisés dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 10 min.
    REMARQUE : Ne pas agiter vigoureusement ou vortex le mélange de tissus pendant ce processus car cela peut provoquer la rupture des tissus acineux et la libération d’enzymes endogènes abondantes et d’ADN.
  7. Retirez les tubes du bain-marie et remuez doucement pour bien mélanger, et laissez-les dans le bain-marie pendant encore 10 min. (Temps total : 20 min).
    REMARQUE : Ne pas dépasser 30 min dans un bain-marie à 37 °C pour éviter une surdigestion.
  8. Placez les tubes sur de la glace et laissez l’homogénat se déposer par gravité. Une fois installé, transférez le surnageant à travers un filtre de 70 μm et ajoutez 5 mL de solution d’arrêt de dissociation.
  9. Ajoutez 1 ml supplémentaire de solution de dissociation à la pastille restante et triturquez avec une aiguille de 18 G.
  10. Passez l’homogénat restant dans le filtre et lavez-le avec 5 ml supplémentaires de solution d’arrêt de dissociation.
  11. Suspension à cellules de centrifugation à 300 x g pendant 10 min, à 4 °C. Éliminer complètement le surnageant par aspiration et maintenir la pastille cellulaire sur de la glace.
  12. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 1 mL de tampon de lavage et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  13. Prélever une petite aliquote de la pastille de cellules remises en suspension (10 μL) et mélanger avec du bleu de trypan dans un rapport de 1:1 pour compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et mesurer la viabilité.

4. Enrichissement des cellules endothéliales (CE) (temps estimé : 2-3 h)

  1. Ajouter 1 μL d’anticorps anti-CD31-biotine pour 1 x 107 cellules comptées et incuber pendant 30 min à 4 °C sur un rotateur (environ 5 μL pour 3 pancréas).
  2. Ajouter 20 μL de microbilles d’anti-biotine et incuber pendant 40 min à 4 °C sur un rotateur de tube.
  3. Installez un support magnétique avec le support de séparateur de colonne et appliquez la colonne. Équilibrez la colonne avec 3 mL de tampon de lavage.
  4. Ajouter l’échantillon dans la colonne et laver avec un total de 9 ml de tampon de lavage.
    REMARQUE : Si la concentration des cellules est élevée, diluez les cellules avec 2 ml supplémentaires de tampon de lavage dans un tube séparé. Ajouter 1 mL d’échantillon à la fois dans la colonne pour éviter que celle-ci ne se bouche.
  5. Retirer la colonne du support de colonne et la placer dans un tube de 15 ml. Ajouter 5 ml de tampon de lavage dans la colonne. Utilisez le piston pour enfoncer les cellules dans la colonne et recueillir l’élution (qui contient de l’EC enrichie).
  6. Rotation vers le bas et fraction élution/EC à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Comptez les cellules et mesurez la viabilité comme à l’étape 3.13.
  7. Validez l’enrichissement en EC par qPCR des fractions à flux continu et EC. Utilisez NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) comme marqueur général pour les cellules endocrines et la molécule d’adhésion des cellules plaquettaires et endothéliales (Pecam1) comme marqueur de EC33. Utiliser 36B4 (Rplp0, phosphoprotéine ribosomique acide p0) comme contrôle interne pour la normalisation de l’expression génique.
    REMARQUE : Les échantillons collectés peuvent être utilisés pour des analyses de protéines ou d’ARN à cette étape.

5. Culture des pEC

  1. Préparez le M199 medium. Supplément M199 à une concentration moyenne à une concentration finale de 20 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et de 0,1 % de pénicilline-streptomycine.
  2. Enduire une plaque de culture cellulaire de 60 mm de collagène de type I (1 mg/mL dans de l’acide acétique 0,1 M) et laisser reposer 30 min à température ambiante.
  3. Retirez le collagène de type I et rincez la plaque avec 1X PBS, deux fois. Ajouter 2 mL de milieu M199 préparé et placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur de culture cellulaire standard (5 % de CO2, 37 °C) pendant 5 min.
  4. Une fois les cellules isolées, ajoutez les cellules isolées dans la plaque de culture cellulaire M199 préchauffée. Conservez les cellules dans des conditions de culture pendant environ 14 jours et changez de milieu tous les 2-3 jours.

Résultats

En suivant ce protocole, environ 2 x 106 cellules vivantes peuvent être obtenues en regroupant 3 pancréas de souris et 750 000 cellules d’un seul pancréas de souris. Pour valider l’enrichissement de la CE, nous avons effectué les analyses suivantes : 1) PCR quantitative : par rapport aux échantillons à flux continu (FT) (c’est-à-dire les fractions non liées aux anticorps CD31), les fractions EC présentaient des niveaux significativement plus élevés de Pecam1 (codant pour CD31) et de Kdr (codant pour VEGFR2), deux gènesmarqueurs EC 33, et des niveaux plus faibles de NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), un facteur de transcription dans les cellules endocrines pancréatiques (Figure 4A); 2) Western blot : Des échantillons enrichis en EC provenant de trois préparations (pEC-1-3) ont montré de forts signaux de CD31 à la taille attendue (~130 kDa). En comparaison, les échantillons d’entrée et FT ont montré un signal CD31 minimal. En tant que contrôle positif, les lysats de cellules MS1, une lignée cellulaire pEC, ont également montré un fort signal CD31 (Figure 4B) ; 3) coloration au bleu de trypan : nous avons constaté que la viabilité des cellules isolées était d’environ 50 % (Figure 4C) ; 4) cytométrie en flux selon un protocole publié15 : grâce à un contrôle sur la population de cellules vivantes (Figure 4D), nous avons constaté que les cellules CD31+ étaient à 88 % et les cellules TdTomato+ à 76 %. Il est à noter que la majorité des cellules isolées co-expriment CD31 et TdTomato (Figure 4E). En tant que témoins négatifs, les cellules MS1 non colorées et MS1 incubées avec des IgG n’ont montré aucune cellule vivante marquée par CD31. En tant que témoin positif, c’est-à-dire les cellules MS1 colorées pour CD31, a montré près de 100 % de cellules CD31+ vivantes (Figure 4F). Nous avons également cultivé les cellules isolées, effectué une coloration par immunofluorescence de PECAM1 selon un protocole36 publié, et imagé TdTomato, qui a montré des signaux robustes des deux marqueurs dans les cellules isolées, suggérant la présence de CE (Figure 4G).

Diagramme du pancréas illustrant les CE intra-îlots pour l’étude de la structure vasculaire et l’analyse des interactions cellulaires.
Figure 1 : Illustration de la vascularisation du pancréas et des îlots pancréatiques. Une représentation graphique des cellules endothéliales pancréatiques (CE) et des cellules endothéliales intra-îlots. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Schéma de préparation du pancréas unicellulaire ; centrifugation, marquage CD31-biotine, analyse en flux continu.
Figure 2 : Vue d’ensemble du flux de travail. 1) dissection pancréasique, 2) digestion mécanique, 3) incubation enzymatique, 4) centrifugation, 5a) élimination des surnageants et 5b) digestion secondaire des granules cellulaires par collagénase avec trituration pour filtrer dans 6), 7) et 8) reconstitution des granulés et liaison des anticorps, 9) incubation des microbilles, 10) enrichissement de la colonne MACS, 11) comptage des cellules pour la viabilité et 12) analyse en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dissection tissulaire montrant le processus de récolte, d’isolement et de parage du pancréas dans la recherche biologique.
Figure 3 : Étapes de traitement des tissus. Images de (A) la cavité abdominale, (B) le pancréas isolé de la souris et (C) le pancréas de souris coupé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Expression génique, analyse CD31, DAPI, tri cellulaire, fluorescence et cytométrie en flux.
Figure 4 : Validation de fractions EC isolées du pancréas de souris. (A) qPCR d’échantillons FT et fraction EC enrichie en CD31 pour l’enrichissement. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) et Nkx6.1 (facteur de transcription spécifique des cellules β pancréatiques)33. * désigne p <0,05 par rapport à FT sur la base des tests t. n = 3-4 échantillons groupés, composés de 3 souris chacun. (B) Transfert Western de CD31. pEC-1-3 indiquent des CE enrichies à partir de 3 échantillons de souris regroupés distincts. Des lysats cellulaires de 30 mg ont été chargés sur chaque voie, suivis d’une coloration au Ponceau S. (C) Comptage cellulaire et coloration au bleu trypan des pEC enrichis pour l’essai de viabilité. (D) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour les pEC de souris colorées par l’anticorps 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et CD31. (E) Histogrammes de cytométrie en flux de MS1 non colorés (en haut à gauche), de MS1 colorés avec l’anticorps secondaire AlexaFluor-488 (contrôle IgG ; en haut à droite), de MS1 colorés avec CD31 (en bas à gauche) et des pEC de souris isolées colorées avec CD31 (en bas à droite). (F) Pourcentage de cellules vivantes quantifié à l’aide de la cytométrie en flux. (G) Immunofluorescence de l’expression de CD31 (vert) avec contre-coloration DAPI (bleu) et rapporteur fluorescent endogène TdTomato (rouge). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Microscopie d’immunofluorescence CD31/CD144/DAPI, analyse de l’expression génique UMAP de Cdh5, Pecam1.
Figure 5 : Spécificité des CD31 et CD144 dans le pancréas de souris. (A) Immunofluorescence du pancréas de souris avec CD31 (Magenta) et CD144 (Cyan), avec contre-coloration DAPI. Image capturée à l’aide d’un objectif 10x sous un microscope inversé fluorescent à grand champ. Barre d’échelle = 100 μm. Des lignes pointillées délimitent la zone de l’îlot. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) montrant l’expression de Cdh5 et Pecam1 dans les EC des îlots de Langerhans de souris C57BL6 détectées par scRNA-seq (GSE128565)37. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

EnzymeUtiliserTempérature et tempsRéférence
Collagénase IDissociation unicellulaire, enrichissement CE du pancréas entier37 °C, 20 minCe protocole
Collagénase IVIsolement des îlots et dissociation non enzymatique37 °C, 20 min46
Collagénase + TrypsineExamen des cellules canalaires dans le pancréas de souris37 °C, 30 min47
Collagénase BSuspension unicellulaire du pancréas37 °C, 30 min48
Collagénase NBIIsolation des îlots37 °C, 30 min49
Collagénase PSuspension viable Acinar37 °C, 15 min45
Collagénase XIIsolation des îlots37 °C, 15 min35
DispaseSuspension à cellule unique37 °C, 45 min24
LiberaseSuspension à cellule unique37 °C, 10 min25, 48
TrypsineDissociation unicellulaire, pancréas entier4 °C, H/N28

Tableau 1 : Résumé des différents protocoles utilisés pour traiter les échantillons de pancréas de souris.

Discussion

Dans cet article, nous présentons un protocole d’enrichissement et d’isolation des pEC. Semblable aux protocoles précédents d’isolement des CE à partir d’autres tissus ou organes, ce protocole se compose de trois processus principaux, à savoir la dissociation physique, la digestion enzymatique et l’enrichissement des CE à base d’anticorps. Pour relever les défis uniques du traitement du pancréas, nous avons introduit plusieurs adaptations clés et étapes critiques dans notre protocole : 1) une digestion douce en une étape de la collagénase avec un temps d’incubation court, 2) une supplémentation d’une concentration plus élevée de DNase et d’un inhibiteur de la trypsine pour minimiser la contamination de l’ADN et la digestion enzymatique endogène, ce qui peut interférer avec la liaison des anticorps et ainsi diminuer l’enrichissement et la viabilité de la CE et 3) compter les cellules après l’étape de digestion pour ajuster la façon dont beaucoup d’anticorps sont ajoutés à l’échantillon pour optimiser l’enrichissement en CE. Dans le processus d’optimisation de ce protocole, nous avons testé d’autres enzymes utilisées dans des études précédentes, par exemple la trypsine28, la collagénase de type IV31 et d’autres températures de digestion, par exemple 4 °C, ainsi que différents temps d’incubation (tableau 1). Nous avons constaté que la collagénase de type I, 20 min, à 37 °C était la condition optimale pour l’isolement de la pEC chez la souris et l’avons utilisée ici. Bien que l’ajout d’un anticoagulant pendant la perfusion puisse améliorer la viabilité cellulaire globale, un agent anticoagulant typique, par exemple l’EDTA ou l’héparine, peut interférer avec l’activité de certaines enzymes, par exemple, la collagénase pour la dissociation cellulaire et la transcriptase inverse utilisée dans la qPCR. Pour prévenir l’effet inattendu/indésirable de ces anticoagulants, on utilise du PBS (sans Ca2+ et Mg2+) pour la perfusion.

Nous nous sommes concentrés sur l’élaboration d’un protocole d’enrichissement de la population de CE à partir de pancréas de souris entières, qui inclurait à la fois des CE intra-îlots et des CE dans les tissus exocrines, ce qui entraînerait un rendement plus élevé. Dans le protocole actuel, nous avons regroupé 3 animaux lors de l’étape de dissociation et avons obtenu en moyenne une suspension unicellulaire avec environ 2,0 x 106 cellules viables. Nous avons également testé des échantillons de pancréas de souris et environ 750 000 cellules ont pu être obtenues. Il convient de noter que lors de l’ajustement au traitement d’un seul animal, une solution de dissociation moindre (3 mL de dissociation par pancréas) doit être utilisée. Une étape cruciale du protocole consiste à couper et à éliminer complètement toute graisse résiduelle attachée au pancréas (Figure 3B). La contamination du tissu adipeux dans la digestion de la collagénase interférera avec l’étape de dissociation de la cellule unique pancréatique, diminuant la viabilité cellulaire dans les étapes d’enrichissement ultérieures38. De plus, pour enrichir les pEC, nous avons utilisé un marqueur de surface pan-EC, PECAM1/CD31. En utilisant l’anticorps PECAM1/CD31, nous avons pu enrichir significativement les fractions EC, comme en témoigne l’analyse de l’expression génique. Dans le développement de ce protocole, nous avons également testé l’utilité de l’anticorps CD144, qui a également été couramment utilisé pour isoler lesCE13. Cependant, nous n’avons pas été en mesure d’enrichir les pEC (données non présentées). Curieusement, la coloration immunofluorescente a révélé que, alors que CD31 est exprimé dans toutes les CE du tissu pancréatique, l’anticorps CD144 semble ne colorer que les CE intra-îlots (Figure 5A). De plus, nous avons analysé les données de séquençage de l’ARN unicellulaire accessibles au public provenant d’îlots isolés de souris C57BL/6 (GSE128565)37 et avons constaté qu’environ 50 % des cellules centrales des îlots présentent l’expression de Cdh5 (VE-Cad) et de Pecam1, mais que le reste des cellules souches n’exprime que Cdh5 ou Pecam1 (figure 5B). Par conséquent, nous supposons que les anticorps CD31 sont plus appropriés pour l’isolement de la pEC et que l’utilité de l’anticorps CD144 à cette fin justifie des recherches futures. De plus, il existe des anti-CD31 conjugués à des billes magnétiques disponibles dans le commerce qui peuvent simplifier l’étape de liaison d’anticorps en deux étapes en une seule étape.

Comme démontré, nous avons effectué la qPCR, l’immunoblottage, la cytométrie en flux et la coloration immunofluorescente pour valider la fraction EC isolée. Il est concevable que ces fractions puissent être soumises à d’autres dosages, tels que le (sc)RNA-seq et la spectrométrie de masse. Une limite de ce protocole est que nous n’avons pas été en mesure de réaliser une sous-culture robuste et d’effectuer des tests fonctionnels. Étant donné que la sous-culture de CE de souris isolées s’est avérée difficile, il s’agit d’un domaine qui justifie des efforts futurs. Une façon de résoudre ce problème pourrait être l’introduction d’un grand antigène T, qui a été utilisé pour immortaliser les cellules primaires39.

Les progrès récents et l’application du séquençage de l’ARNc ont permis de profiler à haute résolution les cellules pancréatiques40 et en particulier les cellules des îlotspancréatiques 41. Cependant, la plupart des études existantes se sont concentrées sur les populations de cellules endocriniennes et ont utilisé des protocoles de dissociation tissulaire qui ne retiennent pas efficacement les CE. En conséquence, les fractions EC finissent souvent par se raréfier, ne constituant que 3 % à 5 % dans l’ensemble des populations cellulaires capturées 42,43,44. Un protocole récent utilise la digestion et la désactivation enzymatiques en deux étapes et une étape de tri cellulaire activée par fluorescence et récupère les CE à 12 % de l’ensemble de la population de cellules pancréatiques45. En complément de ce protocole, notre protocole fournit un flux de travail simplifié, qui peut être plus rentable et moins exigeant techniquement si les CE sont au centre de l’étude. Bien que ce protocole n’ait été testé que sur le pancréas de souris, il peut être étendu et adapté pour isoler les CE d’autres organismes, y compris le pancréas humain.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Brian Armstrong de City of Hope et Mindy Rodriguez de l’Université de Californie à Riverside pour leur assistance technique. Cette étude a été financée en partie par des subventions des NIH (R01 HL145170 à ZBC), de la Fondation Ella Fitzgerald (à ZBC), de City of Hope (Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award) et de la subvention EDU4-12772 de l’Institut de médecine régénérative de Californie (à AT). Les recherches rapportées dans cette publication comprenaient des travaux effectués dans le domaine de la microscopie optique et de l’imagerie numérique soutenus par le National Cancer Institute des NIH sous le numéro de bourse P30CA033572. Les figures 1 et 2 ont été réalisées avec BioRender.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
Antenne parabolique de 10 cmGenesee Scientific25-202
Aiguilles 25GBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher  ;
plaque 6 puitsGreiner Bio-One07-000-208
70 µ ; passoire mFisher22-363-548
Anti-CD31-biotineMiltenyi BiotechREA784
Sérum de bovin traité par choc thermique à l’albumineFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeuseEppendorf
Collagen Type 1, à partir de peau de veauSigma Aldrich& nbsp ;C9791Réactif d’attachement dans le protocole
Collagénase Type 1  ;Worthington BioLS004197
Countess Compteur de Cellules AutomatiqueThermo Fisher  ;
DAPIThermo Fisher  ;D1306immunofluorescence
Scalpels de sécurité jetablesMyco Instrumentation6008TR-10
DNAseRoche260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher  ;
EthanolFisherBP2818-4
Sérum fœtal bovinFisher
IncubateurMaintenu à 37 ° ; C 5 % CO2
LS ColonnesMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand avec le séparateur QuadroMACS  ;Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich  ;M2520-10X
Microbilles anti-biotineMiltenyi Biotech130-090-485
MicroscopeLeicaPour évaluer la morphologie cellulaire
Eau de qualité moléculaireCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
Nouveau-Brunswick Innova 44/44R Agitateur orbital  ;Eppendorf
PECAM1 (CD31) AnticorpsAbcamab56299immunofluorescence
PECAM1 (CD31) AnticorpsR& D SystemsAF3628
Saline tamponnée au phosphate (10X) (pas de Ca2+,pas de Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Souris avantIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Souris Revese  ;IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Souris avant  ;IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Souris inverséeIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Souris inversée  ;IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Souris avantIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Souris avantIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Souris inverseIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher  ;AM9780
Eau sans RNaseTakaraRR036B
Pince stérile 12" longueF.S.T91100-16
Pince fine stérileF.S.T11050-10
Ciseaux fins stérilesF.S.T14061-11
Boîtes de culture tissulaire 2cmGenesee Scientific25-260
Réactif TRIzolFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
inhibiteur de la trypsine  ;Roche10109886001
Tween-20
VE-Cadhérine AnticorpsAbcamab33168immunofluorescence
Bain d’eau
1428230014080055 10437028

Références

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